Name: simultaneous measurement of hdac1 and hdac6 activity in hela cells using uhplc-ms
Uploaded: 2017-08-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS at JoVE.com

Yazarlar maliyet eylem CM1406 kabul (epigenetik Kimya Biyoloji). Bu yayında bildirilen araştırma Pierre Mercier Vakfı tarafından desteklenmiştir.

1. hücre kültürü
Not: Standart doku kültürü mahallede aşağıdaki adımlar gerçekleştirilir. Steril tekniği ile aşinalık bekleniyor.
<ol>
	<li>HeLa hücreleri için %80 confluency % 10 fetal sığır serum, penisilin G takıma MEM bir T75 hücre kültür şişesi içinde kültür (100 U/mL) ve streptomisin (100 mg/mL). Not: Hücre kültürü, tedavi ve lizis adımları %5 CO2 steril koşullarda oksijen bir ortamda gerçekleştirilen 37 ° C'de hücre kuluçka adım...

<ol>
	<li>Arrowsmith, C. H., Bountra, C., Fish, P. V., Lee, K., Schapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+protein+families:+a+new+frontier+for+drug+discovery.">Epigenetic protein families: a new frontier for drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 11 (5), 384-400 (2012).</li><li>Henikoff, S., Greally, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics,+cellular+memory+and+gene+regulation.">Epigenetics, cellular memory and gene regulation.</a> Curr Biol. 26 (14), R644-R648 (2016).</li><li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC6+inhibitor+blocks+amyloid+beta-induced+impairment+of+mitochondrial+transport+in+hippocampal+neurons.">HDAC6 inhibitor blocks amyloid beta-induced impairment of mitochondrial transport in hippocampal neurons.</a> PLoS One. 7 (8), (2012).</li><li>Kawaguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+deacetylase+HDAC6+regulates+aggresome+formation+and+cell+viability+in+response+to+misfolded+protein+stress.">The deacetylase HDAC6 regulates aggresome formation and cell viability in response to misfolded protein stress.</a> Cell. 115 (6), 727-738 (2003).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylation+of+p53+at+lysine+373/382+by+the+histone+deacetylase+inhibitor+depsipeptide+induces+expression+of+p21(Waf1/Cip1).">Acetylation of p53 at lysine 373/382 by the histone deacetylase inhibitor depsipeptide induces expression of p21(Waf1/Cip1).</a> Mol Cell Biol. 26 (7), 2782-2790 (2006).</li><li>Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+modifications+in+transcriptional+regulation.">Histone modifications in transcriptional regulation.</a> Curr Opin Genet Dev. 12 (2), 142-148 (2002).</li><li>Sim&#245;es-Pires, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC6+as+a+target+for+neurodegenerative+diseases:+what+makes+it+different+from+the+other+HDACs?.">HDAC6 as a target for neurodegenerative diseases: what makes it different from the other HDACs?.</a> Mol Neurodegener. 8 (7), 1-16 (2013).</li><li>Mottamal, M., Zheng, S., Huang, T. L., Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+inhibitors+in+clinical+studies+as+templates+for+new+anticancer+agents.">Histone deacetylase inhibitors in clinical studies as templates for new anticancer agents.</a> Molecules. 20 (3), 3898-3941 (2015).</li><li>Manal, M., Chandrasekar, M. J., Gomathi Priya, J., Nanjan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+histone+deacetylase+as+antitumor+agents:+A+critical+review.">Inhibitors of histone deacetylase as antitumor agents: A critical review.</a> Bioorg Chem. 67, 18-42 (2016).</li><li>Mack, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+selectivity+and+beyond.">To selectivity and beyond.</a> Nat Biotech. 28 (12), 1259-1266 (2010).</li><li>. Study of ACY-1215 alone and in combination with bortezomib and dexamethasone in multiple myeloma (ACY-1215) Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01323751">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01323751</a> (1211)</li><li>. Study of ACY-1215 in combination with lenalidomide, and dexamethasone in multiple myeloma Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01583283">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01583283</a> (2012)</li><li>. 13ACY-1215 (ricolinostat) in combination with pomalidomide and low-dose dex in relapsed-and-refractory multiple myeloma Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01997840">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01997840</a> (2013)</li><li>. Study of ACY-241 alone and in combination with pomalidomide and dexamethasone in multiple myeloma Available from: <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02400242">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02400242</a> (2015)</li><li>Yee, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ricolinostat+plus+lenalidomide,+and+dexamethasone+in+relapsed+or+refractory+multiple+myeloma:+a+multicentre+phase+1b+trial.">Ricolinostat plus lenalidomide, and dexamethasone in relapsed or refractory multiple myeloma: a multicentre phase 1b trial.</a> Lancet Oncol. 17 (11), 1569-1578 (2016).</li><li>Jung, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogenous+non-isotopic+assays+for+histone+deacetylase+activity.">Homogenous non-isotopic assays for histone deacetylase activity.</a> Expert Opin Ther Pat. 13 (6), 935 (2003).</li><li>Zwick, V., Sim&#245;es-Pires, C., Cuendet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+multi-substrate+assay+coupled+to+UHPLC-ESI-MS/MS+for+a+quick+identification+of+class-specific+HDAC+inhibitors.">Cell-based multi-substrate assay coupled to UHPLC-ESI-MS/MS for a quick identification of class-specific HDAC inhibitors.</a> J Enzyme Inhibi Med Chem. 31 (1), 209-214 (2016).</li><li>Khan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+class+and+isoform+selectivity+of+small-molecule+histone+deacetylase+inhibitors.">Determination of the class and isoform selectivity of small-molecule histone deacetylase inhibitors.</a> Biochem J. 409 (2), 581-589 (2008).</li><li>Glaser, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+protein+acetylation+induced+by+novel+histone+deacetylase+inhibitors.">Differential protein acetylation induced by novel histone deacetylase inhibitors.</a> Biochem Biophys Res Commun. 325 (3), 683-690 (2004).</li><li>Butler, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+and+simple+chemistry+yield+a+superior,+neuroprotective+HDAC6+inhibitor,+tubastatin+A.">Rational design and simple chemistry yield a superior, neuroprotective HDAC6 inhibitor, tubastatin A.</a> J Am Chem Soc. 132 (31), 10842-10846 (2010).</li><li>Jung, M., Yong, K. -. J., Velena, A., Lee, S., Sippl, W., Jung, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Based+Assays+for+HDAC+Inhibitor+Hit+Validation.">Cell-Based Assays for HDAC Inhibitor Hit Validation.</a> Epigenetic Targets in Drug Discovery. , (2010).</li><li>Milli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+cellular+response+to+novel+proapoptotic+agents+related+to+atypical+retinoids+in+human+IGROV-1+ovarian+carcinoma+cells.">Proteomic analysis of cellular response to novel proapoptotic agents related to atypical retinoids in human IGROV-1 ovarian carcinoma cells.</a> J Proteome Res. 10 (3), 1191-1207 (2011).</li><li>Zwick, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+a+selective+HDAC6+inhibitor+active+in+neuroblasts.">Synthesis of a selective HDAC6 inhibitor active in neuroblasts.</a> Bioorg Med Chem Lett. 26 (20), 4955-4959 (2016).</li><li>Ciossek, T., Julius, H., Wieland, H., Maier, T., Beckers, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+homogeneous+cellular+histone+deacetylase+assay+suitable+for+compound+profiling+and+robotic+screening.">A homogeneous cellular histone deacetylase assay suitable for compound profiling and robotic screening.</a> Anal Biochem. 372 (1), 72-81 (2008).</li><li>Heltweg, B., Dequiedt, F., Marshall, B. L., Brauch, C., Yoshida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype+selective+substrates+for+histone+deacetylases.">Subtype selective substrates for histone deacetylases.</a> J Med Chem. 47 (21), 5235-5243 (2004).</li><li>Copeland, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Evaluation of enzyme inhibitors in drug discovery. , (2005).</li></ol>

HDAC inhibisyon geçerli odaklı bir kanser tedavisi21HDAC6-selektif inhibitörü ilaç keşif sıcak bir konudur. HDAC seçicilik genellikle bireysel HDAC izoformlarının21doğru inhibitör etki gücüne belirlemek niyetinde yüksek üretilen iş, boş hücre deneyleri bir dizi tarafından değerlendirilir. Ancak, bir inhibitörü selectivity ayrıca canlı hücrelerde Histon gibi endojen protein yüzeylerde asetilasyon durumunu değerlendirerek onaylandığı takdirde (i...

HDACs enzim Histon Kromatin yapısı içinde deacetylate mümkün bir aileye ait. Onlar da diğer protein yüzeylerde sitozol içinde ve çeşitli hücre bölmeleri içinde bulunurlar. 18 HDAC izoformlarının toplam defa tespit edilmiştir ve transkripsiyon faktörleri ve gen ifadesinin yanı sıra hücre sinyallemesi düzenlenmesi de dahil olmak üzere birkaç hücre mekanizmaları ile ilgili ve1,2,3,4,5,6,7taşıma. HDAC katalitik inhibitörleri kanser tedavisi için potansiyel terapötik ilaç olarak ortaya çıkmıştır. Şu anda FDA tarafından onaylanmış çoğu HDAC inhibitörleri T hücreli Lenfoma ve multiple Miyelom tedavisi için ve non-spesifik HDAC inhibitörleri, vorinostat (SAHA), belinostat ve panobinostat8,9gibi. Ancak, yan etkileri bir dizi pan-inhibitörleri ile ilişkili olmuştur ve izoformu özgü küçük moleküller için arama tıbbi kimya ve ilaç bulma gelen sıcak bir konudur. Buna göre sınıf ı (HDAC1-3 ve HDAC8) selektif inhibitörü romidepsin olduğunu bir onaylanmış durumdaki ilaç10, HDAC6 özgü inhibitörleri şu anda klinik çalışmalarda, Multipl Miyelom11,12,13,14,15artan tedavi potansiyele sahip altında iken.
Deneyleri HDAC karakterize etmek için eleme inhibitörleri (tek izoformu, nükleer özü veya hücre lysate) enzimatik kaynağı olan bir HDAC substrat kuluçka temel alır. Belgili tanımlık substrate genellikle N-(4-methyl-7-aminocoumarinyl)-Nα-(t-butoxycarbonyl)-Nω-acetyllysineamide (MAL)16gibi bir yarilabilir fluorophore (Örneğin, coumarin) birleştiğinde bir asetil lizin kalıntı içeren bir küçük peptid sırası'dır. İzoformu özel etkinlikler arasında ayırt etmek için her izoformu içeren ayrı boş hücre deneyleri gerekli olan ve canlı hücreler gerçek izoformu etkinliğinde yansıtmıyor. İzoformu özel yüzeylerde Benzil gibi piyasada (S)-[1-(4-methyl-2-oxo-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)-5-propionylaminopentyl]carbamate (MOCPAC, HDAC1 belirli substrat) ve (S)-[5-acetylamino-1-(2-oxo-4-trifluoromethyl-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)pentyl]carbamic asit tert-butil ester (BATCP, HDAC6 belirli substrat) (şekil 1B). Onlar aynı yarilabilir fluorophore ayı verilen bu ancak, MAL içeren bir çok substrat karışımı, MOCPAC ve canlı hücreler için verilen BATCP deacetylated ürünlerin tek tespiti Fluorometrik ölçüm tarafından izin vermeyeceğim.
Burada açıklanan yöntemi algılama ve her yüzey ve deacetylated ürün UHPLC-ESI-MS/MS analiz17tarafından takip bir çok maddeyi tahlil kullanarak HeLa hücreleri içinde göreli miktar olanak sağlar. Bir HDAC tahlil doğrudan kimlik HDAC inhibitör etkinliği ve özgüllük test bileşikler endojen HDACs etkinleştirmek için HeLa hücreleri üzerinde yapılan. HDAC1 ve HDAC6, aynı anda değerlendirilir bir odak vardır. Bir tek kuluçka tahlil enzimatik Bu ölçümlerde elde etmek için non-spesifik ve belirli HDAC yüzeylerde karışımı bir 96-şey plaka üzerinde kaplama tedavi ve tedavi edilmezse HeLa hücreleri eklenir. Bir kuluçka adım hücreleri yüzeylerde ve ayrılır ve bir UHPLC-MS (şekil 1 c) yöntemiyle tespit onların anılan sıraya göre tepki ürünler serbest bırakmak için lysed. MAL, MOCPAC ve BATCP yüzeylerde deacetylated ürünleri deacetylated MAL (dMAL), deacetylated MOCPAC (dMOCPAC) ve deacetylated BATCP (dBATCP), sırasıyla vardır. Doz-yanıt eğrileri aktif bileşikler ile inşa edilebilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55878/55878fig1.jpg"> 
Şekil 1: HDAC1 ve HDAC6 özel inhibitörleri birden çok yüzeylerde UHPLC-MS analizi tarafından tanımlamak hücre tabanlı HDAC tahlil için genel düzeni. Tipik 96-şey plaka tedavi (test bileşikleri) içeren bir(a)düzeni ve tedavi edilmezse (kontrol) HeLa hücreleri yanı sıra boş hücre boşlukları. (B) kimyasal yapısı yüzeylerde endojen HDACs tarafından deacetylated için bir karışım (21 her µM) eklendi. (C) eklenen yüzeylerde (MAL, MOCPAC ve BATCP) ve deacetylated ürünlerini doruklarına gösterilen tipik UHPLC-MS Kromatografik (dMAL, dMOCPAC ve dBACTP, sırasıyla). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55878/55878fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="887">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">BATCP</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">B4061</td>
			<td style="width:273px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MAL</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>SCP0168</td>
			<td>Synonym: BOC-Ac-Lys-AMC&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">MOCPAC</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">MS275</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">EPS002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Trichostatin A</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">T8552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Tubastatin A</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">SML0044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Acetonitrile, HPLC grade</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:152px;">10660131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Formic acid, LC/MS grade</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:152px;">10596814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:271px;">H2O, HPLC grade</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>distilled H2O filtered through a Milli-Q purification system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">HeLa cells</td>
			<td style="width:191px;">ATCC</td>
			<td style="width:152px;">ATCC CRM-CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell dissociation reagent TrypLE Express</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:152px;">12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">DMSO, cell culture grade</td>
			<td style="width:191px;">Applichem</td>
			<td style="width:152px;">146463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">DPBS</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Biowest</td>
			<td>S1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">MEM</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22561021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:191px;">Bioconcept</td>
			<td>4-01F00-H&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10X RIPA buffer</td>
			<td style="width:191px;">Abcam</td>
			<td style="width:152px;">ab156034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">SigmaFast protease inhibitor tablets</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">S8820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">96-well plates, sterile, flat-bottom, tissue culture treated Corning</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:152px;">29442-058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">96-well plates, non-sterile, V-bottom Corning</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:152px;">29442-404</td>
			<td>used in the centrifugation step</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">96-well plate, conical bottom, Nunc</td>
			<td style="width:191px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:152px;">249944</td>
			<td>compatible with the Acquity UHPLC system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">T75&#160; cell culture flasks Corning</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">CLS430641&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Peelable heat sealing foil&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Waters</td>
			<td style="width:152px;">186002789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Acquity UPLC system</td>
			<td style="width:191px;">Waters</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Eppendorf Centrifuge 5810 R</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:152px;">05-413-323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Integration software: MassLynx V4.1</td>
			<td style="width:191px;">Waters</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>Catalog number not available</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Combi thermo-sealer SP-0669/240</td>
			<td style="width:191px;">Waters</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>Catalog number not available</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Quattro micro API Tandem Quadrupole System</td>
			<td style="width:191px;">Waters</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>Catalog number not available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous measurement of hdac1 and hdac6 activity in hela cells using uhplc-ms

Yeni Histon deacetylase (HDAC) inhibitörleri ilaç keşif ilgi artan bir arayıştır. İzoformu seçicilik romidepsin, bir sınıf onay beri spot oldu ben HDAC inhibitörü kanser tedavisi ve HDAC6 özgü yavaşlatıcılar, Multipl Miyelom için klinik incelenmesi için. Mevcut yöntemi HDAC1 ve HDAC6 hücrelerde test bileşikler inhibitör etkinliğini belirlemek için kullanılır. İzoformu etkinlik ultra yüksek performanslı sıvı Kromatografi-Kütle spektrometresi (UHPLC-MS) analizi belirli yüzeylerde tedavi ve tedavi edilmezse HeLa hücreleri ile inkübe ölçülür. Yöntem boş hücre biyokimyasal testleri izole izoformlarının üzerinde yürütülen aksine hücre ortamında endojen HDAC etkinliği yansıtan bir avantaja sahiptir. Ayrıca, sentetik yüzeylerde miktar üzerinde temel aldığından, yöntem antikor tanıma endojen acetylated proteinlerin gerektirmez. Birden fazla hücre satır ve otomatik bir işlemin kolayca uyarlanabilir. Yöntem zaten neuroblasts içinde HDAC6-seçici bileşikler bulmada faydalı olmuştur. Temsilcisi sonuçları are göstermek burada standart HDAC inhibitörleri trichostatin ile bir (non-spesifik), MS275 (HDAC1 özel) ve tubastatin (HDAC6 özel) kullanarak HeLa hücreleri.

Non-selektif ve selektif inhibitörü HDAC1 için tanımlayıcı uygulamanın yönteminin göstermek için (sınıf ı) ve HDAC6 (sınıf IIB), HeLa hücreleri bilinen standart bileşenleri ile tedavi: trichostatin A (non-selektif HDAC1 ve HDAC6 arasında)18, MS275 (HDAC1-selektif inhibitörü)19ve tubastatin (HDAC6-selektif inhibitörü)20. Mevcut yöntem (şekil 1) kullanarak, ŞA5...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS at JoVE.com

Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

Mevcut Yöntem birden çok yüzeylerde UHPLC-MS analizi tarafından Histon uyku (HDAC) HeLa hücreleri izoformu özgü inhibitörleri tanımlanmasını sağlar. Bu yaşam HDAC1 ve HDAC6 etkinliği yansıtmak üzere geliştirilen bir antikor-Alerjik yöntemdir tek-izoformu boş hücre deneyleri aksine hücre çevre.

Eş zamanlı ölçüm HDAC1 ve HDAC6 faaliyete HeLa hücreleri kullanarak UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

DNA glikosilaz Faaliyet için kararlı durum, Ön kararlı durum ve Tek cirosu Kinetik Ölçüm

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

Floresan kullanma Alg hücrelerinde nötral Lipidler Ölçüm Basit ve Hızlı Protokolü

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal ...

HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8217;-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

DNA, Oksidasyon Biomarker HPLC ölçümü, 8-okso-7,8-dihidro-2&#39;-deoksiganozin, Kültürlenmiş Hücrelerde ve hayvansal dokular

Oxidative stress is associated with many physiological and pathological processes, as well as xenobiotic metabolism, leading to the oxidation of ...

Dynamic Electrochemical Measurement of Chloride Ions

Klorür iyonlarının Dinamik Elektrokimyasal Ölçüm

This protocol describes the dynamic measurement of chloride ions using the transition time of a silver silver chloride (Ag/AgCl) electrode. Silver silver ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

Enzimatik, kimyasal (Metilasyon) ve Fiziksel (Kütle Spektrometre, Nükleer Manyetik Rezonans) Teknikleri Kullanarak Bitki Duvar heteroksilanlar sıralanması

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Fabrication and Testing of Photonic Thermometers

İmalat ve fotonik termometreler test

In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being ...

Disentangling High Strength Copolymer Aramid Fibers to Enable the Determination of Their Mechanical Properties

Disentangling yüksek mukavemetli kopolimer Aramid Elyaf mekanik özelliklerinin belirlenmesi etkinleştirmek için

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to ...

High Resolution Physical Characterization of Single Metallic Nanoparticles

Tek metalik nanopartiküller yüksek çözünürlüklü fiziksel karakterizasyonu

Individual molecules can be detected and characterized by measuring the degree by which they reduce the ionic current flowing through a single ...

A New Straightforward Method for Lipophilicity (logP) Measurement using 19F NMR Spectroscopy

A New Straightforward Method for Lipophilicity logP Measurement using 19F NMR Spectroscopy

19F NMR spektroskopi kullanarak Lipophilicity (logP) ölçüm için yeni bir basit Yöntem

Fluorination has become an effective tool to optimize physicochemical properties of bioactive compounds. One of the applications of fluorine introduction ...

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR tabanlı aktivite bileşik Inhibisyonu belirlenmesi için Assays, ıC50 değerleri, Artifactual aktivite, ve Nükrenoside Ribohidolases tüm hücre aktivitesi

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment ...