Name: odelay: a large-scale method for multi-parameter quantification of yeast growth
Uploaded: 2017-07-03T14:00:00
Duration: 11 min 19 s
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Gli autori riconoscono il sostegno di questo lavoro con borse U54 RR022220 e P50 GM076547 a JDA presso gli Istituti Nazionali di Salute degli Stati Uniti. FDM è un collega postdoctoral con gli Istituti Canadesi per la Ricerca sulla Salute. Ringraziamo inoltre il Centro di Lussemburgo per la Sistemi Biomedicina e l&#39;Università di Lussemburgo per il supporto.

<ol>
	<li>Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van't Riet, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+the+bacterial+growth+curve.">Modeling of the bacterial growth curve.</a> Appl Environ Microbiol. 56 (6), 1875-1881 (1990).</li><li>Sellick, C. A., Campbell, R. N., Reece, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galactose+metabolism+in+yeast-structure+and+regulation+of+the+leloir+pathway+enzymes+and+the+genes+encoding+them.">Galactose metabolism in yeast-structure and regulation of the leloir pathway enzymes and the genes encoding them.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 269, 111-150 (2008).</li><li>Yoshikawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+phenotypic+analysis+for+identification+of+genes+affecting+growth+under+ethanol+stress+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Comprehensive phenotypic analysis for identification of genes affecting growth under ethanol stress in Saccharomyces cerevisiae.</a> FEMS Yeast Res. 9 (1), 32-44 (2009).</li><li>Bryan, A. K., Goranov, A., Amon, A., Manalis, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mass,+density,+and+volume+during+the+cell+cycle+of+yeast.">Measurement of mass, density, and volume during the cell cycle of yeast.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (3), 999-1004 (2010).</li><li>Baryshnikova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+fitness+and+genetic+interactions+in+yeast+on+a+genome+scale.">Quantitative analysis of fitness and genetic interactions in yeast on a genome scale.</a> Nat Methods. 7 (12), 1017-1024 (2010).</li><li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+landscape+of+a+cell.">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327 (5964), 425-431 (2010).</li><li>Collins, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+dissection+of+protein+complexes+involved+in+yeast+chromosome+biology+using+a+genetic+interaction+map.">Functional dissection of protein complexes involved in yeast chromosome biology using a genetic interaction map.</a> Nature. 446 (7137), 806-810 (2007).</li><li>Zackrisson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scan-o-matic:+High-Resolution+Microbial+Phenomics+at+a+Massive+Scale.">Scan-o-matic: High-Resolution Microbial Phenomics at a Massive Scale.</a> G3 (Bethesda). 6 (9), 3003-3014 (2016).</li><li>Bean, G. J., Jaeger, P. A., Bahr, S., Ideker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+ultra-high-density+screening+tools+for+microbial+'omics'.">Development of ultra-high-density screening tools for microbial 'omics'.</a> PloS One. 9 (1), e85177 (2014).</li><li>Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bet+hedging+in+yeast+by+heterogeneous,+age-correlated+expression+of+a+stress+protectant.">Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant.</a> PLoS Biol. 10 (5), e1001325 (2012).</li><li>Herricks, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-Cell+Doubling+Evaluation+by+Living+Arrays+of+Yeast.">One-Cell Doubling Evaluation by Living Arrays of Yeast.</a> ODELAY! G3 (Bethesda). 7 (1), 279-288 (2017).</li><li>Mast, F. D., Ratushny, A. V., Aitchison, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+cell+biology.">Systems cell biology.</a> J Cell Biol. 206 (6), 695-706 (2014).</li><li>Edelstein, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+methods+of+microscope+control+using+&#181;Manager+software.">Advanced methods of microscope control using &#181;Manager software.</a> J Biol Methods. 1 (2), e10 (2014).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il test ODELAY ha diversi punti critici per garantire misure fenotipiche riproducibili e affidabili. Il primo punto critico è la preparazione costante delle colture di lievito. Occorre prestare attenzione a raccogliere le cellule del lievito dalla crescita logaritmica. Se le culture sono saturate, la loro eterogeneità della popolazione sarà aumentata, che può offuscare l&#39;eterogeneità causata da fattori genetici o ambientali ( ad esempio, fonte di carbonio) 11 . Il secondo punto critico è la preparazione coerente dei supporti. In generale, è necessario generare un ampio volume di 10X media media solution e quindi utilizzare nel tempo per ridurre al minimo gli effetti batch. Formulare i supporti in peso, quando possibile, aiuta a migliorare la consistenza del mezzo nel tempo assicurando la densità di agar e il tenore totale dell&#39;acqua dell&#39;agarosio può essere strettamente monitorato. Il terzo punto critico comporta minimizzare o eliminare qualsiasi deformazione meccanica dell&#39;agarosio media. La deformazione meccanica dei supporti si verifica più frequentemente durante la separazione dell&#39;agarosio dalle vetrate. Come per molte tecniche di laboratorio, è necessaria la pratica per capire questo passo. La variazione del tempo di ritardo come mostrato nella figura 4 è spesso correlata a uno dei tre fattori: deformazione meccanica del mezzo agarosio, variazione dello spessore agarizzato o una sorgente luminosa instabile. Se il mezzo di agarosio varia in altezza Z attraverso l&#39;array spotted, la variazione di altezza può superare l&#39;intervallo della routine di autofocus, causando che le immagini iniziali siano leggermente fuori fuoco. Per questo motivo, controllare l&#39;altezza di messa a fuoco in più punti al centro e lungo i bordi della matrice macchiata per assicurare che la routine di autofocus abbia una sufficiente gamma di Z per trovare la messa a fuoco. Se necessario, utilizzare il pannello Autofocus per aumentare l&#39;intervallo di messa a fuoco e aumentare il numero di passi di messa a fuoco. Un terzo possibile conditIone che può portare a un cattivo fuoco è una sorgente luminosa instabile o sfarfallante che può interrompere il punteggio di focalizzazione calcolato per una specifica altezza Z. Le lampade alogene del tungsteno tendono a sfarfallare ben prima che le lampadine bruciano. L&#39;effetto di scarsa attenzione viene osservato in un esempio in cui le curve di crescita inumidiscono tra il primo e il secondo punto temporale ( Figura 5 A ), mentre il punto adiacente non ha lo stesso tuffo ( Figura 5 B ). In questo caso, la scarsa condizione di messa a fuoco è stata alleviata sostituendo la sorgente di luce alogena al tungsteno. In pratica, gli autori hanno scoperto che per ridurre il sfarfallio di lampadine alogene da 100W, le lampadine devono essere sostituite ogni 500 ore circa ogni due mesi quando i microscopi sono sotto uso pesante. Per evitare problemi di messa a fuoco poveri da una lampadina di sfarfallio, sostituire spesso la fonte di luce alogena al tungsteno o sostituire la lampada alogena con una sorgente luminosa a diodi. UnEsempio di un set di dati che mostra una scarsa variabilità dei tempi di raddoppiamento e tempi di ritardo più uniformi è mostrato in Figura 6 . Questo set di dati è stato scattato con un diodo illuminante che fornisce un&#39;illuminazione più stabile nel tempo durante l&#39;esecuzione dell&#39;autofocus. Mentre molti dei punti menzionati qui per ottimizzare la preparazione dei media potrebbero apparire evidenti, nella letteratura gli schermi di grandi dimensioni non si replicano bene tra loro 8 , 11 . Di conseguenza, abbiamo descritto con cura la preparazione di culture e agarosi in modo da generare schermature fenotipiche più riproducibili. Il test ODELAY è attualmente limitato nel throughput se confrontato con i test basati sul pinning come gli array genetici sintetici o il dosaggio Scan-O-Matic. Mentre questi metodi aumentano il numero di ceppi misurati, non hanno la capacità di risolvere singole cellule aE quindi non è possibile misurare l&#39;eterogeneità della popolazione che osserviamo nei ceppi di lievito clonale. L&#39;origine di questa eterogeneità della popolazione non è attualmente compresa, ma la fusione della tecnologia e del calcolo come qui dimostrato offre un&#39;opportunità per affrontare oggettivamente i meccanismi cellulari sottostanti 12 . Gli autori vogliono notare che ODELAY è attualmente ottimizzato solo per uno specifico marchio e tipo di corpo del microscopio. La modifica di ODELAY per altri sistemi di microscopio è diretta, ma richiede la conoscenza dell&#39;API open source 13 . Tuttavia, sia l&#39;API che gli script ODELAY sono scritti per essere facilmente adattati a diversi sistemi e test sperimentali. Mentre ODELAY è stato originariamente sviluppato per il lievito, siamo stati in grado di utilizzarlo senza modifiche per osservare la crescita di Mycobacterium smegmatis . Osservazione dell&#39;altra colonia che formano microrganismi èPossibile con modifiche al codice sorgente fornito 11 . In generale, ODELAY è uno strumento potente e flessibile per confrontare i microrganismi coltivati ​​in condizioni ambientali differenti e perturbazioni genetiche.

I fenotipi di crescita dei microrganismi sono un forte indicatore della loro forma genetica sottostante a una determinata condizione ambientale. La crescita è classicamente segregata in 3 diversi regimi di crescita: la fase a ritardo, la fase log-fase e la fase stazionaria 1 . Ogni fase di crescita può rivelare diversi aspetti della forma fisica che dipendono da varie condizioni ambientali e genetiche. Ad esempio, il tempo di ritardo o la lunghezza di tempo che un organismo trascorre in fase di ritardo prima dell&#39;inizio della crescita esponenziale può essere indicativo della capacità di un organismo di rispondere alle condizioni ambientali alterate 2 . Il tempo di raddoppiamento durante la fase di fase log-phase, la metrica più comune di idoneità cellulare, rivela l&#39;efficienza complessiva dell&#39;abilità di un organismo di dividere metabolizzando e utilizzando materiali ambientali per la replica. La fase stazionaria, in cui la crescita dopo la fase log-fase è rapidamente ridotta, è un altro indicatore di idoneità, che è regolareUtilizzata come punto finale di crescita nei test di crescita del lievito a base di spot. Sono attualmente disponibili diversi test di crescita del lievito e considerati metodi standard per la valutazione dei fenotipi di crescita nel lievito 3 , 4 , 5 . Questi dosaggi sono basati principalmente sui metodi per la coltivazione di lieviti sia su supporti solidi che liquidi. Sui supporti solidi, i test di colonizzazione della colonia trasferiscono un piccolo numero di cellule su agar solido con un perno e le cellule di lievito sono lasciate crescere per un determinato periodo di tempo. Le colonie vengono poi visualizzate e le loro dimensioni vengono confrontate ad un terminale terminale 6 . Questi test di colonizzazione della colonia sono stati dimostrati robusti e scalabili per generare schermi di genoma. Più recentemente, in questi saggi sono state incorporate immagini periodiche con scanner a piatto e telecamere a riflessione a lenti singole (SLR) per registrare la crescita della colonia nel tempo 7 , 8, 9 . Tuttavia, la risoluzione di questi dispositivi impedisce loro di individuare singole celle e, di conseguenza, questi dosaggi della colonia non osservano direttamente il ritardo e non possono osservare variazioni tra le singole cellule che crescono in colonie. I test di crescita a base liquida sono stati impiegati anche per eseguire schermi a livello genomico 3 . Accoppiare un test di crescita liquido con la microscopia a tempo trascorso ha rivelato l&#39;eterogeneità della popolazione nel tempo di raddoppiamento delle cellule geneticamente identiche, che offre una prospettiva importante per comprendere la regolazione genetica e l&#39;adattamento ambientale. Tuttavia, questo dosaggio non misura altri aspetti della crescita, come il tempo di ritardo e la capacità di trasporto 10 . Qui presentiamo un metodo per caratterizzare tutte le tre fasi di crescita dei microrganismi che formano la colonia su supporti solidi usando un saggio di cui abbiamo termine ODELAY 11 . ODELAY consiste di utiliZing la microscopia ad alta velocità di throughput per registrare le immagini delle cellule singole che crescono in colonie su supporti solidi. Questa popolazione di singole cellule che crescono in colonie rivela l&#39;eterogeneità della popolazione che non è rilevata da altre misurazioni meno sensibili come il punteggio finale di terminale. Noi dimostriamo il metodo sul lievito, ma ODELAY può essere applicato a qualsiasi organismo che mostra il contrasto in microscopia a campo luminoso.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1013">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Agarose UltraPure</td>
			<td style="width:131px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">16500500</td>
			<td style="width:413px;">Gel Temp 36C, Gel Strength (1%) 1.2g/sq cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Extract Peptone (YEP)</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Complete Suplement Mixture (CSM)</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MP114560222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Polyethylene Glycol 3350 (av. mol. wt. 3000-3700)</td>
			<td style="width:131px;">SigmaAldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Strain BY4741</td>
			<td style="width:131px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">95400.BY4741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Strain BY4742</td>
			<td style="width:131px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">95400.BY4742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50mL Falcon tubes</td>
			<td style="width:131px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430291</td>
			<td>1 case</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15mL Falcon tubes</td>
			<td style="width:131px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 x 3 inch 1.0mm thick slides 1/2 gross</td>
			<td style="width:131px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48382-179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well plate flat bottom</td>
			<td style="width:131px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:119px;">353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Hydra liquid handleing robot</td>
			<td style="width:131px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">1096-DT-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Hamilton Microlab Star Liquid Handleing Robot</td>
			<td style="width:131px;">Hamilton</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hydra 100 mL tips Extended Length DARTS</td>
			<td style="width:131px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">5527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Synergy H4 Plate Reader</td>
			<td style="width:131px;">Biotek</td>
			<td style="width:119px;">H4MLFAD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Leica DMI6000 B Microscope</td>
			<td style="width:131px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Leica 10X/0.3NA objective</td>
			<td style="width:131px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">11506289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Hamamatsu ORCA Flash 4.0 Camera</td>
			<td style="width:131px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:119px;">C11440-22CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">MATLAB with image processing tool box</td>
			<td style="width:131px;">Mathworks</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">MicroManager</td>
			<td style="width:131px;">Open Imaging</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://micro-manager.org/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">ODELAY Microscope Control (MATLAB scripts and GUI)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>www.aitchisonlab.com\ODELAY for Matlab scripts and software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">ODELAY Microscope Chamber</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>www.aitchisonlab.com\ODELAY for Mechanincal Drawings</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">ODELAY Agar Molds</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>www.aitchisonlab.com\ODELAY for mold drawings</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

odelay: a large-scale method for multi-parameter quantification of yeast growth

I fenotipi di crescita dei microrganismi sono un indicatore forte della loro forma genetica sottostante e possono essere segregati in 3 regimi di crescita: fase a fase di fase, fase log-fase e fase stazionaria. Ogni fase di crescita può rivelare diversi aspetti della forma fisica che sono legati a varie condizioni ambientali e genetiche. Le misurazioni ad alta risoluzione e quantitativa di tutte e tre le fasi di crescita sono generalmente difficili da ottenere. Qui presentiamo un metodo dettagliato per caratterizzare tutte le tre fasi di crescita su supporti solidi usando un saggio chiamato Valutazione delle matrici viventi di lieviti (ODELAY) di una sola cellula. ODELAY ha quantificato i fenotipi di crescita di singole cellule che crescono in colonie su supporti solidi utilizzando microscopia a tempo trascorso. Questo metodo può osservare direttamente l&#39;eterogeneità della popolazione con ogni parametro di crescita in cellule geneticamente identiche che crescono in colonie. Questa eterogeneità della popolazione offre una prospettiva unica per comprendere la regolazione genetica e epigenetica, e le risposte aPerturbazioni genetiche e ambientali. Mentre il metodo ODELAY è dimostrato utilizzando il lievito, può essere utilizzato su qualsiasi microrganismo che produce la colonia che è visibile dalla microscopia a campo luminoso.

<html> Le immagini esemplari di lieviti che crescono in microscopia a tempo trascorso sono mostrate nella Figura 3B . Dopo aver elaborato le immagini di time-lapse, è mostrato in Figura 4 un insieme di dati rappresentativo che confronta i ceppi di lievito BY4741 &amp; BY4742. In questo set di dati di esempio, vi è una scarsa variazione nel tempo di raddoppiamento tra diverse posizioni sulla piastra. Se il mezzo agarosio è preparato male, allora una evidente deviazione sia nel tempo di raddoppiamento che nel tempo di ritardo sarebbe apparente nelle posizioni di scatto che coincidono con la regione deformata del gel agarosio. Mentre i tempi di raddoppiamento sembrano essere relativamente uniformi, questo esempio mostra variazioni nelle misurazioni del tempo di ritardo. Un insieme di dati più coerente è mostrato in Figura 6 . In questo set di dati, sia il tempo di ritardo che il tempo di raddoppiamento sono uniformi. File / ftp_upload / 55879 / 55879fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: Assemblaggio della muffa di agar. I componenti dello stampo agar sono mostrati in ( A ). Montare la base come illustrato in ( B ) e quindi fissare la base con piccoli fermi di legante. Posizionare i pezzi più in posizione longitudinale nella cavità della base ( C ) e quindi incollare le diapositive nello stampo come mostrato in ( D ). Una vista laterale che mostra l&#39;angolo dello stampo e l&#39;orientamento del cerchio di stampo necessario per una separazione uniforme dell&#39;agar dalla slitta di vetro ( E ). Notare la posizione del pollice e dei forefingers, così come la linea retta dell&#39;agar che separa dalla diapositiva ( F ) e nota la freccia orizzontale. La linea di separazione deve spostarsi uniformemente in direzione delle frecce verticali. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> = &quot;Jove_content&quot; per: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig2.jpg" /> Figura 2: Metodo di Sonication e Spotting. Sonicare la piastra in acqua di ghiaccio e utilizzare un supporto per secchi di centrifuga per aiutare a sostenere la piastra ( A ). Posare le piastre dalle fasi 3.8.1 fuori per la macchia sulla piastra agarosa ( B ). Inoltre, predisporre le punte in modo che la scatola sinistra più punta ha una punta nella posizione C10 e poi quattro altri punta con le loro estremità tagliate in modo che non rompino il supporto piastra ( C ). Posizionare i rimanenti rimanenti in quattro scatole in modo che le posizioni interne 24 punte siano occupate ( D ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> 55879fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3: Interfaccia utente grafica ODELAY. Un colpo di schermo dell&#39;interfaccia grafica per &quot;ODELAY_Microscopecontrol.m&quot; ( A ). Questa interfaccia consente di monitorare la fotocamera e di regolare le impostazioni di illuminazione del microscopio per le modalità epifluorescenti e quelle a campo luminoso. Le frecce rosse puntano sui pulsanti Focus e Transmitted che attivano la fotocamera per acquisire rapidamente le immagini e aprire rispettivamente l&#39;otturatore luminoso trasmesso. Le frecce blu vengono utilizzate per spostare lo stadio per l&#39;origine e quindi impostare l&#39;origine con il pulsante &quot;Go Origin&quot; e il pulsante &quot;Set&quot;. Le frecce verdi puntano a &quot;Reset&quot; e &quot;ODELAY !!!&quot; Pulsanti che ripristina le modalità di immagine ODELAY alle condizioni attuali e inizia la collezione di immagini ODELAY. Immagini di lieviti che si coltivano su un mezzo solido a 0, 3, 6 e 9 ore dopo la comparsa ( B ). Un colpo di schermo dell&#39;interfaccia grafica per &quot;ODELAY_IPT.m&quot; o th<html> E ODELAY Strumento di elaborazione delle immagini ( C ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig4.jpg" /> Figura 4: Esempio ODELAY Output. Questo insieme di dati confronta i ceppi BY4741 e BY4742 su supporti YPD. Questa figura è un esempio di uno scivolo agarosico ben preparato; Tuttavia, le impostazioni di autofocus non sono ottimali. I dati presentati in ciascuna colonna, da sinistra a destra, sono: la capacità di carico nel log 2 dell&#39;area colonia; Il tempo di raddoppiamento, dato in min; E tempi di ritardo, dati in min. In questo esempio, i tempi di raddoppiamento di tutti i punti sulla linea di agar si allineano bene con una piccola quantità di tempo di raddoppiamento aumentato verso la colonna. Tuttavia, i tempi di ritardo variano notevolmente in questo set di dati._upload / 55879 / 55879fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig5.jpg" /> Figura 5: Esempi di curva di crescita. Questo esempio dimostra come la focalizzazione iniziale scarsa può causare il tempo di ritardo stimato (t lag ) per aumentare ( A ), mentre la posizione adiacente mostra un tempo di ritardo più breve ( B ). T d è il tempo di raddoppiamento in min e t lag è il tempo di ritardo in min. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig6.jpg" /> Figura 6: Esempio di esperimento di prova eseguito bene. Un eEsemplare del ceppo BY4742 testato dopo aver sostituito una lampadina alogena al tungsteno con un diodo illuminante e assicurando che l&#39;autofocus sia impostato correttamente. Tutti i tempi di raddoppiamento sembrano sovrapporsi bene ei tempi di ritardo sembrano essere coerenti. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Presentiamo un metodo per quantificare i fenotipi di crescita delle singole cellule di lieviti in quanto crescono in colonie su supporti solidi utilizzando la microscopia a tempo scaduto denominata &quot;Valutazione doppia di una sola cellula vivente di lievito&quot; (ODELAY). L&#39;eterogeneità delle popolazioni di cellule geneticamente identiche in colonie può essere direttamente osservata e quantificata.

ODELAY: Metodo su vasta scala per la quantificazione multiparametrica della crescita del lievito

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Su larga scala Schermi di librerie metagenomiche

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Ricerca

Biologia

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Immunostaining lotto per la grande rivelazione di proteine ​​nel cervello della scimmia Whole

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

Isolamento e di espansione su vasta scala di umano adulto cellule progenitrici endoteliali che formano colonie

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Screen piccole molecole

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

Computer-assisted Large-scale Visualization and Quantification of Pancreatic Islet Mass, Size Distribution and Architecture

Assistita da computer su larga scala di visualizzazione e quantificazione della Messa di isole pancreatiche, distribuzione delle dimensioni e architettura

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), ...

Yeast Colony Embedding Method

Lievito Colony metodo di inserimento

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

I saggi di crescita per valutare la tossicità poliglutamina nel lievito

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

Multi-parametro di misura della apertura dei pori di transizione di permeabilità nel Cuore mouse mitocondri isolati

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Infinium Assay per i grandi SNP genotipizzazione Applicazioni

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Una strategia per sensibili, su larga scala quantitative Metabolomica

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...