Name: modeling neuronal death and degeneration in mouse primary cerebellar granule neurons
Uploaded: 2017-11-06T16:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons at JoVE.com

Questo lavoro è supportato da scienze naturali e ingegneria Research Council of Canada e la canadese istituti di ricerca sanitaria concede a A.J.-A.

questo protocollo si basa su modifiche delle procedure che sono state descritte precedentemente 18 , 24 , 25 , 26 , 27. il presente protocollo è approvato dal comitato di cura animale presso la McGill University.
 1. preparazione sperimentale Nota: le seguenti soluzioni di magazzino possono essere p...

<ol>
	<li>Goldowitz, D., Hamre, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cells+and+molecules+that+make+a+cerebellum.">The cells and molecules that make a cerebellum.</a> Trends in Neurosciences. 21 (9), 375-382 (1998).</li><li>Contestabile, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+granule+cells+as+a+model+to+study+mechanisms+of+neuronal+apoptosis+or+survival+in+vivo+and+in+vitro.">Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro.</a> Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).</li><li>Bilimoria, P. M., Bonni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultures+of+cerebellar+granule+neurons.">Cultures of cerebellar granule neurons.</a> CSH Protoc. , (2008).</li><li>Kramer, D., Minichiello, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+of+primary+cerebellar+granule+cells.">Cell culture of primary cerebellar granule cells.</a> Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).</li><li>Burgoyne, R. D., Cambray-Deakin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+neurobiology+of+neuronal+development:+the+cerebellar+granule+cell.">The cellular neurobiology of neuronal development: the cerebellar granule cell.</a> Brain Res. 472 (1), 77-101 (1988).</li><li>Hatten, M. E., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+neural+patterning+and+specification+in+the+developing+cerebellum.">Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum.</a> Annu Rev Neurosci. 18, 385-408 (1995).</li><li>Evans, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+signalling+in+cerebellar+plasticity.">Synaptic signalling in cerebellar plasticity.</a> Biol Cell. 99 (7), 363-378 (2007).</li><li>Hunt, D. L., Castillo, P. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+analysis+of+cerebellar+granule+neurons+undergoing+apoptosis+by+potassium/serum+deprivation.">Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation.</a> Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).</li><li>Piccioli, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+nuclear+factor-kappaB+activation+induces+apoptosis+in+cerebellar+granule+cells.">Inhibition of nuclear factor-kappaB activation induces apoptosis in cerebellar granule cells.</a> J Neurosci Res. 66 (6), 1064-1073 (2001).</li><li>D'Mello, S. R., Galli, C., Ciotti, T., Calissano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+apoptosis+in+cerebellar+granule+neurons+by+low+potassium:+inhibition+of+death+by+insulin-like+growth+factor+I+and+cAMP.">Induction of apoptosis in cerebellar granule neurons by low potassium: inhibition of death by insulin-like growth factor I and cAMP.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (23), 10989-10993 (1993).</li><li>Gallo, V., Ciotti, M. T., Coletti, A., Aloisi, F., Levi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+release+of+glutamate+from+cerebellar+granule+cells+differentiating+in+culture.">Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (24), 7919-7923 (1982).</li><li>Messer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maintenance+and+identification+of+mouse+cerebellar+granule+cells+in+monolayer+culture.">The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture.</a> Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).</li><li>Jahani-Asl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CDK5+phosphorylates+DRP1+and+drives+mitochondrial+defects+in+NMDA-induced+neuronal+death.">CDK5 phosphorylates DRP1 and drives mitochondrial defects in NMDA-induced neuronal death.</a> Hum Mol Genet. 24 (16), 4573-4583 (2015).</li><li>Jahani-Asl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+inner+membrane+GTPase,+optic+atrophy+1+(Opa1),+restores+mitochondrial+morphology+and+promotes+neuronal+survival+following+excitotoxicity.">The mitochondrial inner membrane GTPase, optic atrophy 1 (Opa1), restores mitochondrial morphology and promotes neuronal survival following excitotoxicity.</a> J Biol Chem. 286 (6), 4772-4782 (2011).</li><li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system.">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> J Vis Exp. (63), e4031 (2012).</li><li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+production.">Lentivirus production.</a> J Vis Exp. (32), (2009).</li><li>Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+post-natal+mouse+cerebellar+granule+neuron+progenitor+cells+and+neurons.">Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons.</a> J Vis Exp. (23), (2009).</li><li>Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+cerebellar+granule+neurons+in+vitro+and+in+vivo+to+study+neuronal+morphology+and+migration.">Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li></ol>

Qui forniamo un metodo semplice per la coltura di neuroni cerebellari del granello di mouse primario (CGNs), perdita e guadagno di funzione studia e modellazione di diversi meccanismi di morte cellulare. Diversi fattori influenzano la riproducibilità dei risultati utilizzando questa procedura che richiedono un attento monitoraggio. Questi includono la purezza della cultura tra cui l'eliminazione delle cellule gliali nella cultura, alla confluenza della cultura e mantenere le cellule sane. L'introduzione di variabilità ...

I neuroni cerebellari del granello (CGNs) sono ben caratterizzati in cultura e hanno servito come un modello efficace per studiare la morte neuronale e sviluppo 1,2,3,4,5, 6. l'espressione precoce dei recettori N-metil-D-aspartato (NMDA) CGN culture in vitro di li rende un modello interessante per studiare NMDA-indotta di segnalazione. L'attivazione di questi recettori con NMDA in combinazione con la depolarizzazione della membrana viene utilizzata per modellare la stimolazione fisiologica attività neuronale e ha permesso per la ricerca dei meccanismi di plasticità sinaptica 7,8. Al contrario, eccesso di stimolazione di questi recettori da ligando NMDA può essere utilizzato per modellare excitotoxicity, un meccanismo importante di perdita neuronale in malattie di neurodegenerative e danno cerebrale acuta 9. Un meccanismo per l'induzione di excitotoxicity è attraverso inedia ATP con ossigeno ridotto, come si è visto con la ferita di un neurone acuta. In questo modo la depolarizzazione della membrana e rilasciano di livelli elevati di glutammato in sinapsi. La sovrastimolazione successiva del recettore NMDA da elevati del glutammato provoca eccessiva Ca2 + afflusso attraverso questi recettori, che a sua volta attiva diverse vie tra cui Ca2 +-attivati proteasi, fosfolipasi, e endonucleasi, conseguente la degradazione incontrollata dei critici componenti cellulari e morte cellulare. Inoltre, alta intracellulare Ca2 + porta alla generazione di radicali liberi dell'ossigeno e danno mitocondriale 10,11.
Mentre la maggior parte della perdita di un neurone seguendo eccitotossicità neuronale indotta da NMDA è dovuto afflusso del calcio ed è indipendente di Bax e Bak, altri meccanismi di morte cellulare non possono essere escluso da questo modello. L'aspetto di entrambi necrotico e apoptotici come la morte delle cellule dovuto excitotoxicity è parzialmente dovuto alla generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e danni al DNA causati daalta intracellulare Ca 2 + livelli 12. Danno del DNA risultati nella morte neuronale attraverso meccanismi apoptotici, essendo correlati con tratti distintivi della morte apoptotica delle cellule, come la comparsa di masse di cromatina e corpi apoptotici. Induzione di apoptosi è mediata attraverso il rilascio di citocromo c dai mitocondri e ha dimostrato di essere dipendente da Bax/Bak oligomerizzazione 13. Oligomerizzazione di Bax/Bak promuove la formazione di pori nella membrana mitocondriale esterna, con conseguente rilascio del citocromo c e l'attivazione dei regolatori pro-apoptotiche come si è visto con una lieve lesione ischemica 14.
Generazione di ROS è un problema significativo nel cervello dovuto i bassi livelli endogeni di antiossidanti, accoppiati con il fabbisogno di ossigeno grande per funzionamento neuronale 15. Quando esposti ad un evento ischemico, ossido nitrico sintasi è aumentata, produzione di ossido nitrico e l'aumento di specie reattive dell'ossigeno 14. L'aumento della concentrazione dei radicali dell'ossigeno può provocare danni al DNA e causare indirettamente la fame di energia. Alti livelli di rotture del doppio filamento del DNA sono sanati mediante l'attivazione di poli ADP-ribosio polimerasi-1 (PARP-1), un'eucariota cromatina-proteina responsabile di che catalizza il trasferimento di unità di ADP-ribosio dal NAD+, un parte integrante del processo 16di riparazione del DNA. Tuttavia, con danni eccessivi a causa dello stress ossidativo, attivazione di PARP-1 può causare fame di energia dovuto lo scarico aumentato il NAD+, un substrato necessario per la produzione di ATP attraverso la fosforilazione ossidativa. In definitiva, lo sforzo ossidativo si innescherà apoptosi in un modo dipendente di Bax/Bak che conduce al rilascio mitocondriale del citocromo c ed è stato indicato per indurre il rimodellamento mitocondriale in CGNs 17.
Infine, cambiamenti nella concentrazione di cloruro di potassio (KCl) in colture CGN possono essere utilizzati per modellare basso potassio/depolarizzazione mediata apoptosi 18,19,20. Quando esposti a bassi livelli di K+, CGNs subiscono cambiamenti fisiologici distinti, con conseguente riduzioni di respirazione mitocondriale e di glicolisi, attribuito alla diminuzione della domanda cellulare 21, così come la riduzione dei livelli di Nuclear factor-f-κB (NFκB) che regola le attività tra cui l'infiammazione e la trasmissione sinaptica 22. Questo modello è di particolare interesse per lo studio della morte delle cellule durante lo sviluppo neuronale. L'ambiente di K+ basso più strettamente assomiglia a condizioni fisiologiche e provoca i tratti distintivi della morte delle cellule durante lo sviluppo neuronale 23.
In sintesi, CGNs forniscono un modello di vecchia data per studiare i meccanismi molecolari sottostanti di degenerazione e morte neuronale. Il seguente protocollo permetterà di isolamento e coltura di CGNs, espressione o repressione di una particolare via genetica utilizzando virus e l'induzione della morte neuronale attraverso diversi meccanismi che rappresenta la degenerazione e la lesione di un neurone.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="934">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">qPCR lentivitral titration kit&#160;</td>
			<td style="width:215px;">ABM</td>
			<td style="width:219px;">#LV900</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">speedy virus purification solution&#160;</td>
			<td style="width:215px;">ABM</td>
			<td>#LV999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pCMV-dR8.2</td>
			<td style="width:215px;">Addgene</td>
			<td>#8455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pCMV-VS.VG</td>
			<td style="width:215px;">Addgene</td>
			<td>#8454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Distilled water&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Gibco</td>
			<td style="width:219px;">#15230162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200 mM L-Glutamine&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Gibco</td>
			<td style="width:219px;">#25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 mm Nunc culture dishes</td>
			<td style="width:215px;">Gibco</td>
			<td style="width:219px;">#174913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PowerUP SYBR green master mix</td>
			<td>life technologies</td>
			<td style="width:219px;">#A25742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">BSA V Solution</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#A-8412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">CaCl2 &#8226; 2H2O</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#C-7902&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Camptothecin</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#C-9911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Chicken Egg White Trypsin Inhibitor&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#10109878001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Cytosine beta-D-Arabino Furanoside</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#C-1768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">D-(+)-Glucose&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#G-7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DNase1&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Eagle-minimal essential medium</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#M-2279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Glycine</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#G-5417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Heat inactivated dialyzed Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#F-0392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Hepes Buffer&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#H-0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Hydrogen peroxide</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#216763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">50 mg/mL Gentamycin&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#G-1397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">MgSO4&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#M-2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">N-Methyl-D-aspartic acid</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#M-3262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Phenol Red Solution&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#P-0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Trypsin&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">#T-4549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 3000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3000-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">p3000 enhancer reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3000-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl&#160;</td>
			<td style="width:215px;">VWR</td>
			<td style="width:219px;">#CABDH9258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl&#160;</td>
			<td style="width:215px;">VWR</td>
			<td style="width:219px;">#CABDH9286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">NaH2PO4H2O&#160;</td>
			<td style="width:215px;">VWR</td>
			<td style="width:219px;">#CABDH9298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly D-lysine&#160;</td>
			<td style="width:215px;">VWR</td>
			<td style="width:219px;">#89134-858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">DMEM</td>
			<td style="width:215px;">Wisent</td>
			<td style="width:219px;">#319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">FBS</td>
			<td style="width:215px;">Wisent</td>
			<td style="width:219px;">#080-450</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling neuronal death and degeneration in mouse primary cerebellar granule neurons

I neuroni cerebellari del granello (CGNs) sono un modello comunemente usato neuronale, formando una popolazione omogenea abbondante nel cervelletto. Alla luce del loro sviluppo post-natale, abbondanza e accessibilità, CGNs sono un modello ideale per studiare processi neuronali, compreso lo sviluppo neuronale, migrazione neuronale e stimolazione di attività neuronale fisiologica. Inoltre, culture CGN forniscono un eccellente modello per studiare le diverse modalità di morte cellulare tra cui excitotoxicity e apoptosi. All'interno di una settimana nella cultura, CGNs esprimere recettori N-metil-D-aspartato (NMDA), un recettore di glutammato di specifici recettori ionotropici con molte funzioni critiche in un neurone salute e nella malattia. L'aggiunta di basse concentrazioni di NMDA in combinazione con la depolarizzazione della membrana di roditore colture primarie di CGN è stato utilizzato per modellare la stimolazione fisiologica attività neuronale, mentre l'aggiunta di alte concentrazioni di NMDA può essere impiegato per modellare lesione di un neurone excitotoxic. Qui, un metodo di isolamento e coltura di CGNs da cuccioli 6 giorno precedente così come la manipolazione genetica di CGNs da adenovirus e lentivirus sono descritti. Siamo anche presenti protocolli ottimizzati su come stimolare eccitotossicità indotta da NMDA, apoptosi indotta da basso-potassio, stress ossidativo e danno al DNA dopo la trasduzione di questi neuroni.

Con la dissezione attenta, cervello intatto deve essere rimosso con il minimo danno come visto in Figura 1A-B. Sforzo dovrebbe essere presa per minimizzare i danni al cervello durante la rimozione, specialmente danni al cervelletto. Danneggiare il cervelletto rende più difficile identificazione e rimozione completa delle meningi e aumenta la probabilità di contaminazione della coltura neuronale. Una volta che sono state rimosse le meningi, ...

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Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Questo protocollo descrive un metodo semplice per isolare e neuroni di granulo cerebrale primario del mouse (CGNs) da cuccioli di 6-7 giorno vecchio, trasduzione efficiente di CGNs per la perdita e guadagno di funzione studia, la coltura e la modellazione eccitotossicità neuronale indotta da NMDA, basso-potassio-indotta delle cellule morte, danni al DNA e stress ossidativo utilizzando lo stesso modello di cultura.

Modellazione di morte neuronale e degenerazione in neuroni cerebellari del granello primario del Mouse

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Elettroporazione seguita da primaria Cultura neuronale per studiare la funzione dei geni in sottoinsieme di neuroni corticali

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Ricerca

Neuroscienze

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection e cultura primaria di neuroni embrionali di topo ippocampale e corticale

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

Analisi quantitativa di Replenishment pool delle vescicole sinaptiche in colture di neuroni granuli cerebellari utilizzando coloranti FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Manipolazione genetica delle cerebellare granuli neuroni<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Per studiare neuronale Morfologia e migrazione

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Cultura primario di topo neuroni dopaminergici

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Ex Vivo Imaging di postnatale cerebellare granuli migrazione cellulare Utilizzando confocale macroscopia

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

L&#39;esaurimento selettiva di microglia da cerebellare granuli colture cellulari Utilizzando L-leucina estere metilico

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...

Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture

Valutazione della vitalità neuronale utilizzando la fluoresceina diacetato-propidium ioduro a doppia colorazione nel granulo cerebrale Neuron Culture

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the ...

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

Malattia di Charcot-Marie-Tooth In Vitro di modellazione di trasfezione motoneuroni primari del Mouse

Neurodegeneration of spinal motoneurons (MNs) is implicated in a large spectrum of neurological disorders including amyotrophic lateral sclerosis, ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

Etichettatura balistica dei neuroni piramidali nelle sezioni cerebrali e nella cultura cellulare primaria

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...