Name: quadruple immunostaining of the olfactory bulb for visualization of olfactory sensory axon molecular identity codes
Uploaded: 2017-06-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par la Fondation Mitsubishi, la Takeda Science Foundation, JST PRESTO et JSPS KAKENHI Numéro de subvention 16H06144.

Toutes les procédures expérimentales ont été réalisées avec l&#39;approbation du comité d&#39;éthique de l&#39;expérimentation animale à l&#39;Université de Tokyo et selon les directives de l&#39;Université de Tokyo pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire. 1. Préparation des solutions <ol><li> Préparer une solution salée tamponnée au phosphate 0,01 M (PBS): ajouter un comprimé PBS (0,14 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,010 M PO 4 3- , pH 7...

<ol>
	<li>Mori, K., Sakano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+is+the+olfactory+map+formed+and+interpreted+in+the+mammalian+brain?.">How is the olfactory map formed and interpreted in the mammalian brain?.</a> Annu Rev Neurosci. 34, 467-499 (2011).</li><li>Takeuchi, H., Sakano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+map+formation+in+the+mouse+olfactory+system.">Neural map formation in the mouse olfactory system.</a> Cell Mol Life Sci. 71, 3049-3057 (2014).</li><li>Mombaerts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+an+olfactory+sensory+map.">Visualizing an olfactory sensory map.</a> Cell. 87, 675-686 (1996).</li><li>Feinstein, P., Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+contextual+model+for+axonal+sorting+into+glomeruli+in+the+mouse+olfactory+system.">A contextual model for axonal sorting into glomeruli in the mouse olfactory system.</a> Cell. 117, 817-831 (2004).</li><li>Ishii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoallelic+expression+of+the+odourant+receptor+gene+and+axonal+projection+of+olfactory+sensory+neurones.">Monoallelic expression of the odourant receptor gene and axonal projection of olfactory sensory neurones.</a> Genes Cell. 6, 71-78 (2001).</li><li>Nakashima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agonist-independent+GPCR+activity+regulates+anterior-posterior+targeting+of+olfactory+sensory+neurons.">Agonist-independent GPCR activity regulates anterior-posterior targeting of olfactory sensory neurons.</a> Cell. 154, 1314-1325 (2013).</li><li>Serizawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neuronal+identity+code+for+the+odorant+receptor-specific+and+activity-dependent+axon+sorting.">A neuronal identity code for the odorant receptor-specific and activity-dependent axon sorting.</a> Cell. 127, 1057-1069 (2006).</li><li>Kaneko-Goto, T., Yoshihara, S., Miyazaki, H., Yoshihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BIG-2+mediates+olfactory+axon+convergence+to+target+glomeruli.">BIG-2 mediates olfactory axon convergence to target glomeruli.</a> Neuron. 57, 834-846 (2008).</li><li>Ihara, N., Nakashima, A., Hoshina, N., Ikegaya, Y., Takeuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+axon-sorting+molecules+in+mouse+olfactory+sensory+neurons.">Differential expression of axon-sorting molecules in mouse olfactory sensory neurons.</a> Eur J Neuro. 44, 1998-2003 (2016).</li><li>Williams, E. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delta+Protocadherin+10+is+Regulated+by+Activity+in+the+Mouse+Main+Olfactory+System.">Delta Protocadherin 10 is Regulated by Activity in the Mouse Main Olfactory System.</a> Front Neural Circuits. 5, 9 (2011).</li><li>Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+anosmia+caused+by+a+targeted+disruption+of+the+mouse+olfactory+cyclic+nucleotide-gated+cation+channel.">General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel.</a> Neuron. 17, 681-693 (1996).</li></ol>

L&#39;immunocoloration quadruple des sections OB parasagitales a permis de visualiser et de quantifier les niveaux d&#39;expression jusqu&#39;à quatre molécules de tri axones simultanément dans un plus grand nombre de glomérules. En analysant ces données multivariables avec PCA, les caractéristiques de l&#39;expression de ces molécules peuvent être spéculées. Pour une coloration réussie, la préparation des échantillons de tissu est d&#39;une importance critique. Certains protoco...

Pendant le développement, les neurones sont précisément connectés les uns aux autres pour former des circuits neuronaux appropriés, ce qui est essentiel pour la fonction cérébrale normale. Étant donné que les circuits neuronaux aberrants dans le cerveau sont considérés comme la cause de troubles mentaux tels que l&#39;autisme et la schizophrénie, la compréhension des mécanismes de la formation de circuits neuronaux est l&#39;un des principaux défis dans le domaine des neurosciences. Dans le système olfactif de souris, chaque neurone sensoriel olfactif (OSN) dans l&#39;épithélium olfactif (OE) exprime un seul gène de récepteur olfactif fonctionnel et les OSN exprimant le même OR convergent leurs axones à une paire spécifique de glomérules à des emplacements stéréotypés dans le Ampoule Olfactive (OB) 1 , 2 . Le système olfactif de souris est un excellent système modèle pour étudier les mécanismes moléculaires de la formation de circuits neuronaux parce que les chercheurs peuvent utiliser l&#39;expression OR pour identifier une s spécifiqueUbtype des OSN et visualiser les sites de projection des axones OSN comme des structures glomérulaires claires. Une caractéristique remarquable de la projection OSN est que les OR jouent des rôles instructifs dans la projection des axones OSN à l&#39;OB 3 , 4 , 5 , 6 . Plus précisément, après que les axones OSN sont guidés pour approximer les régions cibles, ils sont séparés pour former un glomérule de manière dépendant de l&#39;OR. Des études antérieures ont montré que les molécules OR contrôlent l&#39;expression des molécules de tri d&#39;axones, qui régulent la ségrégation glomérulaire 7 , 8 . De plus, des preuves accumulées suggèrent que les molécules OR génèrent le code d&#39;identité neuronal par une combinaison unique de molécules de tri axonal 9 . Ainsi, pour comprendre le mécanisme de la ségrégation glomérulaire dépendante de l&#39;OR, il est nécessaire de caractériser les profils d&#39;expression du moût de l&#39;axoneDans les OSN. L&#39;immunocoloration fluorescente est une méthode commune pour visualiser l&#39;expression de gènes spécifiques. Étant donné que les protéines des molécules de tri d&#39;axones sont principalement localisées dans les axones OSN, les chercheurs doivent utiliser des sections OB pour caractériser leurs modèles d&#39;expression dans les OSN. La sectionnement coronaire de l&#39;OB a été habituellement utilisée pour l&#39;immunocoloration. Cependant, cette préparation perd l&#39;information topographique le long de l&#39;axe antérieur-postérieur dans la même section OB. Nous avons donc développé une préparation parasagitique du côté médian de l&#39;OB, qui peut monter autant de glomérules environnants que possible sur la même section OB. Combinée avec l&#39;immunocoloration à l&#39;aide d&#39;anticorps multiples, cette préparation permet de comparer et d&#39;analyser les profils d&#39;expression des molécules de tri d&#39;axones sans variation de coloration entre les sections OB. En outre, une méthode de coloration immunohistochimique a été présentée sans post-fixation avec PFA aNd traitement au saccharose. Cette méthode permet aux chercheurs d&#39;obtenir suffisamment de données de coloration de haute qualité pour une analyse de données multivariables. Les protocoles présentés ici fourniront des détails sur les méthodes puissantes pour les chercheurs qui étudient la formation du circuit neuronal olfactif.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="713">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:277px;">Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH7.4</td>
			<td style="width:151px;">TAKARA BIO</td>
			<td style="width:119px;">T9181</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:277px;">Skim Milk</td>
			<td style="width:151px;">nacalai tesque</td>
			<td style="width:119px;">31149-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:277px;">goat anti-Sema7A antibody</td>
			<td style="width:151px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">AF2068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:277px;">rat anti-OLPC antibody</td>
			<td style="width:151px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MABT20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:277px;">mouse anti-VGLUT2 antibody</td>
			<td style="width:151px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MAB5504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:277px;">goat anti-BIG-2 antibody</td>
			<td style="width:151px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">AF2205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:277px;">gunea pig anti-Kirrel2 antibody</td>
			<td style="width:151px;">Operon Biotechnologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Anti-Kirrel2 antibodies were generated by immunizing guinea pigs with KLH-conjugated synthetic peptides (644-673aa): CRLYRARAGYLTTPHPRAFTSYMKPTSFGP</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:277px;">donkey anti-mouse Alexa Fluor 405</td>
			<td style="width:151px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab175658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:277px;">donkey anti-goat Alexa Fluor 488&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">705-545-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:277px;">donkey anti-guinea pig Alexa Fluor 555</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A21432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:277px;">donkey anti-rat Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:151px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">712-605-153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:151px;">Wako</td>
			<td style="width:119px;">162-16065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:277px;">MAS coated slide glasses</td>
			<td style="width:151px;">MATSUNAMI</td>
			<td style="width:119px;">MAS-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:277px;">forceps</td>
			<td style="width:151px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11253-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:277px;">Vannas Spring Scissors</td>
			<td style="width:151px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:277px;">dissecting scissors</td>
			<td style="width:151px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">fluorescent microscope</td>
			<td style="width:151px;">KEYENCE</td>
			<td style="width:119px;">BZ-X700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">DAPI filter cube</td>
			<td style="width:151px;">KEYENCE</td>
			<td style="width:119px;">OP-87762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">GFP filter cube</td>
			<td style="width:151px;">KEYENCE</td>
			<td style="width:119px;">OP-87763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">TRITC filter cube</td>
			<td style="width:151px;">KEYENCE</td>
			<td style="width:119px;">OP-87764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Cy5 filter cube</td>
			<td style="width:151px;">KEYENCE</td>
			<td style="width:119px;">OP-87766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:277px;">filter paper</td>
			<td style="width:151px;">ADVANTEC</td>
			<td style="width:119px;">00011185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:277px;">O.C.T compound</td>
			<td style="width:151px;">Sakura Finetek</td>
			<td style="width:119px;">M71484</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quadruple immunostaining of the olfactory bulb for visualization of olfactory sensory axon molecular identity codes

Le système olfactif de souris est souvent utilisé pour étudier les mécanismes de formation de circuits neuronaux en raison de sa structure anatomique simple. Un neurone sensoriel olfactif (OSN) est une cellule bipolaire avec un seul dendrite et un seul axone non ramifié. Un OSN n&#39;exprime qu&#39;un seul gène de récepteur olfactif (OR), les OSN exprimant un type donné d&#39;OR convergent leurs axones à quelques ensembles de glomérules invariants dans l&#39;ampoule olfactive (OB). Une caractéristique remarquable de la projection OSN est que les OR exprimés jouent des rôles instructifs dans la projection axonale. Les ORs régulent l&#39;expression de multiples molécules de tri d&#39;axones et génèrent le code moléculaire combinatoire des molécules de tri d&#39;axones à la terminaison axonale OSN. Ainsi, pour comprendre les mécanismes moléculaires des mécanismes de guidage de l&#39;axone spécifiques à l&#39;OR, il est essentiel de caractériser leurs profils d&#39;expression au terminus de l&#39;axone OSN dans le même glomérule. Le but de cet article était d&#39;introduire des méthodes pour collecter autant de glomérules que possibleE sur une seule section OB et pour effectuer l&#39;immunocoloration en utilisant plusieurs anticorps. Cela permettrait la comparaison et l&#39;analyse des modèles d&#39;expression des molécules de tri d&#39;axones sans variation de coloration entre les sections OB.

La carte glomérulaire olfactive est formée par un ciblage global initial et une ségrégation glomérulaire subséquente des axones 1 , 2 de l&#39;OSN. La ségrégation glomérulaire est régulée par les interactions axiales adhésives / répulsives médiées par des molécules de tri axonomique dont les niveaux d&#39;expression sont déterminés par des molécules OU 7 exprimées. Les molécules de tri...

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Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

Les neurones sensoriels olfactifs expriment une grande variété de molécules de tri d&#39;axones pour établir des circuits neuronaux appropriés. Ce protocole décrit une méthode de coloration immunohistochimique pour visualiser les expressions combinatoires des molécules de tri d&#39;axones aux extrémités axonaires des neurones sensoriels olfactifs.

Immunomarquage quadruple de l&#39;ampoule olfactive pour la visualisation des codes d&#39;identité moléculaire des axes sensoriels olfactifs

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Réponses Analyse des souris neurones sensoriels olfactifs Utilisation de l&#39;enregistrement Electroolfactogram Air-phase

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

Recherche

Neurosciences

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

Isoler les cellules souches nasal olfactif des rongeurs ou des êtres humains

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Lentivirus médiée par manipulation génétique et de visualisation des neurones sensoriels olfactifs In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

Cibler les neurones Bulbe olfactif Utiliser combiné In Vivo L&#39;électroporation et de Gal4-Based Enhancer Piège Lignes Zebrafish

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolyse des composés en cage dans les cils olfactifs des neurones sensoriels

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

Activités d&#39;imagerie Odeur évoqués dans le bulbe olfactif de la souris en utilisant la réflectance optique et Signaux Autofluorescence

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Un indicateur moléculaire de l&#39;adaptation à long terme olfactive dans<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Tout le mont immunomarquage des récepteurs olfactifs neurones dans le<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenne

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Olfactory Assays for Mouse Models of Neurodegenerative Disease

Les tests olfactifs pour les modèles murins de maladies neurodégénératives

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo préparatifs de l&#39;ampoule Vomeronasal organes et accessoire olfactive Intact

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...