Name: simultaneous measurement of hdac1 and hdac6 activity in hela cells using uhplc-ms
Uploaded: 2017-08-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS at JoVE.com

الكتاب نعترف بتكلفة العمل CM1406 (البيولوجيا الكيميائية جينية). وأيد البحث عنها في هذا المنشور الأساس ميرسييه بيير.

1-خلية ثقافة
ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات التالية في غطاء زراعة الأنسجة قياسية. ومن المتوقع الإلمام بتقنية العقيمة.
<ol>
	<li>الثقافة خلايا هيلا إلى كونفلوينسي 80% في قارورة ثقافة الخليوي T75 في MEM تستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين، البنسلين G (100 U/mL)، وستربتوميسين (100 مغ/مل). ملاحظة: الخلية ?...

<ol>
	<li>Arrowsmith, C. H., Bountra, C., Fish, P. V., Lee, K., Schapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+protein+families:+a+new+frontier+for+drug+discovery.">Epigenetic protein families: a new frontier for drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 11 (5), 384-400 (2012).</li><li>Henikoff, S., Greally, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics,+cellular+memory+and+gene+regulation.">Epigenetics, cellular memory and gene regulation.</a> Curr Biol. 26 (14), R644-R648 (2016).</li><li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC6+inhibitor+blocks+amyloid+beta-induced+impairment+of+mitochondrial+transport+in+hippocampal+neurons.">HDAC6 inhibitor blocks amyloid beta-induced impairment of mitochondrial transport in hippocampal neurons.</a> PLoS One. 7 (8), (2012).</li><li>Kawaguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+deacetylase+HDAC6+regulates+aggresome+formation+and+cell+viability+in+response+to+misfolded+protein+stress.">The deacetylase HDAC6 regulates aggresome formation and cell viability in response to misfolded protein stress.</a> Cell. 115 (6), 727-738 (2003).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylation+of+p53+at+lysine+373/382+by+the+histone+deacetylase+inhibitor+depsipeptide+induces+expression+of+p21(Waf1/Cip1).">Acetylation of p53 at lysine 373/382 by the histone deacetylase inhibitor depsipeptide induces expression of p21(Waf1/Cip1).</a> Mol Cell Biol. 26 (7), 2782-2790 (2006).</li><li>Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+modifications+in+transcriptional+regulation.">Histone modifications in transcriptional regulation.</a> Curr Opin Genet Dev. 12 (2), 142-148 (2002).</li><li>Sim&#245;es-Pires, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC6+as+a+target+for+neurodegenerative+diseases:+what+makes+it+different+from+the+other+HDACs?.">HDAC6 as a target for neurodegenerative diseases: what makes it different from the other HDACs?.</a> Mol Neurodegener. 8 (7), 1-16 (2013).</li><li>Mottamal, M., Zheng, S., Huang, T. L., Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+inhibitors+in+clinical+studies+as+templates+for+new+anticancer+agents.">Histone deacetylase inhibitors in clinical studies as templates for new anticancer agents.</a> Molecules. 20 (3), 3898-3941 (2015).</li><li>Manal, M., Chandrasekar, M. J., Gomathi Priya, J., Nanjan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+histone+deacetylase+as+antitumor+agents:+A+critical+review.">Inhibitors of histone deacetylase as antitumor agents: A critical review.</a> Bioorg Chem. 67, 18-42 (2016).</li><li>Mack, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+selectivity+and+beyond.">To selectivity and beyond.</a> Nat Biotech. 28 (12), 1259-1266 (2010).</li><li>. Study of ACY-1215 alone and in combination with bortezomib and dexamethasone in multiple myeloma (ACY-1215) Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01323751">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01323751</a> (1211)</li><li>. Study of ACY-1215 in combination with lenalidomide, and dexamethasone in multiple myeloma Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01583283">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01583283</a> (2012)</li><li>. 13ACY-1215 (ricolinostat) in combination with pomalidomide and low-dose dex in relapsed-and-refractory multiple myeloma Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01997840">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01997840</a> (2013)</li><li>. Study of ACY-241 alone and in combination with pomalidomide and dexamethasone in multiple myeloma Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02400242">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02400242</a> (2015)</li><li>Yee, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ricolinostat+plus+lenalidomide,+and+dexamethasone+in+relapsed+or+refractory+multiple+myeloma:+a+multicentre+phase+1b+trial.">Ricolinostat plus lenalidomide, and dexamethasone in relapsed or refractory multiple myeloma: a multicentre phase 1b trial.</a> Lancet Oncol. 17 (11), 1569-1578 (2016).</li><li>Jung, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogenous+non-isotopic+assays+for+histone+deacetylase+activity.">Homogenous non-isotopic assays for histone deacetylase activity.</a> Expert Opin Ther Pat. 13 (6), 935 (2003).</li><li>Zwick, V., Sim&#245;es-Pires, C., Cuendet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+multi-substrate+assay+coupled+to+UHPLC-ESI-MS/MS+for+a+quick+identification+of+class-specific+HDAC+inhibitors.">Cell-based multi-substrate assay coupled to UHPLC-ESI-MS/MS for a quick identification of class-specific HDAC inhibitors.</a> J Enzyme Inhibi Med Chem. 31 (1), 209-214 (2016).</li><li>Khan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+class+and+isoform+selectivity+of+small-molecule+histone+deacetylase+inhibitors.">Determination of the class and isoform selectivity of small-molecule histone deacetylase inhibitors.</a> Biochem J. 409 (2), 581-589 (2008).</li><li>Glaser, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+protein+acetylation+induced+by+novel+histone+deacetylase+inhibitors.">Differential protein acetylation induced by novel histone deacetylase inhibitors.</a> Biochem Biophys Res Commun. 325 (3), 683-690 (2004).</li><li>Butler, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+and+simple+chemistry+yield+a+superior,+neuroprotective+HDAC6+inhibitor,+tubastatin+A.">Rational design and simple chemistry yield a superior, neuroprotective HDAC6 inhibitor, tubastatin A.</a> J Am Chem Soc. 132 (31), 10842-10846 (2010).</li><li>Jung, M., Yong, K. -. J., Velena, A., Lee, S., Sippl, W., Jung, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Based+Assays+for+HDAC+Inhibitor+Hit+Validation.">Cell-Based Assays for HDAC Inhibitor Hit Validation.</a> Epigenetic Targets in Drug Discovery. , (2010).</li><li>Milli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+cellular+response+to+novel+proapoptotic+agents+related+to+atypical+retinoids+in+human+IGROV-1+ovarian+carcinoma+cells.">Proteomic analysis of cellular response to novel proapoptotic agents related to atypical retinoids in human IGROV-1 ovarian carcinoma cells.</a> J Proteome Res. 10 (3), 1191-1207 (2011).</li><li>Zwick, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+a+selective+HDAC6+inhibitor+active+in+neuroblasts.">Synthesis of a selective HDAC6 inhibitor active in neuroblasts.</a> Bioorg Med Chem Lett. 26 (20), 4955-4959 (2016).</li><li>Ciossek, T., Julius, H., Wieland, H., Maier, T., Beckers, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+homogeneous+cellular+histone+deacetylase+assay+suitable+for+compound+profiling+and+robotic+screening.">A homogeneous cellular histone deacetylase assay suitable for compound profiling and robotic screening.</a> Anal Biochem. 372 (1), 72-81 (2008).</li><li>Heltweg, B., Dequiedt, F., Marshall, B. L., Brauch, C., Yoshida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype+selective+substrates+for+histone+deacetylases.">Subtype selective substrates for histone deacetylases.</a> J Med Chem. 47 (21), 5235-5243 (2004).</li><li>Copeland, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Evaluation of enzyme inhibitors in drug discovery. , (2005).</li></ol>

تثبيط هداك موضوع ساخن في اكتشاف المخدرات، مع تركيز الحالي على مثبطات HDAC6 الانتقائي ل علاج السرطان21. عادة ما يتم تقييم الانتقائية هداك بسلسلة من فحوصات الفائق، والخلية الحرة، التي تنوي تحديد فاعلية مثبطة نحو الفردية هداك isoforms21. ولكن انتقائية المانع يجب بالإضافة إ...

هداكس تنتمي إلى عائلة من الإنزيمات قادرة على ديسيتيلاتي هيستونيس داخل الهيكل الكروماتين. كما لدى غيرها ركائز البروتين سيتوسول وتقع في مختلف أقسام الخلية. إجمالي 18 هداك isoforms أنه تم التعرف حتى الآن وقد تم تتصل عدة آليات الخلية، بما في ذلك تنظيم عوامل النسخ والتعبير الجيني، فضلا عن إشارات الخلية والنقل1،2،3،،من45،،من67. مثبطات الحفاز هداك ظهرت كالعقاقير العلاجية المحتملة لعلاج السرطان. معظم مثبطات هداك معتمدة حاليا من قبل إدارة الأغذية والعقاقير لعلاج الأورام اللمفاوية تي خلية والورم النخاعي المتعدد، ومثبطات هداك غير محددة، مثل فورينوستات (ساها) وبيلينوستات وبانوبينوستات،من89. ومع ذلك، سلسلة من الآثار الجانبية ارتبطت مثبطات عموم، والبحث عن جزيئات صغيرة محددة isoform موضوع ساخن في اكتشاف الكيمياء والعقاقير الطبية. وبناء على ذلك، الفئة أنا روميديبسين مثبط انتقائي (HDAC1 3 و HDAC8) هو المخدرات معتمدة بالفعل10، بينما مثبطات HDAC6 محددة حاليا قيد التجارب السريرية، مع زيادة الإمكانات العلاجية في المايلوما11،،من1213،،من1415.
مثبطات تستند في الحضانة الركيزة هداك مع مصدر الانزيمية (isoform واحد، واستخراج النووية، أو خلية ليستي) فحص فحوصات لتوصيف هداك. الركيزة عادة تسلسل ببتيد صغيرة التي تحتوي على بقايا يسين أسيتيل بالإضافة فلوروفوري كليفابل (مثل الكومارين)، مثل N-(4-methyl-7-aminocoumarinyl)-Nα-(t-butoxycarbonyl)-Nω-acetyllysineamide (مال)16. للتمييز بين الأنشطة الخاصة isoform، فحوصات منفصلة الخلية الحرة التي تشمل كل isoform ضرورية، وقد لا تعكس نشاط isoform الحقيقية في الخلايا الحية. ركائز Isoform محددة متاحة تجارياً، مثل البنزيل (S)-[1-(4-methyl-2-oxo-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)-5-propionylaminopentyl]carbamate (موكباك، HDAC1 الركازة محددة) و (إستر حامض ثالثي-بوتيل S)-[5-acetylamino-1-(2-oxo-4-trifluoromethyl-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)pentyl]carbamic (باتكب، الركيزة محددة HDAC6) (الشكل 1B). ومع ذلك، خليط متعدد الركيزة التي تحتوي على القانون النموذجي للتحكيم، موكباك، ونظرا لأن الخلايا الحية باتكب لن يسمح الكشف عن المنتجات ديسيتيلاتيد الفردية بالقياس فلوروميتريك، نظراً لأن تتحمل فلوروفوري كليفابل نفس.
الأسلوب الموصوفة هنا يسمح للكشف والتحديد الكمي النسبي لكل الركيزة ومنتجاتها ديسيتيلاتيد في خلايا هيلا باستخدام مقايسة الركازة متعدد متبوعاً أوهبلك-ESI-MS/MS تحليل17. ويجري مقايسة هداك على خلايا هيلا للتمكين من التعرف مباشرة النشاط المثبطة هداك والخصوصية لاختبار المركبات على هداكس الذاتية. هناك تركيز على HDAC1 و HDAC6، والتي يتم تقييمها في وقت واحد. لتحقيق هذه القياسات الانزيمية في مقايسة حضانة واحدة، يتم إضافة خليط ركائز هداك غير محددة ومعينة إلى المعالجة وخلايا هيلا مطلي على لوحة 96-جيدا. في أعقاب خطوة حضانة، يتم تفكيك الخلايا على الإفراج ركائز ومنتجاتها رد فعل كل منهما، التي يتم فصلها والكشف عن استخدام أسلوب أوهبلك--مرض التصلب العصبي المتعدد (الشكل 1). منتجات ديسيتيلاتيد من ركائز القانون النموذجي للتحكيم، وموكباك، وباتكب هي مال ديسيتيلاتيد (دمال)، موكباك ديسيتيلاتيد (دموكباك) وباتكب ديسيتيلاتيد (دباتكب)، على التوالي. ويمكن بناء منحنيات الاستجابة للجرعة مع المركبات النشطة.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55878/55878fig1.jpg"> 
رقم 1: المخطط العام للمقايسة هداك يستند إلى الخلية لتحديد مثبطات محددة HDAC1 و HDAC6 بتحليل أوهبلك--مرض التصلب العصبي المتعدد من ركائز متعددة. (أ) مخطط نموذجي 96-جيدا لوحة يتضمن معاملة (اختبار المركبات) وخلايا هيلا غير المعالجة (مراقبة)، فضلا عن الفراغات خالية من الخلية. (ب) التركيب الكيميائي لركائز إضافة إلى أن ديسيتيلاتيد هداكس الذاتية كخليط (21 ميكرومتر في كل). (ج) chromatogram MS أوهبلك نموذجية تظهر القمم من ركائز المضافة (القانون النموذجي للتحكيم وموكباك وباتكب) ومنتجاتها ديسيتيلاتيد (دمال، دموكباك، ودباكتب، على التوالي). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55878/55878fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="887">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">BATCP</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">B4061</td>
			<td style="width:273px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MAL</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>SCP0168</td>
			<td>Synonym: BOC-Ac-Lys-AMC&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">MOCPAC</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">MS275</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">EPS002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Trichostatin A</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">T8552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Tubastatin A</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">SML0044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Acetonitrile, HPLC grade</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:152px;">10660131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Formic acid, LC/MS grade</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:152px;">10596814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:271px;">H2O, HPLC grade</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>distilled H2O filtered through a Milli-Q purification system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">HeLa cells</td>
			<td style="width:191px;">ATCC</td>
			<td style="width:152px;">ATCC CRM-CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell dissociation reagent TrypLE Express</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:152px;">12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">DMSO, cell culture grade</td>
			<td style="width:191px;">Applichem</td>
			<td style="width:152px;">146463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">DPBS</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Biowest</td>
			<td>S1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">MEM</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22561021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:191px;">Bioconcept</td>
			<td>4-01F00-H&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10X RIPA buffer</td>
			<td style="width:191px;">Abcam</td>
			<td style="width:152px;">ab156034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">SigmaFast protease inhibitor tablets</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">S8820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">96-well plates, sterile, flat-bottom, tissue culture treated Corning</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:152px;">29442-058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">96-well plates, non-sterile, V-bottom Corning</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:152px;">29442-404</td>
			<td>used in the centrifugation step</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">96-well plate, conical bottom, Nunc</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:152px;">249944</td>
			<td>compatible with the Acquity UHPLC system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">T75&#160; cell culture flasks Corning</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">CLS430641&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Peelable heat sealing foil&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Waters</td>
			<td style="width:152px;">186002789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Acquity UPLC system</td>
			<td style="width:191px;">Waters</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Eppendorf Centrifuge 5810 R</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:152px;">05-413-323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Integration software: MassLynx V4.1</td>
			<td style="width:191px;">Waters</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>Catalog number not available</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Combi thermo-sealer SP-0669/240</td>
			<td style="width:191px;">Waters</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>Catalog number not available</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Quattro micro API Tandem Quadrupole System</td>
			<td style="width:191px;">Waters</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>Catalog number not available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous measurement of hdac1 and hdac6 activity in hela cells using uhplc-ms

البحث عن جديد هيستون deacetylase (هداك) مثبطات زيادة الاهتمام باكتشاف العقاقير. تم الانتقائية Isoform في دائرة الضوء منذ الموافقة على روميديبسين، فئة أنا هداك مثبط لعلاج السرطان، والتحقيق السريرية من مثبطات HDAC6 محددة للورم النخاعي المتعدد. يتم استخدام الأسلوب الحالي لتحديد النشاط المثبطة لاختبار المركبات في HDAC1 و HDAC6 في الخلايا. ويقاس النشاط isoform استخدام فائقة الأداء اللوني السائل – تحليل الطيف الكتلي (أوهبلك مللي ثانية) من ركائز محددة المحتضنة مع خلايا هيلا المعالجة وغير المعالجة. ويمتاز الأسلوب يعكس النشاط هداك الذاتية داخل بيئة الخلية، على عكس الخلية الحرة البيوكيميائية فحوصات أجريت على isoforms معزولة. وعلاوة على ذلك، لأنه يقوم على التحديد الكمي لركائز الاصطناعية، الطريقة لا تتطلب الاعتراف بالضد من البروتينات أسيتيلاتيد الذاتية. أنها قابلة للتكيف بسهولة إلى عدة خطوط الخلايا وعملية تلقائية. وقد أثبتت الأسلوب مفيداً في إيجاد مركبات HDAC6 انتقائية في نيوروبلاستس. وترد النتائج الممثلة هنا بمعيار هداك مثبطات تريتشوستاتين (غير محددة)، MS275 (HDAC1 الخاصة)، وتوباستاتين (HDAC6-محدد) باستخدام خلايا هيلا.

تثبت تطبيق الأسلوب على تحديد مثبطات انتقائية وغير انتقائي ل HDAC1 (الفئة الأولى) و HDAC6 (الفئة IIb)، خلايا هيلا تعامل مع المركبات القياسية المعروفة: تريتشوستاتين A (غير انتقائية بين HDAC1 و HDAC6)18، MS275 (HDAC1-الانتقائية المانع)19، وتوباستاتين (مثبط انتقائي HDAC6)<s...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS at JoVE.com

Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

الأسلوب الحالي يساعد على تحديد isoform خاصة مثبطات هيستون ديسيتيلاسيس (هداك) في خلايا هيلا بتحليل أوهبلك--مرض التصلب العصبي المتعدد من ركائز متعددة. هذا أسلوب خال من الأجسام المضادة ليعكس النشاط HDAC1 و HDAC6 في المعيشة البيئة الخلية، على النقيض من فحوصات خالية من خلية واحدة-إيسوفورم.

قياس واحد من HDAC1 والنشاط HDAC6 في الحلة الخلايا باستخدام أوهبلك--مرض التصلب العصبي المتعدد

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

ثابت للدولة، قبل المطرد للدولة، واحدة دوران قياس الحركية للنشاط الحمض النووي Glycosylase

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

بسيط وبروتوكول السريع لقياس الدهون في خلايا الطحالب المحايدة عن طريق الإسفار

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal ...

HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8217;-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

HPLC قياس الحمض النووي الأكسدة العلامات البيولوجية، 8 أوكسو 7،8-ثنائي هيدرو-2&#39;-deoxyguanosine، في الخلايا المستزرعة والأنسجة الحيوانية

Oxidative stress is associated with many physiological and pathological processes, as well as xenobiotic metabolism, leading to the oxidation of ...

Dynamic Electrochemical Measurement of Chloride Ions

ديناميكية الكهروكيميائية قياس كلوريد الأيونات

This protocol describes the dynamic measurement of chloride ions using the transition time of a silver silver chloride (Ag/AgCl) electrode. Silver silver ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

تسلسل مصنع ستريت Heteroxylans عن طريق إنزيمي، والمواد الكيميائية (مثلأيشن) والمادية (الطيف الكتلي، الرنين المغناطيسي النووي) تقنيات

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Fabrication and Testing of Photonic Thermometers

تصنيع واختبار الحرارة الضوئية

In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being ...

Disentangling High Strength Copolymer Aramid Fibers to Enable the Determination of Their Mechanical Properties

مقدر ألياف الاراميد كوبوليمر قوة عالية لتمكين تحديد خواصها الميكانيكية

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to ...

High Resolution Physical Characterization of Single Metallic Nanoparticles

التوصيف الفيزيائي عالي الاستبانة للجسيمات النانوية المعدنية المفردة

Individual molecules can be detected and characterized by measuring the degree by which they reduce the ionic current flowing through a single ...

A New Straightforward Method for Lipophilicity (logP) Measurement using 19F NMR Spectroscopy

A New Straightforward Method for Lipophilicity logP Measurement using 19F NMR Spectroscopy

أسلوب مباشر جديد لقياس أجسام (logP) باستخدام 19"و مطيافية الرنين المغناطيسي النووي"

Fluorination has become an effective tool to optimize physicochemical properties of bioactive compounds. One of the applications of fluorine introduction ...

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR القائمة على تحليل النشاط لتحديد تثبيط مركب, قيم IC50, نشاط Artifactual, ونشاط الخلية الكاملة من النوكليوسيد الريبوهيدرولاسيس

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment ...