Name: odelay: a large-scale method for multi-parameter quantification of yeast growth
Uploaded: 2017-07-03T14:00:00
Duration: 11 min 19 s
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Die Autoren bestätigen die Unterstützung für diese Arbeit durch Zuschüsse U54 RR022220 und P50 GM076547 an JDA von den US National Institutes of Health. FDM ist ein Postdoktorand mit den kanadischen Instituten für Gesundheitsforschung. Wir danken dem luxemburgischen Zentrum für Systembiomedizin und der Universität Luxemburg für die Unterstützung.

<ol>
	<li>Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van't Riet, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+the+bacterial+growth+curve.">Modeling of the bacterial growth curve.</a> Appl Environ Microbiol. 56 (6), 1875-1881 (1990).</li><li>Sellick, C. A., Campbell, R. N., Reece, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galactose+metabolism+in+yeast-structure+and+regulation+of+the+leloir+pathway+enzymes+and+the+genes+encoding+them.">Galactose metabolism in yeast-structure and regulation of the leloir pathway enzymes and the genes encoding them.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 269, 111-150 (2008).</li><li>Yoshikawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+phenotypic+analysis+for+identification+of+genes+affecting+growth+under+ethanol+stress+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Comprehensive phenotypic analysis for identification of genes affecting growth under ethanol stress in Saccharomyces cerevisiae.</a> FEMS Yeast Res. 9 (1), 32-44 (2009).</li><li>Bryan, A. K., Goranov, A., Amon, A., Manalis, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mass,+density,+and+volume+during+the+cell+cycle+of+yeast.">Measurement of mass, density, and volume during the cell cycle of yeast.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (3), 999-1004 (2010).</li><li>Baryshnikova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+fitness+and+genetic+interactions+in+yeast+on+a+genome+scale.">Quantitative analysis of fitness and genetic interactions in yeast on a genome scale.</a> Nat Methods. 7 (12), 1017-1024 (2010).</li><li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+landscape+of+a+cell.">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327 (5964), 425-431 (2010).</li><li>Collins, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+dissection+of+protein+complexes+involved+in+yeast+chromosome+biology+using+a+genetic+interaction+map.">Functional dissection of protein complexes involved in yeast chromosome biology using a genetic interaction map.</a> Nature. 446 (7137), 806-810 (2007).</li><li>Zackrisson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scan-o-matic:+High-Resolution+Microbial+Phenomics+at+a+Massive+Scale.">Scan-o-matic: High-Resolution Microbial Phenomics at a Massive Scale.</a> G3 (Bethesda). 6 (9), 3003-3014 (2016).</li><li>Bean, G. J., Jaeger, P. A., Bahr, S., Ideker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+ultra-high-density+screening+tools+for+microbial+'omics'.">Development of ultra-high-density screening tools for microbial 'omics'.</a> PloS One. 9 (1), e85177 (2014).</li><li>Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bet+hedging+in+yeast+by+heterogeneous,+age-correlated+expression+of+a+stress+protectant.">Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant.</a> PLoS Biol. 10 (5), e1001325 (2012).</li><li>Herricks, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-Cell+Doubling+Evaluation+by+Living+Arrays+of+Yeast.">One-Cell Doubling Evaluation by Living Arrays of Yeast.</a> ODELAY! G3 (Bethesda). 7 (1), 279-288 (2017).</li><li>Mast, F. D., Ratushny, A. V., Aitchison, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+cell+biology.">Systems cell biology.</a> J Cell Biol. 206 (6), 695-706 (2014).</li><li>Edelstein, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+methods+of+microscope+control+using+&#181;Manager+software.">Advanced methods of microscope control using &#181;Manager software.</a> J Biol Methods. 1 (2), e10 (2014).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Der ODELAY-Test hat mehrere kritische Punkte, um reproduzierbare und zuverlässige phänotypische Messungen zu gewährleisten. Der erste kritische Punkt ist die konsequente Vorbereitung der Hefekulturen. Es muss darauf geachtet werden, die Hefezellen aus logarithmischem Wachstum zu ernten. Wenn die Kulturen gesättigt sind, dann wird ihre Heterogenität der Bevölkerung erhöht, die Heterogenität durch genetische oder umweltbedingte ( z. B. Kohlenstoffquellen) Faktoren beeinträchtigen kann 11 . Der zweite kritische Punkt ist die konsequente Vorbereitung der Medien. Im Allgemeinen sollte ein großes Volumen von 10X-Stammmedien-Lösung generiert und dann im Laufe der Zeit verwendet werden, um Batch-Effekte zu minimieren. Die Formulierung von Medien nach Gewicht, wann immer möglich, hilft, die Konsistenz des Mediums im Laufe der Zeit zu verbessern, indem die Dichte des Agars sichergestellt wird und der Gesamtwassergehalt der Agarose genau überwacht werden kann. Der dritte kritische Punkt beinhaltet die Minimierung oder Beseitigung jeder mechanischen Verformung der Agarose michDia Eine mechanische Verformung des Mediums erfolgt am häufigsten bei der Trennung der Agarose aus den Glasscheiben. Wie bei vielen Labortechniken ist die Praxis erforderlich, diesen Schritt zu beherrschen. Die Variation der Verzögerungszeit, wie in Fig. 4 dargestellt , ist oft mit einem der drei Faktoren verbunden: mechanische Verformung des Agarosemediums, Veränderung der geformten Agardicke oder einer instabilen Lichtquelle. Wenn sich das Agarose-Medium in der Z-Höhe über das gefleckte Array ändert, kann die Höhenvariation den Bereich der Autofokus-Routine überwältigen, wodurch die Anfangsbilder leicht unscharf werden. Aus diesem Grund überprüfen Sie die Fokushöhe an mehreren Stellen in der Mitte und entlang der Kanten des gefleckten Arrays, um sicherzustellen, dass die Autofokusroutine genügend Z-Bereich hat, um Fokus zu finden. Wenn nötig, verwenden Sie das Autofocus-Bedienfeld, um den Fokusbereich zu erhöhen und die Anzahl der Fokussierungsschritte zu erhöhen. Ein dritter möglicher conditIonen, die zu einem schlechten Fokus führen können, ist eine instabile oder flackernde Lichtquelle, die die berechnete Fokusbewertung für eine bestimmte Z-Höhe stören kann. Wolfram Halogenbirnen neigen dazu, gut zu flackern, bevor die Birnen ausbrennen. Die Wirkung eines schlechten Fokus wird in einem Beispiel beobachtet, bei dem die Wachstumskurven zwischen den ersten und zweiten Zeitpunkten eintauchen ( Abbildung 5 A ), während der benachbarte Punkt nicht das gleiche Dip hat ( Abbildung 5 B ). In diesem Fall wurde die schlechte Fokusbedingung durch Ersetzen der Wolfram-Halogen-Lichtquelle gemildert. In der Praxis haben die Autoren festgestellt, dass, um das Flackern von 100W-Wolfram-Halogenlampen zu reduzieren, die Glühbirnen alle 500 h oder etwa alle 2 Monate ausgetauscht werden müssen, wenn die Mikroskope stark untergebracht sind. Um eine schlechte Fokusausgabe von einer flackernden Glühlampe zu vermeiden, ersetzen Sie die Wolfram-Halogen-Lichtquelle oft oder ersetzen Sie die Halogenlampe mit einer Diodenlichtquelle. EinBeispiel eines Datensatzes, der eine geringe Variation der Verdopplungszeiten sowie einheitlichere Verzögerungszeiten zeigt, ist in Fig. 6 gezeigt . Dieser Datensatz wurde mit einem Dioden-Illuminator aufgenommen, der eine stabilere Ausleuchtung über die Zeit bietet, während er den Autofokus durchführt. Während viele der hier erwähnten Punkte zur Optimierung der Medienvorbereitung offensichtlich erscheinen, zeigen sich in der Literatur die meisten Großbildschirme nicht gut miteinander, 8 , 11 . Daher haben wir sorgfältig die Vorbereitung von Kulturen und Agarose-Medien beschrieben, so dass mehr reproduzierbare phänotypische Bildschirme erzeugt werden können. Der ODELAY-Assay ist derzeit im Durchsatz im Vergleich zu Pinning-basierten Assays wie synthetischen genetischen Arrays oder dem Scan-O-Matic-Assay begrenzt. Während diese Methoden die Anzahl der gemessenen Stämme erhöhen, fehlt ihnen die Fähigkeit, einzelne Zellen zu lösenDaher kann man die Heterogenität der Bevölkerung nicht messen, die wir in klonalen Hefestämmen beobachten. Der Ursprung dieser Heterogenität wird derzeit nicht verstanden, aber die hier beschriebene Verschmelzung von Technik und Berechnungen bietet eine Möglichkeit zur objektiven Adressierung der zugrunde liegenden zellulären Mechanismen 12 . Die Autoren möchten beachten, dass ODELAY derzeit nur für eine bestimmte Mikroskopmarke und Körpertyp optimiert ist. Das Ändern von ODELAY für andere Mikroskopsysteme ist einfach, erfordert jedoch Kenntnisse der Open Source API 13 . Allerdings werden sowohl die API als auch die ODELAY Scripts geschrieben, um leicht an verschiedene Systeme und experimentelle Assays angepasst zu werden. Während ODELAY ursprünglich für Hefe entwickelt wurde, konnten wir es ohne Veränderung nutzen, um das Wachstum von Mycobacterium smegmatis zu beobachten. Die Beobachtung der anderen Kolonie bildenden Mikroorganismen istMöglich mit Änderungen am Quellcode 11 . Im Allgemeinen ist ODELAY ein leistungsfähiges und flexibles Werkzeug für den Vergleich von Mikroorganismen, die unter verschiedenen Umgebungsbedingungen und genetischen Störungen gewachsen sind.

Wachstums-Phänotypen von Mikroorganismen sind ein starker Indikator für ihre zugrunde liegende genetische Eignung zu einem gegebenen Umgebungszustand. Das Wachstum wird klassisch in 3 verschiedene Wachstumsregimes getrennt: Lag-Phase, Log-Phase und stationäres Phasenwachstum 1 . Jede Wachstumsphase kann verschiedene Aspekte der Fitness zeigen, die von verschiedenen ökologischen und genetischen Bedingungen abhängig sind. Zum Beispiel kann die Verzögerungszeit oder die Zeitspanne, in der ein Organismus vor dem Beginn des exponentiellen Wachstums in der Verzögerungsphase verbringt, auf die Fähigkeit eines Organismus hinweisen, auf veränderte Umgebungsbedingungen zu reagieren 2 . Die Verdopplungszeit während des Log-Phase-Wachstums, die häufigste Metrik der zellulären Fitness, zeigt die Gesamteffizienz der Fähigkeit eines Organismus, sich durch Metabolisierung und Nutzung von Umweltmaterialien für die Replikation zu teilen. Stationäre Phase, wo Wachstum nach Log-Phase schnell reduziert wird, ist ein weiterer Indikator für Fitness, die regelmäßig istAls Wachstumsendpunkt in punktbasierten Hefewachstums-Assays verwendet. Mehrere Hefewachstumstests sind derzeit verfügbar und gelten als Standardmethoden zur Bewertung von Wachstumsphänotypen in Hefe 3 , 4 , 5 . Diese Assays basieren in erster Linie auf Methoden zum Anbau von Hefe entweder auf festen oder in flüssigen Medien. Auf festen Medien übertragen Kolonie-Pinning-Assays eine kleine Anzahl von Zellen auf einen festen Agar mit einem Pin und Hefe-Zellen können für eine definierte Zeitspanne wachsen. Kolonien werden dann abgebildet und ihre Größen werden an einem Endpunkt 6 verglichen. Diese Kolonie-Pinning-Assays haben sich als robust und skalierbar erwiesen, um genomweite Bildschirme zu erzeugen. In jüngster Zeit wurde eine periodische Bildgebung mit Flachbett-Scannern und Einzelobjektivreflex (SLR) -Kameras in diese Assays integriert, um das Koloniewachstum über die Zeit 7 , 8 aufzuzeichnen, 9 Die Auflösung dieser Vorrichtungen verhindert jedoch, dass sie einzelne Zellen detektieren und somit diese Kolonie-Pinning-Assays nicht direkt die Verzögerungszeit beobachten und die Variation zwischen den einzelnen Zellen, die in Kolonien wachsen, nicht beobachten können. Flüssigbasierte Wachstumstests wurden auch zur Durchführung von genomweiten Schirmen eingesetzt 3 . Die Kopplung eines Liquidwachstums-Assays mit der Zeitraffer-Mikroskopie zeigte die Heterogenität der Population in der Verdopplungszeit genetisch identischer Einzelzellen, die eine wichtige Perspektive für das Verständnis der genetischen Regulation und der Umweltanpassung bietet. Dieser Assay misst jedoch nicht andere Aspekte des Wachstums wie Verzögerungszeit und Tragfähigkeit 10 . Hier stellen wir eine Methode vor, um alle drei Wachstumsphasen von koloniebildenden Mikroorganismen auf festen Medien unter Verwendung eines Assays zu charakterisieren, den wir ODELAY 11 bezeichnen . ODELAY besteht aus utiliZing hohe Durchlauf-Zeitraffer-Mikroskopie zur Aufzeichnung von Bildern von einzelnen Zellen, die in Kolonien auf festen Medien wachsen. Diese Population einzelner Zellen, die in Kolonien wachsen, zeigt die zugrundeliegende Heterogenität der Bevölkerung, die von anderen weniger empfindlichen Messungen, wie z. B. terminaler Endpunkt-Scoring, nicht erkannt wird. Wir zeigen die Methode auf Hefe, aber ODELAY kann auf jeden Organismus angewendet werden, der Kontrast in der Hellfeldmikroskopie zeigt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1013">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Agarose UltraPure</td>
			<td style="width:131px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">16500500</td>
			<td style="width:413px;">Gel Temp 36C, Gel Strength (1%) 1.2g/sq cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Extract Peptone (YEP)</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Complete Suplement Mixture (CSM)</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MP114560222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Polyethylene Glycol 3350 (av. mol. wt. 3000-3700)</td>
			<td style="width:131px;">SigmaAldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Strain BY4741</td>
			<td style="width:131px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">95400.BY4741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Strain BY4742</td>
			<td style="width:131px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">95400.BY4742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50mL Falcon tubes</td>
			<td style="width:131px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430291</td>
			<td>1 case</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15mL Falcon tubes</td>
			<td style="width:131px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 x 3 inch 1.0mm thick slides 1/2 gross</td>
			<td style="width:131px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48382-179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well plate flat bottom</td>
			<td style="width:131px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:119px;">353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Hydra liquid handleing robot</td>
			<td style="width:131px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">1096-DT-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Hamilton Microlab Star Liquid Handleing Robot</td>
			<td style="width:131px;">Hamilton</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hydra 100 mL tips Extended Length DARTS</td>
			<td style="width:131px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">5527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Synergy H4 Plate Reader</td>
			<td style="width:131px;">Biotek</td>
			<td style="width:119px;">H4MLFAD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Leica DMI6000 B Microscope</td>
			<td style="width:131px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Leica 10X/0.3NA objective</td>
			<td style="width:131px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">11506289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Hamamatsu ORCA Flash 4.0 Camera</td>
			<td style="width:131px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:119px;">C11440-22CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">MATLAB with image processing tool box</td>
			<td style="width:131px;">Mathworks</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">MicroManager</td>
			<td style="width:131px;">Open Imaging</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://micro-manager.org/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">ODELAY Microscope Control (MATLAB scripts and GUI)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>www.aitchisonlab.com\ODELAY for Matlab scripts and software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">ODELAY Microscope Chamber</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>www.aitchisonlab.com\ODELAY for Mechanincal Drawings</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">ODELAY Agar Molds</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>www.aitchisonlab.com\ODELAY for mold drawings</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

odelay: a large-scale method for multi-parameter quantification of yeast growth

Wachstums-Phänotypen von Mikroorganismen sind ein starker Indikator für ihre zugrunde liegende genetische Fitness und können in 3 Wachstumsregimes getrennt werden: Lag-Phase, Log-Phase und stationäre Phase. Jede Wachstumsphase kann verschiedene Aspekte der Fitness zeigen, die mit verschiedenen ökologischen und genetischen Bedingungen zusammenhängen. Hochauflösende und quantitative Messungen aller 3 Phasen des Wachstums sind in der Regel schwer zu erreichen. Hier präsentieren wir eine detaillierte Methode zur Charakterisierung aller 3 Wachstumsphasen auf festen Medien mit einem Assay namens One-Cell Doubling Evaluation von lebenden Arrays von Hefe (ODELAY). ODELAY quantifiziert die Wachstumsphänotypen einzelner Zellen, die unter Verwendung von Zeitraffer-Mikroskopie zu Kolonien auf festen Medien wachsen. Diese Methode kann die Heterogenität der Population mit jedem Wachstumsparameter in genetisch identischen Zellen, die zu Kolonien wachsen, direkt beobachten. Diese Heterogenität der Bevölkerung bietet eine einzigartige Perspektive für das Verständnis der genetischen und epigenetischen Regulierung und der Reaktionen aufGenetische und umweltbedingte Störungen. Während die ODELAY-Methode unter Verwendung von Hefe demonstriert wird, kann sie auf jedem koloniebildenden Mikroorganismus verwendet werden, der durch eine helle Feldmikroskopie sichtbar ist.

<html> Beispielbilder von Hefe, die in der Zeitraffer-Mikroskopie wachsen, sind in Fig. 3B gezeigt . Nach der Verarbeitung der Zeitrafferbilder ist ein repräsentativer Datensatz, der die Hefestämme BY4741 &amp; BY4742 vergleicht, in Fig. 4 gezeigt . In diesem Beispiel-Datensatz gibt es sehr wenig Abweichung in der Verdopplungszeit zwischen verschiedenen Positionen auf der Platte. Wenn das Agarosemedium schlecht vorbereitet wird, dann wäre eine offensichtliche Abweichung sowohl bei der Verdopplungszeit als auch bei der Verzögerungszeit in den Fleckpositionen offensichtlich, die mit dem deformierten Bereich des Agarosegels übereinstimmen. Während die Verdopplungszeiten relativ gleichmäßig erscheinen, zeigt dieses Beispiel Variationen der Verzögerungszeitmessungen. Ein konsistenterer Datensatz ist in Abbildung 6 dargestellt . In diesem Datensatz sind sowohl Verzögerungszeit als auch Verdopplungszeit einheitlich. Dateien / ftp_upload / 55879 / 55879fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1: Agar Mould Assembly. Die Komponenten der Agarform sind in ( A ) dargestellt. Montieren Sie den Sockel wie in ( B ) gezeigt und klemmen Sie den Sockel mit kleinen Binderclips. Legen Sie die längeren Ständer in den Hohlraum der Basis ( C ) und legen Sie dann die Schieber wie in ( D ) gezeigt in die Form. Eine Seitenansicht, die den Winkel der Form und die Ausrichtung des Formkörpers zeigt, der für eine gleichmäßige Trennung des Agars von dem Glasschieber ( E ) benötigt wird. Beachten Sie die Position des Daumens und der Zeigefinger sowie die Gerade des Agars, die sich von der Folie ( F ) trennt, und notieren Sie den horizontalen Pfeil. Die Trennlinie sollte sich gleichmäßig in Richtung der vertikalen Pfeile bewegen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> = &quot;Jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig2.jpg" /> Abbildung 2: Sonication and Spotting Methode. Sonden Sie die Platte in Eiswasser und verwenden Sie einen Zentrifugen-Eimerhalter, um die Platte ( A ) zu unterstützen. Legen Sie die Platten aus den Schritten 3.8.1 für das Aufsprühen auf die Agaroseplatte ( B ). Auch die Spitzen so anordnen, dass die linke meisten Kasten eine Spitze an Position C10 hat und dann vier andere Spitzen mit ihren Enden abgeschnitten, also stoßen sie nicht den Plattenhalter ( C ) an. Legen Sie die restlichen Spitzen in vier Boxen, so dass die inneren 24 Spitzenpositionen besetzt sind ( D ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 55879fig3.jpg &quot;/&gt; Abbildung 3: ODELAY Grafische Benutzeroberfläche. Ein Screenshot der grafischen Benutzeroberfläche für &quot;ODELAY_Microscopecontrol.m&quot; ( A ). Diese Schnittstelle ermöglicht die Überwachung der Kamera und die Einstellung der Mikroskop-Beleuchtungseinstellungen für Epifluoreszenz- und Hellfeldmodi. Rote Pfeile zeigen auf die Focus- und Transmit-Tasten, die die Kamera aktivieren, um Bilder schnell zu erfassen und den Durchlicht-Shutter zu öffnen. Blaue Pfeile werden verwendet, um die Bühne für den Ursprung zu bewegen und dann den Ursprung mit der Taste &quot;Go Origin&quot; und &quot;Set&quot; zu setzen. Grüne Pfeile zeigen auf &quot;Reset&quot; und &quot;ODELAY !!!&quot; Tasten, die ODELAY-Bildmodi auf die aktuellen Bedingungen zurücksetzen und die ODELAY-Bildsammlung initiiert. Zeitraffer Bilder von Hefe, die auf festem Medium bei 0, 3, 6 und 9 h nach dem Spotting ( B ) wachsen. Ein Screenshot der grafischen Benutzeroberfläche für &quot;ODELAY_IPT.m&quot; oder th<html> E ODELAY Bildverarbeitungswerkzeug ( C ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig4.jpg" /> Abbildung 4: Beispiel ODELAY Ausgang. Dieser Datensatz vergleicht die Stämme BY4741 und BY4742 auf YPD-Medien. Diese Figur ist ein Beispiel für eine gut vorbereitete Agarose-Folie; Autofokuseinstellungen sind jedoch nicht optimal. Die Daten, die in jeder Spalte von links nach rechts dargestellt werden, sind: die Tragfähigkeit in Log 2 des Kolonienbereichs; Verdopplungszeit, gegeben in min; Und Verzögerungszeit, gegeben in min. In diesem Beispiel verdoppeln sich die Verdopplungszeiten aller Flecken auf der Agar-Folie gut mit einer kleinen Menge an erhöhter Verdopplungszeit in Richtung der Säule. Allerdings variieren die Lagzeiten in diesem Datensatz erheblich._upload / 55879 / 55879fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig5.jpg" /> Abbildung 5: Growth Curve Beispiele. Dieses Beispiel zeigt, wie ein schlechter Anfangsfokus die geschätzte Verzögerungszeit (t lag ) erhöhen kann ( A ), während die angrenzende Position eine kürzere Verzögerungszeit ( B ) aufweist. T d ist die Verdopplungszeit in min und t lag die Verzögerungszeit in min. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig6.jpg" /> Abbildung 6: Beispiel für gut durchgeführte Testversuche. Ein eBeispiel des BY4742-Stammes, der nach dem Austausch einer Wolfram-Halogenbirne mit einem Dioden-Illuminator getestet wurde und sichergestellt wurde, dass der Autofokus korrekt eingestellt ist. Alle verdoppelnden Zeiten scheinen sich gut zu überlappen, und die Verzögerungszeiten scheinen konsistent zu sein. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Wir stellen eine Methode zur Quantifizierung von Wachstumsphänotypen einzelner Hefezellen dar, da sie in festen Medien unter Verwendung der Zeitraffer-Mikroskopie in Kolonien aufwachsen, die als eine zellige Verdopplungsbewertung von lebenden Arrays von Hefe (ODELAY) bezeichnet werden. Die Populations-Heterogenität von genetisch identischen Zellen, die zu Kolonien wachsen, kann direkt beobachtet und quantifiziert werden.

ODELAY: Eine groß angelegte Methode für die Mehrparameter-Quantifizierung des Hefewachstums

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Large-Scale-Bildschirme von Metagenombanken

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Forschung

Biologie

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Batch Immunfärbung für Large-Scale Protein-Nachweis im Whole Affenhirn

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

Isolation und großräumige Ausdehnung der erwachsenen Menschen Endothelial Colony Forming Progenitorzellen

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Large Scale Zebrafisch-Based In-vivo- Small Molecule-Screen

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

Computer-assisted Large-scale Visualization and Quantification of Pancreatic Islet Mass, Size Distribution and Architecture

Computer-assisted Großflächige Visualisierung und Quantifizierung der Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Masse, Größenverteilung und Architektur

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), ...

Yeast Colony Embedding Method

Hefekolonie Embedding-Methode

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

Wachstums-Assays zur Beurteilung Polyglutamin Toxizität in Hefe

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

Multi-Parameter-Messung der Durchlässigkeit Transition Pore Opening in isolierten Maus-Mitochondrien

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Infinium-Assay für Groß SNP Genotypisierung Anwendungen

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Eine Strategie für einfühlsam, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...