Name: pip-on-a-chip: a label-free study of protein-phosphoinositide interactions
Uploaded: 2017-07-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions at JoVE.com

دس و سيس، جزئيا، بمنحة AI053531 (نييد، نيه)؛ تم دعم سس و بسك بالمنحة N00014-14-1-0792 (أونر).

1. تنظيف كوفرسليبس الزجاج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الحل 7x تنظيف (انظر الجدول المواد ) 7 أضعاف مع الماء منزوع الأيونات في طبق زجاج البورسليكات العميقة 100 ملم مع أسفل مسطحة وتسخينه حتى 95 درجة مئوية على لوحة الساخنة مستوى لمدة 20 دقيق...

كل البديل بيب، وإن كان في تركيزات منخفضة، موجود على سطح عصاري خلوي من عضيات محددة حيث أنها تسهم في إنشاء تكوين البدني الفريد والخصوصية الوظيفية للغشاء العضوي 1 . واحدة من أهم استخدامات بيبس هو بمثابة منصة لرسو السفن محددة للعديد من البروتينات التي تتطلب ?...

عدد لا يحصى من التفاعلات والعمليات البيوكيميائية تجري على سطوح غشاء السائل ثنائي الأبعاد. العضيات المغلقة الغشاء في خلايا حقيقيات النواة هي فريدة من نوعها ليس فقط في العمليات البيوكيميائية والبروتيوم المرتبطة بها ولكن أيضا في تكوين الدهون. فئة استثنائية واحدة من الفوسفورية هي فوسفهوانوسيتيدس (بيبس). على الرغم من أنها تشكل 1٪ فقط من الدهون الدهنية الخلوية، فإنها تلعب دورا حاسما في التنبيه إشارة، أوتوفاجي، والغشاء الاتجار، من بين أمور أخرى 1 ، 2 ، 3 ، 4 . يؤدي الفسفرة الديناميكية لمجموعة رأس الإينوسيتول بواسطة كينازات بيب الخلوية إلى ظهور سبعة مجموعات رأسية بيب هي أحادية أو ثنائية أو تريس فوسفهوريلاتد 5 . بالإضافة إلى ذلك، بيبس تحديد الهوية تحت الخلوية من الأغشية وتكون بمثابة مواقع لرسو السفن المتخصصة لالبروتينات / الإنزيمات التي تحتوي على واحد أو أكثر من فوسفهوانوسعلى سبيل المثال، بليكسترين هومولوغي (ف)، فوكس هومولوغي (بس)، و إبسين N- محطة التماثل (إنث) 6 ، 7 . واحدة من أفضل المجالات درس الملزمة بيب هو فوسفهوليباز C (بلك) -δ1 ف المجال الذي يتفاعل على وجه التحديد مع فوسفاتيديلينوسيتول 4،5-بيسفوسفهات (بي (4،5) P 2 ) ضمن نانومولار منخفضة منخفضة تقارب مجموعة ميكرومولار 8 ، 9 ، 10 ، 11 . وقد تم تطوير مجموعة متنوعة من الطرق الكمية والكمية في المختبر واستخدامها لدراسة آلية، الديناميكا الحرارية، وخصوصية هذه التفاعلات. ومن بين المقايسات الأكثر شيوعا بين بيب الملزمة هي رنين بلاسمون السطحي (سبر)، و كالوريمتري متساوي الحرارة (إيتس)، و التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (نمر)، و فحص الطفو الليبوسومي / الترسيب، و شحم الدهون (شرائط الدهون / شرائط بيب)12 ، 13 . على الرغم من أن هذه تستخدم على نطاق واسع، لديهم جميعا العديد من العيوب. على سبيل المثال، سير، مركز التجارة الدولية، و نمر تتطلب كميات كبيرة من العينة، وأجهزة مكلفة، و / أو الموظفين المدربين 12 ، 13 . بعض أشكال فحص مثل الأجسام المضادة على أساس الدهون-بلوتس الاستفادة من أشكال قابلة للذوبان في الماء من بيبس وتقديمها بطريقة نفيسيولوجيكال 12 ، 14 ، 15 ، 16 . وبالإضافة إلى ذلك، لا يمكن أن تكون الكميات الدهنية كوانتيتاتد موثوق وأنها كثيرا ما أدت إلى ملاحظات إيجابية / سلبية كاذبة 12 ، 17 ، 18 . للتغلب على هذه التحديات وتحسين مجموعة الأدوات الحالية، تم إنشاء طريقة جديدة خالية من التسمية على أساس طبقة ثنائية الدهن المدعومة (سلب) في سياق آم<html> منصة إيكروفليديك، التي تم تطبيقها بنجاح لدراسة التفاعلات البروتين بيب ( الشكل 1 ) 19 . وتستند الاستراتيجية المستخدمة للكشف عن التفاعلات البروتين بيب على استشعار الرقم الهيدروجيني التشكيل. وهذا ينطوي على صبغ حساسية الرقم الهيدروجيني التي لديها أورثو -Sulfourhodamine B ( س سرب) مترافق مباشرة إلى فوسفاتيديليثانولامين رئيس مجموعة الدهون 20 . س سرب-بوب التحقيق ( الشكل 2A ) هو الفلورسنت للغاية في درجة الحموضة منخفضة ومطفأ في درجة الحموضة عالية مع يكا حوالي 6.7 ضمن 7.5 مول٪ بي (4،5) P 2 - تحتوي على سلبس ( الشكل 5B ). وقد تم استخدام بلك-δ1 نطاق ف على نطاق واسع للتحقق من صحة البروتين-بيب ملزم المنهجيات نظرا لخصوصيتها العالية بي (4،5) P 2 ( الشكل 5A ) 21 ، 22 ،&quot;&gt; 23 ، 24 ، 25 .Hence، نحن السبب في أن المجال بلك-δ1 ف يمكن أن تستخدم لاختبار ملزم ل بي (4،5) P 2 من خلال فحص بيب على رقاقة.و بناء المجال ف (P4.4)، وبالتالي يجذب أوه - أيونات ( الشكل 5C ) عند ربط بي (4،5) P 2 - تحتوي على سلبس، مجال ف يجلب أوه - أيونات إلى سطح الغشاء، والذي بدوره ينظم إمكانية بينية والتحولات الدولة بروتوناتيون من س SRB-البابا (الشكل 5C) 26. ووظيفة من تركيز نطاق PH، تطفأ مضان (الشكل 6A). وأخيرا، فإن البيانات تطبيع هو يصلح ل إيسوثرم ملزمة لتحديد تقارب من ف المجال بي (4،5) P 2 التفاعل ( الشكل 6B ، 6C ). &lt;/ P&gt; في هذه الدراسة، يتم توفير بروتوكول مفصل لأداء البروتين ملزم ل سلب التي تحتوي على بيب داخل منصة ميكروفلويديك. هذا البروتوكول يأخذ القارئ من تجميع جهاز ميكروفلويديك وإعداد حويصلة لتشكيل سلب والبروتين ملزمة. وبالإضافة إلى ذلك، يتم توفير الاتجاهات لتحليل البيانات لاستخراج المعلومات تقارب ل بلك-δ1 ف المجال بي (4،5) التفاعل P 2 .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1638">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Coverslip</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:997px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass Coverslips: Rectangles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544B</td>
			<td>22 x 40 x 0.16 - 0.19 mm, No. 1 1/2; Borosilicate Glass</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">7X Cleaning Solution</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>976670</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PYREX Crystallizing Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3140-190</td>
			<td>Borosilicate glass dish with a flat bottom; Diameter x Height (190 x 100 mm); Distributor: VWR (89090-700)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sentry Xpress 2.0</td>
			<td>Paragon Industries</td>
			<td>SC-2</td>
			<td>Kiln</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PDMS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning&#160;</td>
			<td>4019862</td>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS); Distributor: Ellsworth Adhesives</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PYREX Desiccator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89134-402</td>
			<td>Vacuum Rated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biopsy punch</td>
			<td>Harris</td>
			<td>15110-10</td>
			<td style="width:997px;">Harris Uni-Core; 1.0 mm diameter; Miltex Biopsy Punch with Plunger (Cat. No. 15110-10) can be used as an alternative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:997px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plasma Cleaning System</td>
			<td>PlasmaEtch</td>
			<td>PE25-JW</td>
			<td>2-stage Direct Drive Oil Vacuum Pump, O2 service (Krytox Charged)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Digital Hot Plate</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>H3760-H</td>
			<td>Purchased through Denville Scientific (Cat. No. 1005640)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Frosted Micro Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48312-003</td>
			<td>Frosted, Selected, and Precleaned; Made of Swiss Glass; Thickness: 1 mm; Dimensions: 75 x 25 mm; GR 144</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mold</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AutoCAD</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td>v.2016</td>
			<td>Drafting software for the photomask design</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Photomask</td>
			<td>CAD/Art Services</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Design with black background and clear features was printed at 20k dpi resolution on a transparent mask (5 x 7 in) by CAD/Art Services</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Silicone Wafers</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>1575</td>
			<td>Prime Grade, Single Side Polished; 100 mm (4 inch) Diameter; 525 um Thickness</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SU-8 50</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Negative Tone Photoresist; Penn State Nanofabrication Facility Property</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SU-8 Developer</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Penn State Nanofabrication Facility Property</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SUV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457C</td>
			<td>POPC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-&#945;-phosphatidylinositol-4-phosphate</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840045X</td>
			<td>PI4P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-&#945;-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840046X</td>
			<td>PI(4,5)P2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850757C</td>
			<td>POPE; Required for the synthesis of oSRB-POPE</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lissamine Rhodamine B Sulfonyl Chloride (mixed isomers)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L-20</td>
			<td>Required for the synthesis of oSRB-POPE</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH Sensitive Fluorescent Lipid Probe (oSRB-POPE)</td>
			<td>In-house</td>
			<td>N/A</td>
			<td>In-house Synthesis (Huang D. et al. 2013)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass Scintillation Vial</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66022-065</td>
			<td>20 mL volume capacity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Aquasonic 250D</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Ultrasonic Water Bath</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nuclepore Track-Etched Membranes</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>110605</td>
			<td>Polycarbonate Membrane; Diameter: 25 mm; Pore Size: 0.1 um; Distributor: Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chloroform</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CX1054-6</td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LIPEX Extruder</td>
			<td>Transferra Nanosciences</td>
			<td>T.001</td>
			<td>LIPEX 10 mL Thermobarrel Extruder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Viscotek 802 DLS</td>
			<td>Malvern Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dynamic Light Scattering; Penn State X-Ray Crystallography Facility Property</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Data Analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>v.6</td>
			<td>Curve-fitting software for data analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Axiovert 200M Epifluorescence Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AxioCam MRm Camera</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Camera</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">X-Cite 120</td>
			<td>Excelitas Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Light Source</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alexa 568 Filter Set</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Ex/Em 576/603 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AxioVision LE64 v.4.9.1.0 Software</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Image Processing Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10034-132</td>
			<td>200 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the protein solution into the microfluidic channel</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53509-070</td>
			<td>10 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the vesicle solution into the microfluidic channel</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Orion Star A321 pH meter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>STARA3210</td>
			<td>pH meter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Orion micro pH probe</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>8220BNWP</td>
			<td>micro pH probe</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N-(2-Hydroxyethyl)-Piperazine-N&#39;-(2-Ethanesulfonic Acid)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRB30487</td>
			<td>HEPES, Free Acid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH8014-2.5KGR</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tubing</td>
			<td>Allied Wire &#38; Cable</td>
			<td>TFT-200-24 N</td>
			<td>Internal Diameter: 0.020-0.026 inches (0.051-0.066 cm); Wall Thickness: 0.010 inches (0.025 cm); Flexible Polytetrafluoroethylene Thin-Wall Tubing; Natural Color</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nitrogen Gas - Industrial</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Local Provider</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Oxygen Gas - Industrial</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Local Provider</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Local Provider</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pip-on-a-chip: a label-free study of protein-phosphoinositide interactions

العديد من البروتينات الخلوية تتفاعل مع أسطح الغشاء للتأثير على العمليات الخلوية الأساسية. ويمكن توجيه هذه التفاعلات نحو مكون معين من الدهون داخل غشاء، كما هو الحال في فوسفهوانوسيتيدس (بيبس)، لضمان توطين خلوية محددة و / أو تفعيل. وقد تم دراسة بيبس والنطاقات الخلوية ملزمة بيب على نطاق واسع لفهم أفضل لدورها في علم وظائف الأعضاء الخلوية. طبقنا فحص التشكيل الرقم الهيدروجيني على الطبقات ثنائية الداعم (سلبس) كأداة لدراسة التفاعلات البروتين بيب. في هذه الدراسات، يتم استخدام الرقم الهيدروجيني الحساسة أورثو -Sulforhodamine B مترافق فوسفهاتيديليثانولامين للكشف عن التفاعلات البروتين بيب. عند ربط البروتين إلى سطح غشاء يحتوي على بيب، يتم تشكيل إمكانات بينية ( أي تغيير في درجة الحموضة المحلية)، وتحويل حالة البروتونات من التحقيق. يتم تقديم دراسة حالة من الاستخدام الناجح لفحص التشكيل الرقم الهيدروجيني باستخدام فوسفهوليباس C delta1 بليكسترفي مجال التماثل (بلك-δ1 ف) و فوسفهاتديلينوسيتول 4،5-بيسفوسفهات (بي (4،5) P 2 ) التفاعل كمثال. كان ثابت التفكك الظاهري ( K د، التطبيق ) لهذا التفاعل 0.39 ± 0.05 ميكرومتر، على غرار K د، والقيم التطبيق التي تم الحصول عليها من قبل الآخرين. كما لوحظ سابقا، المجال بلك-δ1 ف هو بي (4،5) P 2 محددة، ويظهر أضعف ملزم نحو فوسفهاتديلينوسيتول 4-فوسفات، وليس ملزمة ل سسبس نقية فوسفاتيديلكولين. المقايسة بيب على رقاقة هو مفيد على المقايسات التقليدية بيب ملزمة، بما في ذلك ولكن لا تقتصر على انخفاض حجم العينة ولا يجند / مستقبلات وضع العلامات المتطلبات، والقدرة على اختبار التفاعلات غشاء عالية والمنخفضة تقارب مع كل من الصغيرة و جزيئات كبيرة، وتحسين إشارة إلى نسبة الضوضاء. وبناء على ذلك، فإن استخدام نهج بيب على رقاقة أن يسهل توضيح آليات مجموعة واسعة من التفاعلات الغشاء. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون هذا الأسلوب شسيد في تحديد العلاجات التي تعدل قدرة البروتين على التفاعل مع الأغشية.

استخدمنا فحص ف التحوير لدراسة بلك-δ1 ف المجال بي (4،5) P 2 التفاعل داخل ميكروديفيس بيب على رقاقة ( الشكل 1 ). من خلال بروتوكول مفصل، أثبتنا كيفية إعداد وتجميع مكونات جهاز ميكروفلويديك، وجعل الحويصلات ونيلاميلار صغيرة (سيارات الدفع ?...

Watch this Scientific Journal Video about PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions at JoVE.com

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

هنا نقدم طبقة ثنائية الدهون المدعومة في سياق منصة ميكروفلويديك لدراسة التفاعلات البروتين فسفوانوسيتيد باستخدام طريقة خالية من التسمية على أساس التشكيل الرقم الهيدروجيني.

بيب على رقاقة: دراسة خالية من التسمية من التفاعلات البروتين فسفوانوسيتيد

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

The overall goal of the PIP-on-a-chip assay is to assess protein membrane interactions in a quantitative label-free manner. Protein membrane interactions are the heart of so many processes of the cell and its pathogens, but techniques to study these interactions are few. The advantages of this technique are low simple volume, no ligand or receptor labeling requirements combined with the ability to test membrane interactions in a physiologically relevant manner.Many therapeutic targets of viruses are membrane proteins, studies of these target proteins are often performed in solution using detergents. Our technique provides a more biologically relevant alternative. While you will see that this assay is capable of monitoring the interactions of proteins with membranes, it's actually quite a versatile assay and can be used to monitor iron membrane, small molecule membrane and even peptide membrane interactions.To begin, mix polydimethylsiloxane or PDMS prepolymer and the curing agent at a 10:1 ratio, in a large plastic weigh boat. Degas the mixture in a vacuum for one hour with the vacuum strength at 500 tor or less. Place the silicon master which contains multiple replicates of the same SU8 micropattern in a large plastic weigh boat and pour in the degas PDMS, then, cure it in a dry oven at 60 degrees celsius overnight.The next day, gently peel off the PDMS from the silicon master using one's hands. Mark the boundaries of each micro pattern in rectangles using a surgical scalpel and a ruler. Then, cut the PDMS into blocks, punch 16 holes at both ends of each micro channel with a biopsy punch, to make holes with 1.0 millimeter diameter.Pipette calculated volumes of phosphatidylcholine, Phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate and pH sensitive fluorescent probe into a single 20 milliliter glass ventilation vial. Dry the mixture in a stream of nitrogen gas inside the chemical fume hood for 10 minutes or until the solvent evaporates and the thin lipid film forms at the bottom of the vial. Then, desiccate the mixture under vacuum for at least three hours at a vacuum strength of 10 millitor to remove any residual organic solvent.Rehydrate the dried lipid film with five milliliters of running buffer, place the rehydrated lipid in an ultrasonic bath at an operating frequency of 35 kilohertz for 30 minutes at room temperature. Freeze thaw the vesicle suspension with liquid nitrogen and the 40 degree celsius water bath to get unilaminar vesicles. Repeat the freeze thaw 10 times, extrude the vesicle suspension to a 0.1 micron track edge polycarbonate membrane, using a lipid extruder to enrich for small unilaminar vesicles.Repeat the extrusion 10 times. Test the inlets and outlets of the PDMS block for blockage by squirting de-ionized water through the holes using a water wash bottle, then, dry the PDMS block with nitrogen gas. Next, place the PDMS block and the pre-cleaned cover slip inside the oxygen plasma system sample chamber.Expose the PDMS block and the cover slip with oxygen plasma for 45 seconds with the power settings at 75 watts, oxygen flow speed at 10 cubic centimeters per minute and the vacuum strength of 200 millitor. Next, place the pattern surface of the PDMS block in the contact with the cover slip immediately after the oxygen plasma treatment. Press gently to remove any air bubbles at contact sites.Place the device on a level hot plate at 100 degree celsius for three minutes to enhance the bonding. Use a wet lint-free wipe with 100%ethanol to remove any dust particles from the top and the bottom of the device. Then, tape the device on top of a glass microscope slide.Transfer 100 microliters of the Phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate containing small unilaminar vesicles into a 0.65 milliliter microcentrifuge tube. Adjust the pH of the solution to approximately 3/2 by adding 6.4 microliters of 0.2 normal hydrochloric acid. Pipette 10 microliters of the pH adjusted small unilaminar vesicle solution into each channels through the inlet and apply pressure through the pipette until the solution reaches the outlet.Detach the tip from the pipette and leave it attached to the device. After repeating this step for each channel, incubate the device for 10 minutes at room temperature, injection of vesicles into micro channels should be performed immediately after the device assembly. Meanwhile, cut sets of inlet and outlet tubing, using tweezers, connect the outlet tubing set to the device and then tape the device onto a microscope stage.Submerge one end of the inlet tubing set in 25 milliliters of running buffer contained in a conical tube and tape it to make sure that the tubing is secured. Using a lab jack, place the conical tube on a higher ground than the device in order to push the solution through the micro channels via gravity flow. For each inlet tube, use a syringe to draw one milliliter of running buffer from the free end of the tubing.Remove the pipette tip from the inlet and insert the free end of the inlet tubing into the device. Repeat this process to connect all the inlet tubing pieces to the device. Flowing running buffer through the channels helps to remove excess unruptured vesicles and equilibrate the bilayer to experimental conditions.Next, open the microscope control software. On the left panel, click on the microscope tab and choose the 10x objective. Click on live and then the Alexa 568 image icons on the toolbar, using the fine and coarse adjustment knobs, focus on the micro channels.Scan through the device to check through the quality of the SLBs and the channels. Then, click the FL shutter closed image icon on the toolbar, click on the acquisition tab and under basic adjustments, select exposure time. Set the exposure time to 200 milliseconds.On the left panel, click on multi-dimensional acquisition. Under the filters menu, select the red channel. Then, click on the timelapse menu, set the time interval to five minutes, duration to 30 minutes and lapse menu.Select the circle tool under the measure tab and draw a circle in any channel. Right click while the circle is selected and choose properties. Under the profile tab, check all T to view the fluorescence intensity as a function of time.Make sure this curve reaches a plateau which indicates equilibrium before proceeding to the next step, lower the buffer solution to an equal ground as the device, to stop the flow. One at a time, detach each outlet tubing and apply 200 microliters of each protein dilution into the outlet channel using a pipette. Do not apply any pressure, let gravity do the work.Detach the tip from the pipette and leave it attached to the micro fluidic device. Repeat this process for each channel and make sure that air bubbles are not introduced into the channels during this process. Next, lower the inlet tubing to a ground below the microfluidic device to start flowing the protein through the micro channels.Tape the free end of the tubing to a waste container. Flow the dilutions of the pleckstrin homology domain for 30 minutes. On the left panel of the software, under the timelapse tab, click on start, to begin imaging again.Shown here, is a representative view of the Phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate containing SLBs within micro channels. Before, and after, adding the pleckstrin homology domain at the indicated concentrations. Fluorescence intensities from the line scanned across micro channels are plotted as a function of distance and pixels for phosphatidylcholine, Phosphatidylinositol 4 phosphate, and Phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate binding experiments.Then, normalize binding data from individual experiments, is plotted as a function of phospholipase C delta 1 pleckstrin homology domain concentration and fit to a binding isoterm to extract apparent association constants. Comparison of the apparent association constants, shows that phospholipase C Delta 1 pleckstrin homology domain interacts with Phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate specifically, as expected. After watching this video, you should have a good understanding of how to make small unilaminar vesicles, make microfluidic devices, form supported lipid bilayers inside these microfluidic devices, as your protein membrane binding interactions, using this assay with our PIP-on-a-chip approach.Once mastered, this technique can be done in three hours if it is performed properly. Following this procedure, other methods like fluorescence recovery after photo bleaching can be performed in order to assess the effect of protein membrane binding on the lateral diffusion of the lipids. This technique paves the way to study protein membrane interactions with the assemble of lipids found in cells instead of one at a time, this approach will therefore broadly impact biochemistry and cell biology of protein membrane interactions.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

أسطح Micropatterned لدراسة التفاعلات حمض الهيالورونيك مع خلايا السرطان

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Endothelialized على microfluidics لدراسة التفاعلات الاوعية الدموية الدقيقة في الأمراض الدموية

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

عدم الاتصال، تسمية خالية من رصد خلايا المصفوفة خارج الخلية، وباستخدام التحليل الطيفي رامان

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

الميكروسكوب المتلازم لتحليل الهيكلية 3D من التفاعلات الدينامية

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

استخدام تسمية خالية أجهزة الاستشعار البصرية لكشف التحوير من قنوات البوتاسيوم التي كتبها G-بروتين المستقبلات اقترن

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

وبيوشيب الكهروكيميائية استنادا ميكروفلويديك لتسمية خالية تحليل الحمض النووي التهجين

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

تقنية تسمية خالية لتصوير المكانية والزمانية لإفرازات خلية واحدة

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

تسمية خالية واحدة كشف الجزيئة عن طريق Microtoroid البصرية الرنين

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

إعداد 3D الهلام الكولاجين وMicrochannels لدراسة التفاعلات 3D<em&gt; في فيفو</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

تقييم الكولاجين والايلاستين ميكروارتشيتيكتوريس تعتمد على الضغط في الشرايين المقاومة البشرية، والعيش بالفحص المجهري Fluorescence تسمية خالية

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...