Name: simultaneous measurement of hdac1 and hdac6 activity in hela cells using uhplc-ms
Uploaded: 2017-08-10T12:30:00
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著者認めるコスト アクション CM1406 (エピジェネティックな化学生物学)。この出版物で報告された研究は、ピエール ・ メルシエ財団によって支えられました。

1. 細胞培養
注: 次の手順は、標準のティッシュ文化フードで実行されます。生殖不能の技術に精通するいるとされます。
<ol>
	<li>10% 牛胎児血清ペニシリン G を添加した MEM でコート t75 フラスコ細胞培養用フラスコの 80% の confluency に HeLa 細胞の培養 (100 U/mL) とストレプトマイシン (100 mg/mL)。 注: セル文化、治療、および換散の手順は 5% CO2無菌条件下での加湿?...

<ol>
	<li>Arrowsmith, C. H., Bountra, C., Fish, P. V., Lee, K., Schapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+protein+families:+a+new+frontier+for+drug+discovery.">Epigenetic protein families: a new frontier for drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 11 (5), 384-400 (2012).</li><li>Henikoff, S., Greally, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics,+cellular+memory+and+gene+regulation.">Epigenetics, cellular memory and gene regulation.</a> Curr Biol. 26 (14), R644-R648 (2016).</li><li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC6+inhibitor+blocks+amyloid+beta-induced+impairment+of+mitochondrial+transport+in+hippocampal+neurons.">HDAC6 inhibitor blocks amyloid beta-induced impairment of mitochondrial transport in hippocampal neurons.</a> PLoS One. 7 (8), (2012).</li><li>Kawaguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+deacetylase+HDAC6+regulates+aggresome+formation+and+cell+viability+in+response+to+misfolded+protein+stress.">The deacetylase HDAC6 regulates aggresome formation and cell viability in response to misfolded protein stress.</a> Cell. 115 (6), 727-738 (2003).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylation+of+p53+at+lysine+373/382+by+the+histone+deacetylase+inhibitor+depsipeptide+induces+expression+of+p21(Waf1/Cip1).">Acetylation of p53 at lysine 373/382 by the histone deacetylase inhibitor depsipeptide induces expression of p21(Waf1/Cip1).</a> Mol Cell Biol. 26 (7), 2782-2790 (2006).</li><li>Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+modifications+in+transcriptional+regulation.">Histone modifications in transcriptional regulation.</a> Curr Opin Genet Dev. 12 (2), 142-148 (2002).</li><li>Sim&#245;es-Pires, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC6+as+a+target+for+neurodegenerative+diseases:+what+makes+it+different+from+the+other+HDACs?.">HDAC6 as a target for neurodegenerative diseases: what makes it different from the other HDACs?.</a> Mol Neurodegener. 8 (7), 1-16 (2013).</li><li>Mottamal, M., Zheng, S., Huang, T. L., Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+inhibitors+in+clinical+studies+as+templates+for+new+anticancer+agents.">Histone deacetylase inhibitors in clinical studies as templates for new anticancer agents.</a> Molecules. 20 (3), 3898-3941 (2015).</li><li>Manal, M., Chandrasekar, M. J., Gomathi Priya, J., Nanjan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+histone+deacetylase+as+antitumor+agents:+A+critical+review.">Inhibitors of histone deacetylase as antitumor agents: A critical review.</a> Bioorg Chem. 67, 18-42 (2016).</li><li>Mack, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+selectivity+and+beyond.">To selectivity and beyond.</a> Nat Biotech. 28 (12), 1259-1266 (2010).</li><li>. Study of ACY-1215 alone and in combination with bortezomib and dexamethasone in multiple myeloma (ACY-1215) Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01323751">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01323751</a> (1211)</li><li>. Study of ACY-1215 in combination with lenalidomide, and dexamethasone in multiple myeloma Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01583283">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01583283</a> (2012)</li><li>. 13ACY-1215 (ricolinostat) in combination with pomalidomide and low-dose dex in relapsed-and-refractory multiple myeloma Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01997840">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01997840</a> (2013)</li><li>. Study of ACY-241 alone and in combination with pomalidomide and dexamethasone in multiple myeloma Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02400242">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02400242</a> (2015)</li><li>Yee, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ricolinostat+plus+lenalidomide,+and+dexamethasone+in+relapsed+or+refractory+multiple+myeloma:+a+multicentre+phase+1b+trial.">Ricolinostat plus lenalidomide, and dexamethasone in relapsed or refractory multiple myeloma: a multicentre phase 1b trial.</a> Lancet Oncol. 17 (11), 1569-1578 (2016).</li><li>Jung, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogenous+non-isotopic+assays+for+histone+deacetylase+activity.">Homogenous non-isotopic assays for histone deacetylase activity.</a> Expert Opin Ther Pat. 13 (6), 935 (2003).</li><li>Zwick, V., Sim&#245;es-Pires, C., Cuendet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+multi-substrate+assay+coupled+to+UHPLC-ESI-MS/MS+for+a+quick+identification+of+class-specific+HDAC+inhibitors.">Cell-based multi-substrate assay coupled to UHPLC-ESI-MS/MS for a quick identification of class-specific HDAC inhibitors.</a> J Enzyme Inhibi Med Chem. 31 (1), 209-214 (2016).</li><li>Khan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+class+and+isoform+selectivity+of+small-molecule+histone+deacetylase+inhibitors.">Determination of the class and isoform selectivity of small-molecule histone deacetylase inhibitors.</a> Biochem J. 409 (2), 581-589 (2008).</li><li>Glaser, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+protein+acetylation+induced+by+novel+histone+deacetylase+inhibitors.">Differential protein acetylation induced by novel histone deacetylase inhibitors.</a> Biochem Biophys Res Commun. 325 (3), 683-690 (2004).</li><li>Butler, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+and+simple+chemistry+yield+a+superior,+neuroprotective+HDAC6+inhibitor,+tubastatin+A.">Rational design and simple chemistry yield a superior, neuroprotective HDAC6 inhibitor, tubastatin A.</a> J Am Chem Soc. 132 (31), 10842-10846 (2010).</li><li>Jung, M., Yong, K. -. J., Velena, A., Lee, S., Sippl, W., Jung, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Based+Assays+for+HDAC+Inhibitor+Hit+Validation.">Cell-Based Assays for HDAC Inhibitor Hit Validation.</a> Epigenetic Targets in Drug Discovery. , (2010).</li><li>Milli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+cellular+response+to+novel+proapoptotic+agents+related+to+atypical+retinoids+in+human+IGROV-1+ovarian+carcinoma+cells.">Proteomic analysis of cellular response to novel proapoptotic agents related to atypical retinoids in human IGROV-1 ovarian carcinoma cells.</a> J Proteome Res. 10 (3), 1191-1207 (2011).</li><li>Zwick, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+a+selective+HDAC6+inhibitor+active+in+neuroblasts.">Synthesis of a selective HDAC6 inhibitor active in neuroblasts.</a> Bioorg Med Chem Lett. 26 (20), 4955-4959 (2016).</li><li>Ciossek, T., Julius, H., Wieland, H., Maier, T., Beckers, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+homogeneous+cellular+histone+deacetylase+assay+suitable+for+compound+profiling+and+robotic+screening.">A homogeneous cellular histone deacetylase assay suitable for compound profiling and robotic screening.</a> Anal Biochem. 372 (1), 72-81 (2008).</li><li>Heltweg, B., Dequiedt, F., Marshall, B. L., Brauch, C., Yoshida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype+selective+substrates+for+histone+deacetylases.">Subtype selective substrates for histone deacetylases.</a> J Med Chem. 47 (21), 5235-5243 (2004).</li><li>Copeland, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Evaluation of enzyme inhibitors in drug discovery. , (2005).</li></ol>

HDAC 阻害は、がん療法21HDAC6 阻害の現在のフォーカスの創薬におけるホットな話題です。HDAC の選択性は通常個々 HDAC アイソ フォーム21に向けて抑制効力を判断する高スループット、携帯無料の試金のシリーズによって評価されます。しかし、阻害の選択性またによって確認されなければならない細胞のヒストンなどの内因性のタンパク質の基質のアセチル?...

Hdacs をしたはクロマチン構造中のヒストンを deacetylate することができる酵素の家族に属しています。また、細胞質で他の蛋白質の基質がある、細胞の様々 な区分であります。18 HDAC アイソ フォームの合計これまで同定されている細胞シグナル伝達し同様に、転写因子や遺伝子発現の調節など、いくつかの細胞メカニズムに関連しているし、1,2,3,4,5,6,7を輸送します。触媒の HDAC 阻害剤はがん治療のための潜在的な治療薬として浮上しています。ほとんど HDAC の抑制剤は、現在 FDA によって承認されて T 細胞リンパ腫、多発性骨髄腫の治療のため、ボリノスタット (サハ)、belinostat、パノビノスタット8,9などの非特異的 HDAC 阻害剤です。しかし、副作用のシリーズはパン阻害薬に関連付けられている、アイソ フォーム特異的小さな分子の検索は、薬効がある化学および薬剤の発見のホットな話題。したがって、クラス私 (HDAC1 3 と見られる HDAC8) の選択的阻害剤ロミデプシンは既に承認された薬10特定の HDAC6 阻害剤は、現在多発性骨髄腫11,12,13,14,15に高められた治療の可能性と、臨床試験中。
スクリーニング アッセイ HDAC を特徴づける阻害剤は酵素ソース (1 つのアイソ フォーム、核エキスまたは細胞ライセート) と HDAC 基板のインキュベーションに基づいています。基材は通常 N-(4-methyl-7-aminocoumarinyl)-Nα-(t-butoxycarbonyl)-Nω-acetyllysineamide (マル)16など分解蛍光体 (例えばクマリン) と結合したアセチル リジン残基を含む小さいペプチッド シーケンスです。アイソ フォーム固有のアクティビティを区別するために各アイソ フォームを含む別の無料のセル アッセイが必要と細胞内本物のアイソ フォームの活動を反映していないこと。アイソ フォーム固有の基板ベンジルなど、市販されている (S)-[1-(4-methyl-2-oxo-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)-5-propionylaminopentyl]carbamate (MOCPAC、HDAC1 特異的基質) と (S)-[5-acetylamino-1-(2-oxo-4-trifluoromethyl-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)pentyl]carbamic 酸 tert-ブチル エステル (BATCP、HDAC6 特異的基質) (図 1 b)。ただし、マルを含む複数基質混合物、MOCPAC、および BATCP 細胞に与えられるを許可しません個々 されたきちん製品の検出蛍光測定による同じ分解蛍光体を抱くことを考える。
ここで説明する方法は、検出と各基板とそのされたきちん製品 UHPLC-ESI ・ MS/MS 分析17続いてマルチ基板アッセイを用いた HeLa 細胞での相対的な定量化のためことができます。HDAC 阻害活性と内因性 hdacs をした試験化合物の特異性の直接同定法を有効に HeLa 細胞に HDAC アッセイを行ったHDAC1 と HDAC6 が同時に評価の焦点があります。単一培養の試金でこれらの酵素の測定を達成するため、96 ウェル プレートにメッキ処理と未処理の HeLa 細胞を非特異的, 特異 HDAC の基板上の混合物を追加します。インキュベーションのステップでは、次のセルは基板と区切られ、UHPLC-質量分析法 (図 1) を使用して検出された彼らのそれぞれの反応製品を解放する服従に分離します。マル、MOCPAC、および BATCP の基板のされたきちんの製品は、それぞれされたきちん MAL (dMAL)、されたきちん MOCPAC (dMOCPAC) とされたきちん BATCP (dBATCP) です。用量反応曲線は、活性化合物を構築できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55878/55878fig1.jpg"> 
図 1: 複数基板の UHPLC MS 解析による HDAC1 固有、HDAC6 阻害剤を識別するために細胞を用いた HDAC 試金のための一般的な方式です。(A) 方式、標準の 96 ウェル プレート治療 (試験化合物を含む) の (無処理) HeLa 細胞と無細胞ブランク。(B) 混合物 (各 21 μ M) として内因性 hdacs をした、されたきちんするのに追加基板の化学構造。(C) (マル、MOCPAC、および BATCP) の追加基板とされたきちん製品のピークを示す典型的なクロマト ・ MS クロマト グラム (dMAL、dMOCPAC と dBACTP、それぞれ)。<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55878/55878fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="887">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">BATCP</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">B4061</td>
			<td style="width:273px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MAL</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>SCP0168</td>
			<td>Synonym: BOC-Ac-Lys-AMC&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">MOCPAC</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">MS275</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">EPS002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Trichostatin A</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">T8552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Tubastatin A</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">SML0044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Acetonitrile, HPLC grade</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:152px;">10660131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Formic acid, LC/MS grade</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:152px;">10596814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:271px;">H2O, HPLC grade</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>distilled H2O filtered through a Milli-Q purification system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">HeLa cells</td>
			<td style="width:191px;">ATCC</td>
			<td style="width:152px;">ATCC CRM-CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell dissociation reagent TrypLE Express</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:152px;">12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">DMSO, cell culture grade</td>
			<td style="width:191px;">Applichem</td>
			<td style="width:152px;">146463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">DPBS</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Biowest</td>
			<td>S1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">MEM</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22561021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:191px;">Bioconcept</td>
			<td>4-01F00-H&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10X RIPA buffer</td>
			<td style="width:191px;">Abcam</td>
			<td style="width:152px;">ab156034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">SigmaFast protease inhibitor tablets</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">S8820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">96-well plates, sterile, flat-bottom, tissue culture treated Corning</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:152px;">29442-058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">96-well plates, non-sterile, V-bottom Corning</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:152px;">29442-404</td>
			<td>used in the centrifugation step</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">96-well plate, conical bottom, Nunc</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:152px;">249944</td>
			<td>compatible with the Acquity UHPLC system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">T75&#160; cell culture flasks Corning</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">CLS430641&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Peelable heat sealing foil&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Waters</td>
			<td style="width:152px;">186002789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Acquity UPLC system</td>
			<td style="width:191px;">Waters</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Eppendorf Centrifuge 5810 R</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:152px;">05-413-323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Integration software: MassLynx V4.1</td>
			<td style="width:191px;">Waters</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>Catalog number not available</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Combi thermo-sealer SP-0669/240</td>
			<td style="width:191px;">Waters</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>Catalog number not available</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Quattro micro API Tandem Quadrupole System</td>
			<td style="width:191px;">Waters</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>Catalog number not available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous measurement of hdac1 and hdac6 activity in hela cells using uhplc-ms

創薬における関心は高くなり新しいヒストン脱アセチル化酵素 (HDAC) 阻害剤の検索では。アイソ フォーム選択性ロミデプシン、クラス成立以来脚光を浴びている私は HDAC 阻害剤癌治療の多発性骨髄腫の特定の HDAC6 阻害剤の臨床的検討。現在のメソッドを使用して、HDAC1 とセルに HDAC6 試験化合物の阻害活性を決定します。アイソ フォームの活動は、超高速液体クロマトグラフィー-質量分析法 (クロマト ・ MS) 解析処理と未処理の HeLa 細胞と培養の特定の基板を使用して測定されます。メソッドには、分離のアイソ フォームで実施無料の細胞生化学的アッセイとは対照的、細胞環境で内因性 HDAC 活動を反映しての利点があります。さらに、それは合成基板の定量化に基づくが、ためメソッドは内生アセチル化タンパク質の抗体認識を必要ありません。それはいくつかの細胞株および自動化されたプロセスに容易に適応です。メソッドはすでに神経 HDAC6 選択的化合物を見つけることに有用な証明されています。典型的な結果をここに示します標準 HDAC 阻害剤トリコスタチン、(非特定の)、MS275 (HDAC1 固有の)、tubastatin (HDAC6 固有) を用いた HeLa 細胞と。

メソッドの HDAC1 の非選択性選択的阻害物質の識別への応用を実証する (クラス I)、HDAC6 (IIb クラス)、HeLa 細胞は知られている標準的な化合物と扱われた: トリコスタチン A (非選択的 HDAC1 と HDAC6)18MS275 (HDAC1 選択的阻害剤)19、および tubastatin (HDAC6 選択的阻害剤)20。本法 (図 1) を使用して、IC5...

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Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

本手法は複数基板の UHPLC MS 解析によるヒストン脱アセチル化酵素 (HDAC) HeLa 細胞でのアイソ フォーム特異阻害剤を識別するために提供しています。これは生活 HDAC1 と HDAC6 の活動を反映するように開発された抗体無料メソッド セル環境、単一アイソ フォーム細胞アッセイとは対照的。

HDAC1 と HDAC6 hela 細胞活性の同時測定セルを用いたクロマト MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

DNAグリコシラーゼ活性の定常状態、プレ定常状態、およびシングルターンオーバー速度論的測定

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

蛍光を用いて藻体で中性脂肪を測定するための簡単​​かつ迅速なプロトコル

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal ...

HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8217;-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

培養細胞および動物組織中のDNAの酸化バイオマーカー、8-オキソ-7,8-ジヒドロ-2&#39;-デオキシグアノシンのHPLC測定、

Oxidative stress is associated with many physiological and pathological processes, as well as xenobiotic metabolism, leading to the oxidation of ...

Dynamic Electrochemical Measurement of Chloride Ions

塩化物イオンの動的電気化学測定

This protocol describes the dynamic measurement of chloride ions using the transition time of a silver silver chloride (Ag/AgCl) electrode. Silver silver ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

酵素的、化学（メチル化）と物理（質量分析、核磁気共鳴）技術を用いた植物の壁ヘテロキシランのシーケンシング

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Fabrication and Testing of Photonic Thermometers

光温度計の作製と試験

In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being ...

Disentangling High Strength Copolymer Aramid Fibers to Enable the Determination of Their Mechanical Properties

その力学的特性の測定を可能にする高強度共重合体のアラミド繊維を disentangling

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to ...

High Resolution Physical Characterization of Single Metallic Nanoparticles

単一金属ナノ粒子の高解像度物理特性評価

Individual molecules can be detected and characterized by measuring the degree by which they reduce the ionic current flowing through a single ...

A New Straightforward Method for Lipophilicity (logP) Measurement using 19F NMR Spectroscopy

A New Straightforward Method for Lipophilicity logP Measurement using 19F NMR Spectroscopy

新しい簡単な19F NMR 分光学を使用して親油性 (logP) 測定法

Fluorination has become an effective tool to optimize physicochemical properties of bioactive compounds. One of the applications of fluorine introduction ...

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

化合物阻害、IC50値、アーティフィファクト活性、ヌクレオシドリボヒドロラーゼの全細胞活性を決定するためのNMRベース活性アッセイ

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment ...