Name: modeling neuronal death and degeneration in mouse primary cerebellar granule neurons
Uploaded: 2017-11-06T16:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons at JoVE.com

Diese Arbeit stützt sich auf Naturwissenschaften und Engineering Research Council of Canada und der Canadian Institutes of Health Research räumt a.j.-A.

dieses Protokoll basiert auf Änderungen der Verfahren, die zuvor beschriebenen 18 , 24 , 25 , 26 , 27. dieses Protokoll ist genehmigt, die vom Tier Pflege an der McGill University.
 1. experimentelle Vorbereitung Hinweis: die folgenden Stammlösungen vorbereitet und bis zum Gebrauch gewartet werden ...

<ol>
	<li>Goldowitz, D., Hamre, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cells+and+molecules+that+make+a+cerebellum.">The cells and molecules that make a cerebellum.</a> Trends in Neurosciences. 21 (9), 375-382 (1998).</li><li>Contestabile, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+granule+cells+as+a+model+to+study+mechanisms+of+neuronal+apoptosis+or+survival+in+vivo+and+in+vitro.">Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro.</a> Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).</li><li>Bilimoria, P. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+post-natal+mouse+cerebellar+granule+neuron+progenitor+cells+and+neurons.">Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons.</a> J Vis Exp. (23), (2009).</li><li>Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+cerebellar+granule+neurons+in+vitro+and+in+vivo+to+study+neuronal+morphology+and+migration.">Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li></ol>

Hier bieten wir eine einfache Methode für die Kultivierung der primäre Maustaste zerebelläre Granulat Neuronen (CGNs), Verlust und Gewinn von Funktionsstudien und Modellierung verschiedene Mechanismen des Zelltods. Mehrere Faktoren beeinflussen die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse mit diesem Verfahren die engmaschige Überwachung erfordern. Dazu gehören die Reinheit der Kultur einschließlich der Beseitigung von Gliazellen in der Kultur, dem Zusammenfluss von der Kultur und Erhaltung gesunde Zellen. Einführung Vari...

Zerebelläre Granulat Neuronen (CGNs) zeichnen sich auch in der Kultur und dienten als ein effektives Modell neuronalen Tod und Entwicklung 1,2,3,4,5, zu studieren 6. der frühen Ausdruck der N-Methyl-D-Aspartat-(NMDA)-Rezeptoren in CGN Kulturen in Vitro macht ihnen ein attraktives Modell, NMDA-induzierte Signalisierung zu studieren. Aktivierung dieser Rezeptoren mit NMDA in Verbindung mit Membran-Depolarisation wird verwendet, um physiologische neuronale Aktivität Stimulation zu modellieren und hat für die Forschung über die Mechanismen der synaptischen Plastizität 7,8erlaubt. Im Gegenteil, kann über-Stimulation dieser Rezeptoren durch NMDA-Liganden Excitotoxizität, einen wichtigen Mechanismus der neuronaler Verlust in akuten Hirnschäden und Neurodegenerative Krankheiten 9modellieren verwendet werden. Ein Mechanismus für die Induktion der Excitotoxizität ist durch ATP Hunger mit reduzierter Sauerstoff mit akuten neuronalen Verletzung gesehen. Dies führt zu Membran-Depolarisation und erhöhte Konzentrationen von Glutamat frei an der Synapse. Die nachfolgenden Reizüberflutung des NMDA-Rezeptors durch erhöhte Glutamat führt zu übermäßiger Ca2 + Zustrom über diese Rezeptoren, die wiederum mehrere Wege einschließlich Ca2 +aktiviert-aktiviert Proteasen, Phospholipases, und jedoch, was in den unkontrollierten Abbau von kritischen zellulären Komponenten und Zelltod. Darüber hinaus führt hohe intrazelluläre Ca2 + auf die Generation der freie Sauerstoff-Radikale und mitochondriale Schäden 10,11.
Während die Mehrheit der neuronalen Verlust nach NMDA-induzierten neuronalen Excitotoxizität aufgrund Kalzium Zustrom und Bax/Bak unabhängige, werden nicht andere Mechanismen des Zelltods von diesem Modell ausgeschlossen. Das Aussehen der beiden nekrotische und apoptotischen Zelltod durch Excitotoxizität teilweise durch die Generation von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und DNA-Schäden durchhohe intrazelluläre Ca 2 + Level 12ist. DNA-Schädigung führt zu neuronalen Tod durch Apoptose Mechanismen, mit Markenzeichen des apoptotischen Zelltod, wie das Auftreten von Chromatin Massen und Apoptotic Körper korreliert werden. Induktion der Apoptose ist vermittelt durch die Freisetzung von Cytochrom c aus Mitochondrien und hat gezeigt, dass Bax/Bak Oligomerisierung 13abhängig sein. Bax/Bak Oligomerisierung fördert Porenbildung in der äußeren mitochondrialen Membran, was zu Cytochrom C Version und die Aktivierung der Pro-apoptotische Regulierungsbehörden wie mit milden ischämische Schädigung 14gesehen.
Generation von ROS ist ein wichtiges Thema im Gehirn aufgrund der niedrigen endogenen Antioxidantien, gepaart mit der großen Sauerstoffbedarf für neuronale funktionierenden 15. Wenn zu einem ischämischen Ereignis ausgesetzt, ist Stickoxid-Synthase hochreguliert, Produktion von Stickstoffmonoxid und Erhöhung der reaktiven Sauerstoff-Spezies- 14. Die erhöhte Konzentration von Sauerstoff-Radikalen kann DNA-Schäden führen und indirekt Energie Hunger verursachen. Hohes Maß an DNA-Doppelstrang-Brüche werden durch die Aktivierung von Poly ADP-Ribose-Polymerase-1 (PARP-1), eine eukaryotische Chromatin-gebundenen Protein verantwortlich für katalysieren die Übertragung der ADP-Ribose Einheiten von NAD+, ein integraler Bestandteil der Prozess behoben. DNA-Reparatur- 16. Jedoch mit unverhältnismäßig großer Schäden durch oxidativen Stress, kann Aktivierung von PARP-1 Energie Hungertod aufgrund der erhöhten Abfluss auf NAD+, notwendige Substrat für die ATP-Produktion durch Oxidative Phosphorylierung führen. Letztlich oxidativer Stress löst Apoptose in gewissem Bax/Bak abhängig zur mitochondrialen Cytochrom C Veröffentlichung, und hat gezeigt, dass mitochondriale Umbau in CGNs 17zu induzieren.
Zu guter Letzt können Konzentrationsänderungen von Kaliumchlorid (KCl) in CGN Kulturen zu niedrigen Kalium/Depolarisation vermittelte Apoptose 18,19,20Modell verwendet werden. Wenn auf ein niedriges Niveau von K+ausgesetzt, unterziehen CGNs unterschiedliche physiologische Veränderungen, was zu Kürzungen der mitochondrialen Atmung und Glykolyse, verminderte zelluläre Nachfrage 21, zugeschrieben sowie Abstriche an nuklearer Faktor-κB (NFκB) die Aktivitäten wie Entzündungen und synaptische Übertragung 22regelt. Dieses Modell ist von besonderem Interesse für das Studium der Zelltod während der neuronalen Entwicklung. Die niedrigen K+ Umwelt mehr ähnelt physiologische Bedingungen, und bewirkt, dass Kennzeichen des Zelltods gesehen während der neuronalen Entwicklung 23.
Zusammenfassend bieten CGNs eine langjährige Modell, um die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der neuronalen Tod und Degeneration zu untersuchen. Das folgende Protokoll ermöglicht Isolierung und Kultivierung von CGNs, Ausdruck oder Unterdrückung von bestimmten genetischen Weg mit Viren und die Induktion der neuronalen Tod durch unterschiedliche Mechanismen aus neuronalen Verletzungen und Degeneration.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="934">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">qPCR lentivitral titration kit&#160;</td>
			<td style="width:215px;">ABM</td>
			<td style="width:219px;">#LV900</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">speedy virus purification solution&#160;</td>
			<td style="width:215px;">ABM</td>
			<td>#LV999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pCMV-dR8.2</td>
			<td style="width:215px;">Addgene</td>
			<td>#8455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pCMV-VS.VG</td>
			<td style="width:215px;">Addgene</td>
			<td>#8454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Distilled water&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Gibco</td>
			<td style="width:219px;">#15230162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200 mM L-Glutamine&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Gibco</td>
			<td style="width:219px;">#25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 mm Nunc culture dishes</td>
			<td style="width:215px;">Gibco</td>
			<td style="width:219px;">#174913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PowerUP SYBR green master mix</td>
			<td>life technologies</td>
			<td style="width:219px;">#A25742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">BSA V Solution</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#A-8412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">CaCl2 &#8226; 2H2O</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#C-7902&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Camptothecin</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#C-9911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Chicken Egg White Trypsin Inhibitor&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#10109878001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Cytosine beta-D-Arabino Furanoside</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#C-1768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">D-(+)-Glucose&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#G-7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DNase1&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Eagle-minimal essential medium</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#M-2279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Glycine</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#G-5417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Heat inactivated dialyzed Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#F-0392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Hepes Buffer&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#H-0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Hydrogen peroxide</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#216763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">50 mg/mL Gentamycin&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#G-1397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">MgSO4&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#M-2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">N-Methyl-D-aspartic acid</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#M-3262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Phenol Red Solution&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#P-0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Trypsin&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#T-4549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 3000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3000-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">p3000 enhancer reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3000-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl&#160;</td>
			<td style="width:215px;">VWR</td>
			<td style="width:219px;">#CABDH9258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl&#160;</td>
			<td style="width:215px;">VWR</td>
			<td style="width:219px;">#CABDH9286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">NaH2PO4H2O&#160;</td>
			<td style="width:215px;">VWR</td>
			<td style="width:219px;">#CABDH9298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly D-lysine&#160;</td>
			<td style="width:215px;">VWR</td>
			<td style="width:219px;">#89134-858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">DMEM</td>
			<td style="width:215px;">Wisent</td>
			<td style="width:219px;">#319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">FBS</td>
			<td style="width:215px;">Wisent</td>
			<td style="width:219px;">#080-450</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling neuronal death and degeneration in mouse primary cerebellar granule neurons

Zerebelläre Granulat Neuronen (CGNs) sind eine häufig verwendete neuronale Modell, bilden eine reiche homogene Bevölkerung im Kleinhirn. Im Hinblick auf ihre postnatale Entwicklung, Fülle und Zugänglichkeit sind CGNs ein ideales Modell, neuronale Prozesse, einschließlich der neuronalen Entwicklung, neuronale Migration und physiologische neuronale Aktivität Stimulation zu studieren. Darüber hinaus bieten CGN Kulturen ein hervorragendes Modell für das Studium der verschiedenen Modi des Zelltods einschließlich Excitotoxizität und Apoptose. CGNs express innerhalb von einer Woche in Kultur N-Methyl-D-Aspartat-(NMDA)-Rezeptoren, eine spezifische Ionotropic Glutamat-Rezeptor mit vielen wichtigen Funktionen in neuronalen Gesundheit und Krankheit. Die Zugabe von geringen Konzentrationen von NMDA in Verbindung mit Membran-Depolarisation, Nagetier CGN Primärkulturen wurde verwendet, um physiologische neuronale Aktivität Stimulation zu modellieren, während die Zugabe von hohen Konzentrationen von NMDA eingesetzt werden kann, um zu modellieren Excitotoxic neuronalen Verletzungen. Hier werden eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von CGNs aus 6 Tage alten Welpen sowie genetische Manipulation von CGNs durch Adenoviren und Lentiviren beschrieben. Wir auch anwesend optimierte Protokolle wie NMDA-induzierte Excitotoxizität, niedrig-Kalium-induzierte Apoptose, oxidativer Stress und DNA-Schäden nach Transduktion dieser Neuronen stimulieren.

Mit sorgfältiger Präparation sollte die intakte Gehirn mit minimalen Schäden entfernt werden, wie in Abbildung 1A-B. Anstrengung sollte geachtet werden, Schädigung des Gehirns bei der Entnahme zu minimieren, insbesondere Schäden an das Kleinhirn. Beschädigen das Kleinhirn sorgt für schwieriger Identifizierung und vollständige Entfernung der Hirnhäute und erhöht die Wahrscheinlichkeit einer Verunreinigung der neuronalen Kultur. Nach ...

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Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur Isolierung und Kultivierung primäre Maustaste zerebralen Granulat Neuronen (CGNs) von 6-7 Tage alten Welpen, effizienten Transduktion von CGNs für Verlust und Gewinn von Funktionsstudien, und Modellierung NMDA-induzierten neuronalen Excitotoxizität, niedrig-Kalium-induzierte Zelltod, DNA-Schäden und oxidativen Stress mit der gleichen Kultur-Modell.

Modellierung von neuronalen Tod und Degeneration in Maus primären zerebelläre Granulat Neuronen

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Elektroporation gefolgt von primären neuronalen Kultur für ein Studium Gene Function in Subset von kortikalen Neuronen

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Forschung

Neurowissenschaften

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection und Primärkultur von embryonalen Maus-Hippocampus und kortikalen Neuronen

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

Quantitative Analyse der synaptischen Vesikel Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Nervenzellen Granulat mit FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetische Manipulation von Kleinhirnkörnerzellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In Vivo</em&gt;, Um neuronale Morphologie und Migration Studieren

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Primärkultur von Maus dopaminergen Neuronen

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Ex-vivo-Bildgebung von Postnatale Kleinhirn-Körnerzellmigration mittels konfokaler Makros

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

Selektive Depletion von Mikroglia von Kleinhirn-Körnerzellkulturen Mit L-Leucin-Methylester

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...

Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture

Beurteilung der neuronalen Lebensfähigkeit unter Verwendung von Fluorescein-Diacetat-Propidium-Iodid-Doppelfärbung in Cerebellar-Granulat-Neuron-Kultur

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the ...

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

Charcot-Marie-Zahn Krankheit In Vitro Modellierung durch Transfecting Maus primären Motoneurone

Neurodegeneration of spinal motoneurons (MNs) is implicated in a large spectrum of neurological disorders including amyotrophic lateral sclerosis, ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

Ballistische Kennzeichnung von Pyramidal neurons in Gehirnscheiben und in der primären Zellkultur

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...