Name: simultaneous measurement of hdac1 and hdac6 activity in hela cells using uhplc-ms
Uploaded: 2017-08-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS at JoVE.com

लेखक लागत क्रिया CM1406 स्वीकार करते हैं (Epigenetic रासायनिक जीव विज्ञान)। शोध में इस प्रकाशन की सूचना पियरे Mercier फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था।

1. सेल संस्कृति
नोट: निम्न चरणों का पालन एक मानक टिशू कल्चर हुड में प्रदर्शन कर रहे हैं। बाँझ तकनीक के साथ अपनेपन की उम्मीद है।
<ol>
	<li>HeLa कोशिकाओं T75 सेल संस्कृति कुप्पी में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के ...

<ol>
	<li>Arrowsmith, C. H., Bountra, C., Fish, P. V., Lee, K., Schapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+protein+families:+a+new+frontier+for+drug+discovery.">Epigenetic protein families: a new frontier for drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 11 (5), 384-400 (2012).</li><li>Henikoff, S., Greally, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics,+cellular+memory+and+gene+regulation.">Epigenetics, cellular memory and gene regulation.</a> Curr Biol. 26 (14), R644-R648 (2016).</li><li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC6+inhibitor+blocks+amyloid+beta-induced+impairment+of+mitochondrial+transport+in+hippocampal+neurons.">HDAC6 inhibitor blocks amyloid beta-induced impairment of mitochondrial transport in hippocampal neurons.</a> PLoS One. 7 (8), (2012).</li><li>Kawaguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+deacetylase+HDAC6+regulates+aggresome+formation+and+cell+viability+in+response+to+misfolded+protein+stress.">The deacetylase HDAC6 regulates aggresome formation and cell viability in response to misfolded protein stress.</a> Cell. 115 (6), 727-738 (2003).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylation+of+p53+at+lysine+373/382+by+the+histone+deacetylase+inhibitor+depsipeptide+induces+expression+of+p21(Waf1/Cip1).">Acetylation of p53 at lysine 373/382 by the histone deacetylase inhibitor depsipeptide induces expression of p21(Waf1/Cip1).</a> Mol Cell Biol. 26 (7), 2782-2790 (2006).</li><li>Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+modifications+in+transcriptional+regulation.">Histone modifications in transcriptional regulation.</a> Curr Opin Genet Dev. 12 (2), 142-148 (2002).</li><li>Sim&#245;es-Pires, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC6+as+a+target+for+neurodegenerative+diseases:+what+makes+it+different+from+the+other+HDACs?.">HDAC6 as a target for neurodegenerative diseases: what makes it different from the other HDACs?.</a> Mol Neurodegener. 8 (7), 1-16 (2013).</li><li>Mottamal, M., Zheng, S., Huang, T. L., Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+inhibitors+in+clinical+studies+as+templates+for+new+anticancer+agents.">Histone deacetylase inhibitors in clinical studies as templates for new anticancer agents.</a> Molecules. 20 (3), 3898-3941 (2015).</li><li>Manal, M., Chandrasekar, M. J., Gomathi Priya, J., Nanjan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+histone+deacetylase+as+antitumor+agents:+A+critical+review.">Inhibitors of histone deacetylase as antitumor agents: A critical review.</a> Bioorg Chem. 67, 18-42 (2016).</li><li>Mack, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+selectivity+and+beyond.">To selectivity and beyond.</a> Nat Biotech. 28 (12), 1259-1266 (2010).</li><li>. Study of ACY-1215 alone and in combination with bortezomib and dexamethasone in multiple myeloma (ACY-1215) Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01323751">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01323751</a> (1211)</li><li>. Study of ACY-1215 in combination with lenalidomide, and dexamethasone in multiple myeloma Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01583283">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01583283</a> (2012)</li><li>. 13ACY-1215 (ricolinostat) in combination with pomalidomide and low-dose dex in relapsed-and-refractory multiple myeloma Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01997840">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01997840</a> (2013)</li><li>. Study of ACY-241 alone and in combination with pomalidomide and dexamethasone in multiple myeloma Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02400242">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02400242</a> (2015)</li><li>Yee, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ricolinostat+plus+lenalidomide,+and+dexamethasone+in+relapsed+or+refractory+multiple+myeloma:+a+multicentre+phase+1b+trial.">Ricolinostat plus lenalidomide, and dexamethasone in relapsed or refractory multiple myeloma: a multicentre phase 1b trial.</a> Lancet Oncol. 17 (11), 1569-1578 (2016).</li><li>Jung, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogenous+non-isotopic+assays+for+histone+deacetylase+activity.">Homogenous non-isotopic assays for histone deacetylase activity.</a> Expert Opin Ther Pat. 13 (6), 935 (2003).</li><li>Zwick, V., Sim&#245;es-Pires, C., Cuendet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+multi-substrate+assay+coupled+to+UHPLC-ESI-MS/MS+for+a+quick+identification+of+class-specific+HDAC+inhibitors.">Cell-based multi-substrate assay coupled to UHPLC-ESI-MS/MS for a quick identification of class-specific HDAC inhibitors.</a> J Enzyme Inhibi Med Chem. 31 (1), 209-214 (2016).</li><li>Khan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+class+and+isoform+selectivity+of+small-molecule+histone+deacetylase+inhibitors.">Determination of the class and isoform selectivity of small-molecule histone deacetylase inhibitors.</a> Biochem J. 409 (2), 581-589 (2008).</li><li>Glaser, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+protein+acetylation+induced+by+novel+histone+deacetylase+inhibitors.">Differential protein acetylation induced by novel histone deacetylase inhibitors.</a> Biochem Biophys Res Commun. 325 (3), 683-690 (2004).</li><li>Butler, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+and+simple+chemistry+yield+a+superior,+neuroprotective+HDAC6+inhibitor,+tubastatin+A.">Rational design and simple chemistry yield a superior, neuroprotective HDAC6 inhibitor, tubastatin A.</a> J Am Chem Soc. 132 (31), 10842-10846 (2010).</li><li>Jung, M., Yong, K. -. J., Velena, A., Lee, S., Sippl, W., Jung, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Based+Assays+for+HDAC+Inhibitor+Hit+Validation.">Cell-Based Assays for HDAC Inhibitor Hit Validation.</a> Epigenetic Targets in Drug Discovery. , (2010).</li><li>Milli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+cellular+response+to+novel+proapoptotic+agents+related+to+atypical+retinoids+in+human+IGROV-1+ovarian+carcinoma+cells.">Proteomic analysis of cellular response to novel proapoptotic agents related to atypical retinoids in human IGROV-1 ovarian carcinoma cells.</a> J Proteome Res. 10 (3), 1191-1207 (2011).</li><li>Zwick, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+a+selective+HDAC6+inhibitor+active+in+neuroblasts.">Synthesis of a selective HDAC6 inhibitor active in neuroblasts.</a> Bioorg Med Chem Lett. 26 (20), 4955-4959 (2016).</li><li>Ciossek, T., Julius, H., Wieland, H., Maier, T., Beckers, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+homogeneous+cellular+histone+deacetylase+assay+suitable+for+compound+profiling+and+robotic+screening.">A homogeneous cellular histone deacetylase assay suitable for compound profiling and robotic screening.</a> Anal Biochem. 372 (1), 72-81 (2008).</li><li>Heltweg, B., Dequiedt, F., Marshall, B. L., Brauch, C., Yoshida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype+selective+substrates+for+histone+deacetylases.">Subtype selective substrates for histone deacetylases.</a> J Med Chem. 47 (21), 5235-5243 (2004).</li><li>Copeland, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Evaluation of enzyme inhibitors in drug discovery. , (2005).</li></ol>

HDAC निषेध दवाओं की खोज, कैंसर थेरेपी21के लिए HDAC6-चयनात्मक inhibitors पर वर्तमान ध्यान के साथ में एक गर्म विषय है। HDAC selectivity आमतौर पर हाई-थ्रूपुट, सेल-मुक्त assays, जो अलग-अलग HDAC isoforms21की ओर निरोधात्मक शक्ति न...

HDACs एंजाइमों histones chromatin संरचना के भीतर deacetylate कर के एक परिवार के हैं। वे भी अन्य प्रोटीन substrates में cytosol है और विभिन्न सेल डिब्बों में स्थित हैं। कुल 18 HDAC isoforms की अब तक पहचान की गई है और कई सेल तंत्र, प्रतिलेखन कारकों और जीन अभिव्यक्ति, अच्छी तरह के रूप में सेल सिग्नलिंग के विनियमन शामिल करने के लिए संबंधित किया गया है और1,2,3,4,5,6,7परिवहन। HDAC उत्प्रेरक inhibitors कैंसर थेरेपी के लिए संभावित चिकित्सीय दवाओं के रूप में उभरा है। वर्तमान में एफडीए द्वारा अनुमोदित सबसे HDAC inhibitors T-कोशिका लिंफोमा और एकाधिक myeloma के उपचार के लिए कर रहे हैं, और गैर-विशिष्ट HDAC inhibitors की तरह, जैसे vorinostat (साहा), belinostat, और panobinostat8,9कर रहे हैं। हालांकि, पक्ष प्रभाव की एक श्रृंखला पैन-inhibitors के साथ संबद्ध किया गया है, और isoform-विशिष्ट छोटे अणुओं के लिए खोज औषधीय रसायन और दवा की खोज में एक गर्म विषय है। तदनुसार, कक्षा मैं (HDAC1-3 और HDAC8) चयनात्मक अवरोध करनेवाला romidepsin है एक पहले से ही अनुमोदित दवा10, जबकि HDAC6-विशिष्ट inhibitors नैदानिक परीक्षणों, एकाधिक myeloma11,12,13,14,15में बढ़ी हुई चिकित्सीय क्षमता के साथ के अंतर्गत वर्तमान में कर रहे हैं।
Assays HDAC विशेषताएँ करने के लिए स्क्रीनिंग inhibitors (एकल isoform, परमाणु निकालें या सेल lysate) एक एंजाइमी स्रोत के साथ एक HDAC सब्सट्रेट के इन्क्यूबेशन पर आधारित हैं। सब्सट्रेट आमतौर पर एक cleavable fluorophore (उदा., coumarin), करने के लिए मिलकर एक एसिटाइल lysine अवशेषों से युक्त एक छोटे पेप्टाइड अनुक्रम है जैसे N-(4-methyl-7-aminocoumarinyl)-Nα-(t-butoxycarbonyl)-Nω-acetyllysineamide (मल)16। Isoform-विशिष्ट गतिविधियों के बीच अंतर करने के लिए अलग सेल मुक्त assays प्रत्येक isoform से संबंधित जरूरी हैं और जीवित कोशिकाओं में असली isoform गतिविधि को प्रतिबिंबित नहीं हो सकता है। Isoform-विशिष्ट substrates benzyl जैसे व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं (S)-[1-(4-methyl-2-oxo-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)-5-propionylaminopentyl]carbamate (MOCPAC, HDAC1 विशिष्ट सब्सट्रेट) और (S)-[5-acetylamino-1-(2-oxo-4-trifluoromethyl-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)pentyl]carbamic एसिड टर्ट-ब्यूटाइल एस्टर (BATCP, HDAC6 विशिष्ट सब्सट्रेट) (आंकड़ा 1B)। यह देखते हुए कि वे एक ही cleavable fluorophore सहन हालांकि, एक बहु सब्सट्रेट मिश्रण युक्त मल, MOCPAC, और BATCP करने के लिए जीवित कोशिकाओं को देखते हुए अलग-अलग deacetylated उत्पादों का पता लगाने fluorometric माप द्वारा, की अनुमति नहीं होगी।
यहाँ वर्णित विधि का पता लगाने और प्रत्येक सब्सट्रेट और HeLa कोशिकाओं UHPLC-ईएसआई-MS/MS विश्लेषण17द्वारा पीछा किया एक बहु सब्सट्रेट परख का उपयोग में इसके deacetylated उत्पाद के सापेक्ष मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है। एक HDAC परख HDAC निरोधात्मक गतिविधि अंतर्जात HDACs पर परीक्षण यौगिकों की विशिष्टता की और सीधे पहचान सक्षम करने के लिए HeLa कोशिकाओं पर आयोजित किया जाता है। HDAC1 और HDAC6, जो एक साथ मूल्यांकन कर रहे हैं पर ध्यान केंद्रित है। एक एकल ऊष्मायन परख में इन एंजाइमी माप को प्राप्त करने के लिए, गैर-विशिष्ट और विशिष्ट HDAC substrates के एक मिश्रण एक 96-अच्छी तरह से थाली पर चढ़ाया इलाज किया और इलाज HeLa कोशिकाओं को जोड़ा जाता है। एक इन्क्यूबेशन कदम निम्नलिखित कोशिकाओं substrates और उनके संबंधित प्रतिक्रिया उत्पादों जो अलग हो रहे हैं और एक UHPLC-MS विधि (चित्र c 1को इंगित) का उपयोग कर पाया, जारी करने के लिए lysed हैं। मल, MOCPAC, और BATCP substrates के deacetylated उत्पादों deacetylated मल (dMAL), deacetylated MOCPAC (dMOCPAC), और deacetylated BATCP (dBATCP), क्रमशः रहे हैं। खुराक-प्रतिक्रिया घटता सक्रिय यौगिकों के साथ बनाया जा सकता है।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55878/55878fig1.jpg"> 
आकृति 1: एकाधिक substrates के UHPLC-MS विश्लेषण द्वारा HDAC1 - और HDAC6-विशिष्ट inhibitors की पहचान करने के लिए कक्ष-आधारित HDAC परख के लिए सामान्य योजना. (A) योजना के एक ठेठ 96-अच्छी तरह से प्लेट इलाज (परीक्षण यौगिकों) युक्त और अनुपचारित (नियंत्रण) HeLa कोशिकाओं, के साथ ही फ़्री सेल रिक्त स्थान। (B) substrates एक मिश्रण (21 सुक्ष्ममापी प्रत्येक) के रूप में अंतर्जात HDACs द्वारा deacetylated किया जा करने के लिए जोड़ा की रासायनिक संरचना। (C) विशिष्ट UHPLC-MS chromatogram (मल, MOCPAC, और BATCP) जोड़ा गया substrates और अपने deacetylated उत्पादों की चोटियों दिखा रहा है (dMAL, dMOCPAC, और dBACTP, क्रमशः)। <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55878/55878fig1large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="887">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">BATCP</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">B4061</td>
			<td style="width:273px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MAL</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>SCP0168</td>
			<td>Synonym: BOC-Ac-Lys-AMC&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">MOCPAC</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">MS275</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">EPS002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Trichostatin A</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">T8552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Tubastatin A</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">SML0044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Acetonitrile, HPLC grade</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:152px;">10660131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Formic acid, LC/MS grade</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:152px;">10596814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:271px;">H2O, HPLC grade</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>distilled H2O filtered through a Milli-Q purification system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">HeLa cells</td>
			<td style="width:191px;">ATCC</td>
			<td style="width:152px;">ATCC CRM-CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell dissociation reagent TrypLE Express</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:152px;">12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">DMSO, cell culture grade</td>
			<td style="width:191px;">Applichem</td>
			<td style="width:152px;">146463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">DPBS</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Biowest</td>
			<td>S1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">MEM</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22561021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:191px;">Bioconcept</td>
			<td>4-01F00-H&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10X RIPA buffer</td>
			<td style="width:191px;">Abcam</td>
			<td style="width:152px;">ab156034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">SigmaFast protease inhibitor tablets</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">S8820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">96-well plates, sterile, flat-bottom, tissue culture treated Corning</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:152px;">29442-058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">96-well plates, non-sterile, V-bottom Corning</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:152px;">29442-404</td>
			<td>used in the centrifugation step</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">96-well plate, conical bottom, Nunc</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:152px;">249944</td>
			<td>compatible with the Acquity UHPLC system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">T75&#160; cell culture flasks Corning</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">CLS430641&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Peelable heat sealing foil&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Waters</td>
			<td style="width:152px;">186002789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Acquity UPLC system</td>
			<td style="width:191px;">Waters</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Eppendorf Centrifuge 5810 R</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:152px;">05-413-323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Integration software: MassLynx V4.1</td>
			<td style="width:191px;">Waters</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>Catalog number not available</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Combi thermo-sealer SP-0669/240</td>
			<td style="width:191px;">Waters</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>Catalog number not available</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Quattro micro API Tandem Quadrupole System</td>
			<td style="width:191px;">Waters</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>Catalog number not available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous measurement of hdac1 and hdac6 activity in hela cells using uhplc-ms

दवाओं की खोज में रुचि बढ़ाने के नए histone deacetylase (HDAC) inhibitors के लिए खोज है। Isoform selectivity romidepsin, एक वर्ग के अनुमोदन के बाद से सुर्खियों में रहा है मैं HDAC कैंसर थेरेपी, और एकाधिक myeloma के लिए HDAC6-विशिष्ट inhibitors की नैदानिक जांच के लिए अवरोध करनेवाला। वर्तमान पद्धति पर HDAC1 और HDAC6 कोशिकाओं में परीक्षण यौगिकों की निरोधात्मक गतिविधि निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है। Isoform गतिविधि अल्ट्रा उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (UHPLC-MS) के साथ इलाज किया और इलाज HeLa कोशिकाओं incubated विशिष्ट substrates के विश्लेषण का उपयोग करके मापा जाता है। विधि कक्ष पर्यावरण, जैव रासायनिक सेल मुक्त assays पर अलग isoforms आयोजित विपरीत भीतर अंतर्जात HDAC गतिविधि को दर्शाती का फायदा है। क्योंकि यह सिंथेटिक substrates के मात्रा का ठहराव पर आधारित है, इसके अलावा, विधि एंटीबॉडी अंतर्जात acetylated प्रोटीन की पहचान की आवश्यकता नहीं है। यह आसानी से कई सेल लाइनों और एक स्वचालित प्रक्रिया के लिए अनुकूल है। विधि पहले से ही neuroblasts में HDAC6-चयनात्मक यौगिकों को खोजने में उपयोगी साबित कर दिया है। प्रतिनिधि परिणाम यहाँ दिखाए गए हैं मानक HDAC inhibitors trichostatin के साथ एक (गैर विशेष), MS275 (HDAC1-विशिष्ट), और tubastatin (HDAC6-विशिष्ट) HeLa कोशिकाओं का उपयोग कर।

HDAC1 के लिए गैर-चयनात्मक और चयनात्मक inhibitors की पहचान करने के लिए आवेदन की विधि का प्रदर्शन करने के लिए (कक्षा) और HDAC6 (वर्ग IIb), HeLa कोशिकाओं ज्ञात मानक यौगिकों के साथ इलाज किया गया: trichostatin A (गैर-चयनात्मक HDAC...

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Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

Isoform-विशिष्ट inhibitors HeLa कोशिकाओं में histone deacetylases (HDAC) के एकाधिक substrates के UHPLC-MS विश्लेषण द्वारा की पहचान करने के लिए वर्तमान पद्धति है कार्य करता है। यह एक एंटीबॉडी-मुक्त विधि में रहने वाले HDAC1 और HDAC6 गतिविधि को प्रतिबिंबित करने के लिए विकसित किया है सेल पर्यावरण, एकल-isoform सेल-नि: शुल्क assays के विपरीत।

युगपत और माप के HDAC1 HeLa में HDAC6 गतिविधि कक्ष का उपयोग कर UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

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