Name: analysis of the gap junction-dependent transfer of mirna with 3d-frap microscopy
Uploaded: 2017-06-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy at JoVE.com

この作業は、ドイツ連邦教育研究省（FKZ 0312138AおよびFKZ 316159）、EU構造基金（ESF / IVWM-B34-0030 / 10およびESF / IVBM-B35-0010 / 12）、DFG（DA1296-1）、およびドイツ心臓財団（F / 01/12）が含まれる。さらに、RDは、ロストック大学医療センター（889001）のFORUNプログラム、DAMP財団、およびBMBF（VIP + 00240）によってサポートされています。

新生児マウスを含むこのプロトコールの全てのステップは、ロストック大学メディカルセンターの動物飼育に関する倫理ガイドラインに従って実施した。 1.細胞培養用調製物および心筋細胞培養用培地の調製<ol><li> PBS中の0.1％ゼラチンで細胞培養プレートをコートし、37℃で4時間または4℃で一晩インキュベートする。ゼラチンを除去し、滅菌層流の下で乾燥させる。 <...

<ol>
	<li>Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+Mechanisms+of+miRNAs+and+siRNAs.">Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs.</a> Cell. 136 (4), 642-655 (2009).</li><li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+silencing+RNAs:+state-of-the-art.">Small silencing RNAs: state-of-the-art.</a> Adv Drug Deliv Rev. 61 (9), 672-703 (2009).</li><li>Raghunathan, S., Patel, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+implications+of+small+interfering+RNA+in+cardiovascular+diseases.">Therapeutic implications of small interfering RNA in cardiovascular diseases.</a> Fundam Clin Pharmacol. 27 (1), 1-20 (2013).</li><li>Sluijter, J. P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+Cardiovascular+Regenerative+Medicine:+Directing+Tissue+Repair+and+Cellular+Differentiation.">MicroRNAs in Cardiovascular Regenerative Medicine: Directing Tissue Repair and Cellular Differentiation.</a> ISRN Vasc Med. , 1-16 (2013).</li><li>Li, M., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+MicroRNAs:+Potential+and+Emerging+Biomarkers+for+Diagnosis+of+Cardiovascular+and+Cerebrovascular+Diseases.">Circulating MicroRNAs: Potential and Emerging Biomarkers for Diagnosis of Cardiovascular and Cerebrovascular Diseases.</a> Biomed Res Int. , 1-9 (2015).</li><li>Romaine, S. P. R., Tomaszewski, M., Condorelli, G., Samani, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+cardiovascular+disease:+an+introduction+for+clinicians.">MicroRNAs in cardiovascular disease: an introduction for clinicians.</a> Heart. 101 (12), 921-928 (2015).</li><li>Maes, M., Crespo Yanguas, ., Willebrords, S., Cogliati, J., Vinken, B., M, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+and+pannexin+signaling+in+gastrointestinal+and+liver+disease.">Connexin and pannexin signaling in gastrointestinal and liver disease.</a> Transl Res. 166 (4), 332-343 (2015).</li><li>Michela, P., Velia, V., Aldo, P., Ada, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+connexin+43+in+cardiovascular+diseases.">Role of connexin 43 in cardiovascular diseases.</a> Eur. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+deliver+synthetic+microRNA+mimics+to+glioma+cells+and+glioma+stem+cells+and+inhibit+their+cell+migration+and+self-renewal.">Mesenchymal stem cells deliver synthetic microRNA mimics to glioma cells and glioma stem cells and inhibit their cell migration and self-renewal.</a> Oncotarget. 4 (2), 346-361 (2013).</li><li>Katakowski, M., Buller, B., Wang, X., Rogers, T., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+microRNA+is+transferred+between+glioma+cells.">Functional microRNA is transferred between glioma cells.</a> Cancer Res. 70 (21), 8259-8263 (2010).</li><li>Zong, L., Zhu, Y., Liang, R., Zhao, H. -. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assessment+of+gap+junctions+in+monolayer+and+three-dimensional+cultures+of+human+tendon+cells+using+fluorescence+recovery+after+photobleaching.">Functional assessment of gap junctions in monolayer and three-dimensional cultures of human tendon cells using fluorescence recovery after photobleaching.</a> J Biomed Opt. 19 (1), 15001 (2013).</li><li>Lemcke, H., Nittel, M. -. L., Weiss, D. G., Kuznetsov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+differentiation+requires+a+biphasic+modulation+of+gap+junctional+intercellular+communication+caused+by+dynamic+changes+of+connexin43+expression.">Neuronal differentiation requires a biphasic modulation of gap junctional intercellular communication caused by dynamic changes of connexin43 expression.</a> Eur J Neurosci. 38 (2), 2218-2228 (2013).</li><li>Lemcke, H., Steinhoff, G., David, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctional+shuttling+of+miRNA+-+A+novel+pathway+of+intercellular+gene+regulation+and+its+prospects+in+clinical+application.">Gap junctional shuttling of miRNA - A novel pathway of intercellular gene regulation and its prospects in clinical application.</a> Cell Signal. 27 (12), 2506-2514 (2015).</li><li>Lemcke, H., Kuznetsov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+connexin43+in+the+EGF/EGFR+signalling+during+self-renewal+and+differentiation+of+neural+progenitor+cells.">Involvement of connexin43 in the EGF/EGFR signalling during self-renewal and differentiation of neural progenitor cells.</a> Cell Signal. 25 (12), 2676-2684 (2013).</li><li>Lemcke, H., Peukert, J., Voronina, N., Skorska, A., Steinhoff, G., David, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+3D-FRAP+microscopy+to+analyse+gap+junction-dependent+shuttling+of+small+antisense+RNAs+between+cardiomyocytes.">Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 98, 117-127 (2016).</li><li>Laupheimer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Migration+of+Subpopulations+of+Bone+Marrow+Cells+along+an+SDF-1+&#945;+and+ATP+Gradient.">Selective Migration of Subpopulations of Bone Marrow Cells along an SDF-1 &#945; and ATP Gradient.</a> Bone Marrow Res. , 1-10 (2014).</li><li>Zhang, S., Wang, Q., Liu, L., Hong, X., Zhang, Y., Tao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+enhance+the+antiproliferative+effect+of+microRNA-124-3p+in+glioblastoma+cells.">Gap junctions enhance the antiproliferative effect of microRNA-124-3p in glioblastoma cells.</a> J Cell Physiol Physiol. 230 (10), 2476-2488 (2015).</li><li>Vasilescu, C., Tanase, M., Dragomir, M., Calin, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+mobility+to+crosstalk.+A+model+of+intracellular+miRNAs+motion+may+explain+the+RNAs+interaction+mechanism+on+the+basis+of+target+subcellular+localization.">From mobility to crosstalk. A model of intracellular miRNAs motion may explain the RNAs interaction mechanism on the basis of target subcellular localization.</a> Math Biosci. 280, 50-61 (2016).</li><li>Pitchiaya, S., Androsavich, J. R., Walter, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+single+molecule+microscopy+reveals+two+kinetically+distinct+pathways+for+microRNA+assembly.">Intracellular single molecule microscopy reveals two kinetically distinct pathways for microRNA assembly.</a> EMBO Rep. 13 (8), 709-715 (2012).</li><li>Heinze, K. G., Costantino, S., De Koninck, P., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+photobleaching,+laser+illumination+unbinds+fluorescent+proteins.">Beyond photobleaching, laser illumination unbinds fluorescent proteins.</a> J Phys Chem B. 113 (15), 5225-5233 (2009).</li><li>Jou, M. J., Jou, S. B., Guo, M. J., Wu, H. Y., Peng, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+generation+and+calcium+increase+induced+by+visible+light+in+astrocytes.">Mitochondrial reactive oxygen species generation and calcium increase induced by visible light in astrocytes.</a> Ann N Y Acad Sci. 1011, 45-56 (2004).</li><li>Dong, H., Lei, J., Ding, L., Wen, Y., Ju, H., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA:+Function,+detection,+and+bioanalysis.">MicroRNA: Function, detection, and bioanalysis.</a> Chem Rev. 113 (8), 6207-6233 (2013).</li><li>Liang, Y., Ridzon, D., Wong, L., Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+microRNA+expression+profiles+in+normal+human+tissues.">Characterization of microRNA expression profiles in normal human tissues.</a> BMC Genomics. 8 (1), 166 (2007).</li><li>Mittelbrunn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unidirectional+transfer+of+microRNA-loaded+exosomes+from+T+cells+to+antigen-presenting+cells.">Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells.</a> Nat Commun. 2, 282 (2011).</li><li>Squadrito, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+RNAs+Modulate+MicroRNA+Sorting+to+Exosomes+and+Transfer+to+Acceptor+Cells.">Endogenous RNAs Modulate MicroRNA Sorting to Exosomes and Transfer to Acceptor Cells.</a> Cell Rep. 8, 1432-1446 (2014).</li><li>Zhang, B., Farwell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNAs:+a+new+emerging+class+of+players+for+disease+diagnostics+and+gene+therapy.">microRNAs: a new emerging class of players for disease diagnostics and gene therapy.</a> J Cell Mol Med. 12 (1), 3-21 (2008).</li><li>Chen, Y., Gao, D. -. Y., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+delivery+of+miRNAs+for+cancer+therapy:+Challenges+and+strategies.">In vivo delivery of miRNAs for cancer therapy: Challenges and strategies.</a> Adv Drug Deliv Rev. 81C, 128-141 (2015).</li></ol>

<html> miRNAは、細胞生理学における重要な役割を果たしており、とりわけGJを細胞間の経路11,12,22の経路として使用することで、シグナル伝達分子として働くことが示されています。現在のプロトコールは、細胞クラスター内の蛍光miRNAを用いてこのGJ依存シャトルを特徴付けるインビトロ生細胞撮像技術を提示している。 プロトコールは、細胞モデル系として心筋細...

小さな非コードRNAは、細胞遺伝子調節において重要な役割を担っている。これらの分子は、特定の標的mRNAに結合する20〜25個のヌクレオチドから構成され、翻訳の妨害またはmRNA分解に導く1,2 。 miRNAやsiRNAなどの小規模RNAが担う遺伝子調節プロセスは、多くの異なる種に見られる高度に保存されたメカニズムです3 。特に、miRNA分子は、増殖、分化および再生を含む様々な生理学的過程に極めて重要である4,5。さらに、miRNA発現の調節不全は、多くの病理学的障害に起因する。相応して、miRNAは、診断のためのバイオマーカーとして、および遺伝子治療のための治療剤として適切であることが実証されている6,7。 </sup&gt;。 ギャップジャンクション（GJ）は分子量が最大1kDの分子の拡散交換を可能にする2つの隣接する細胞の原形質膜における特殊なタンパク質構造である。それらは、組織発生、分化、細胞死、および癌または心臓血管疾患などの病理学的障害にとって重要であることが示されている8,9,10。いくつかの分子は、イオン、代謝産物、およびヌクレオチドを含むGJチャネルを横切ることができると記載されている。興味深いことに、GJはまた、小RNA 11,12の細胞間移動のための経路を提供することが見出された。したがって、miRNAは、それらが産生される細胞内だけでなく、レシピエント細胞内でも作用することができる。これは、細胞間シグナル伝達系におけるmiRNAの役割を強調している。同時に、このデータは、ギャップジャンクショナル細胞間連絡はmiRNA機能と密接に関連している。組織恒常性、病理学および診断にmiRNAおよびGJが顕著に及ぼす影響のため、GJの機能およびmiRNAの関連する細胞間動態の包括的な理解は、miRNAに基づく疾患のメカニズムを明らかにし、 miRNA療法。 ギャップ接合カップリングの程度に依存して、細胞間のmiRNA分子の移動は非常に迅速なプロセスであり得る。したがって、これらの調節シグナル伝達分子の迅速な細胞間移動の視覚化および定量化を可能にする方法論が必要である。一般的に、フローサイトメトリーおよび分子生物学的技術が、小RNA 11,12,13,14のシャトルを実証するために適用されている。しかし、FRAPマイクロとは対照的にこれらの手法は、高い時間分解能を欠いており、これはGJを介したmiRNAの交換を分析する際に必須である。さらに、FRAP顕微鏡法は侵襲性が低く、したがって、いくつかの細胞タイプ15,16,17における分子のGJ依存性交換を評価するための強力で新規な生細胞撮像技術を代表する。 ここでは、心筋細胞間のmiRNAシャトルを評価するための3D-FRAPの応用を記述する詳細なプロトコルを提示する。この目的のために、心筋細胞を蛍光標識されたmiRNAでトランスフェクトした。このmiRNAでマークされた細胞を光退色させ、隣接する細胞からのギャップ接合型miRNA再流入を時間依存的に記録した。 FRAP実験の高い時間分解能は、生存細胞間のmiRNAおよびsiRNAの細胞間移動の正確な評価のための動態学的研究を行う可能性を提供する。モレエFRAP顕微鏡法は、GJがそれぞれのシャトルプロセスにどの程度関わっているかを明らかにするのに役立ちます18 。さらに、3D-FRAPは、GJ透過性における生理学的および病理学的変化および小RNA伝達に対するその影響を調べるために使用することができる15,19。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="698">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">neonatal NMRI mice</td>
			<td style="width:159px;">Charles River</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Gelatin</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7041</td>
			<td style="width:179px;">0.1% solution in PBS, sterilized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">PBS</td>
			<td style="width:159px;">Pan Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-53500</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Dulbecco&#180;s modified medium</td>
			<td style="width:159px;">Pan Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-03550</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td style="width:179px;">100 U/ml, 100&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:159px;">Pan Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P30-3306</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Cell culture plastic</td>
			<td style="width:159px;">TPP</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Primary Cardiomyocyte Isolation Kit</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">88281</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:243px;">HBSS</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">88281</td>
			<td style="width:179px;">included in primary cardiomyocyte isolation kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15250061</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:243px;">miRIDIAN Dy547 labeled microRNA Mimic&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">CP-004500-01-05</td>
			<td style="width:179px;">dissolve in RNAse free water, stock solution 20&#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:243px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S3139</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:159px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:119px;">T877.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P9333</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:159px;">Serva</td>
			<td style="width:119px;">28305.01</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Sodium succinate</td>
			<td style="width:159px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:119px;">3195.1</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">0.05% Trypsin/EDTA solution</td>
			<td style="width:159px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">L2153</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">4-well- Glass bottom chamber slides</td>
			<td style="width:159px;">IBIDI</td>
			<td style="width:119px;">80827</td>
			<td style="width:179px;">coat with 0.1% gelatin solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Amaxa Nucleofector II</td>
			<td style="width:159px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:179px;">program G-009 was used for Electroporation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">LSM 780 ELYRA PS.1 system</td>
			<td style="width:159px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Excel software</td>
			<td style="width:159px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">&#945;-actinin antibody</td>
			<td style="width:159px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab9465</td>
			<td style="width:179px;">dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Connexin43 antibody</td>
			<td style="width:159px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:119px;">sc-9059</td>
			<td style="width:179px;">dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">goat anti-mouse Alexa 594 antibody</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11005</td>
			<td>dilution 1:300</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">goat anti-rabbit Alexa 488 antibody&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11034</td>
			<td>dilution 1:300</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Connexin43 siRNA</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM16708 ID158724</td>
			<td>&#160;final concentration 250nM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">L10119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">CellTrace Calcein Red-Orange</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">DAPI nuclear stain</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of the gap junction-dependent transfer of mirna with 3d-frap microscopy

miRNAおよびsiRNAのような小さなアンチセンスRNAは、細胞生理学および病理学において重要な役割を果たし、さらにいくつかの疾患の治療において治療薬として使用することができる。 miRNA / siRNA治療のための新しく革新的な戦略の開発は、根底にあるメカニズムの広範な知識に基づいています。最近のデータは、小さなRNAがギャップ結合依存的な様式で細胞間で交換され、それによってレシピエント細胞における遺伝子調節効果を誘導することを示唆している。分子生物学的技術およびフローサイトメトリー分析は、miRNAの細胞間交換を研究するために一般的に用いられる。しかしながら、これらの方法は、ギャップジャンクションの分子束を研究する際に必要とされる、高い時間分解能を提供しない。したがって、細胞内シグナル伝達分子としてのmiRNA / siRNAの影響を調べるためには、細胞レベルでのこれらの小さなRNAの分析を可能にする新規ツールが必要である。現在のプロトコルは、心臓細胞間のmiRNA分子のギャップジャンクション依存的交換を解明するために、光退色（3D-FRAP）顕微鏡法後の三次元蛍光回復の襞付け。重要なことに、この直接的で非侵襲的な生細胞イメージング手法により、蛍光標識された小さなRNAのギャップジャンクショナルシャトルを、時空間分解能の高いリアルタイムで視覚化および定量化することができます。 3D-FRAPによって得られたデータは、細胞間ネットワーク内のシグナリング分子として小さなRNAが作用する、細胞間遺伝子調節の新規な経路を確認する。

ここでは、我々は新生児の心筋細胞内の蛍光miRNAのギャップジャンクショナルシャトルを研究する非侵襲的な技術として3D-FRAP顕微鏡法を提示する。単離された心筋細胞は、典型的な線条α-アクチニンパターンを示し、細胞間境界に沿ってCx43の大きなプラークを含んでいた（ 図1A 、白矢印）。単離した心筋細胞の純度を、α-アクチニン陽性細胞?...

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Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy

ここでは、miRNAのギャップジャンクション依存シャトルを解析するために、光漂白（3D-FRAP）後の3次元蛍光回復の適用について説明します。一般的に適用される方法とは対照的に、3D-FRAPはリアルタイムで高空間/時間分解能で小RNAの細胞間移動の定量化を可能にする。

3D-FRAP顕微鏡によるmiRNAのギャップジャンクション依存的転写の解析

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents ...

Research

JoVE Journal

Biology

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

ザ·<em&gt;アフリカツメガエル</em蛍光測定で&gt;卵母細胞のカットオープンワセリンギャップ電圧クランプ法

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

3&#39;LIFEアッセイを用いた高スループットにおけるmiRNA標的の検出

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

可変角度落射蛍光顕微鏡を用いて植物細胞表面ダイナミクスのリアルタイムイメージング

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

VirusMapperと超解像顕微鏡のためのオープンソースの単一粒子分析

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

高圧急速凍結、マイクロ波を用いたコントラスト強調、およびボリューム イメージングのために埋め込む最小限の樹脂による生体試料作製

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Tethered Bilayer Lipid Membranes to Monitor Heat Transfer between Gold Nanoparticles and Lipid Membranes

金ナノ粒子と脂質膜の熱伝達をモニターする二重層脂質膜

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

げっ歯類の頭部に定義された加速度を生成するための受動的頭部運動の適用

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...

Measurement of Liver Stiffness Using Atomic Force Microscopy Coupled with Polarization Microscopy

原子間力顕微鏡と偏光顕微鏡を組み合わせた肝臓のこわばり測定

Matrix stiffening has been recognized as one of the key drivers of the progression of liver fibrosis. It has profound effects on various aspects of cell ...

Fluorescence Lifetime Macro Imager for Biomedical Applications

生物医学アプリケーション向けの蛍光寿命マクロイメージャ

This paper presents a new photoluminescence lifetime imager designed to map the molecular oxygen (O2) concentration in different phosphorescent samples ...

Imaging of Mitochondrial Peroxide in Living Yeast Cells Using mtHyper7

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Advancing Mitochondrial Research Â– mtHyper7 Biosensor for Subcellular Analysis (Video) | JoVE

生きた酵母細胞におけるミトコンドリア過酸化物のレシオメトリックバイオセンサーmtHyPer7のイメージング

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...