Name: ultrahigh resolution mouse optical coherence tomography to aid intraocular injection in retinal gene therapy research
Uploaded: 2018-11-02T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ultrahigh Resolution Mouse Optical Coherence Tomography to Aid Intraocular Injection in Retinal Gene Therapy Research at JoVE.com

Dieses Material basiert auf der Arbeit unterstützt, unter anderem durch das Department of Veterans Affairs (VA), Veterans Health Administration, Office of Research und Development (biomedizinische Forschung im Labor und Entwicklung) (VA Verdienst Grant 1I01BX000669). JMS ist, teilweise als Arzt-Mitarbeiterin, Augenheilkunde, VA WNY angestellt; MCB wird teilweise von VA WNY beschäftigt. Die Studie wurde an durchgeführt und teilweise von der Veterans Administration Western New York Healthcare System (Buffalo, NY) unterstützt. Inhalt repräsentieren nicht die Ansichten des Department of Veterans Affairs oder Regierung der Vereinigten Staaten. Auch unterstützt, im großen Teil durch NIH/NEI R01 gewähren EY013433 (PI: JMS), NIH/NEI R24 gewähren EY016662 (UB Vision Center Infrastruktur, PI: M Schlachtung, Generaldirektor der Biophotonik-Modul: JMS), einen uneingeschränkten Stipendiums an der Abteilung Ophthalmologie/Universität in Büffel aus der Forschung zu verhindern, dass Blindheit (New York, NY), und ein Stipendium der Oishei Stiftung (Buffalo, NY). Wir anerkennen die Gabe der hC1 transgenen RHOP347S Linie und die Exon 1 Maus RHO Knockout von Dr. Janis Lem (Tufts-New England Medical Center, Boston, MA) und das Geschenk des Modells NHR-E Transgen im heterozygoten Zustand auf die Maus Exon 2 RHO Ko-Hintergrund von DRS. G. Jane Farrar und Peter Humphries (Trinity College, Dublin, IRE).

Tier-Protokolle wurden überprüft und genehmigt durch die institutionelle Animal Care und Nutzung Ausschüsse des VA WNY HCS und der University at Buffalo-SUNY. Tiere wurden nach den Vorgaben des Vereins for Research in Vision und Ophthalmology (ARVO) und der Deklaration von Helsinki eingesetzt.
(1) Maus-Modellen
<ol><li>Identifizieren Sie Maus-Modellen einschließlich Kontrollen ausgewertet werden. Hinweis: Bildgebung erfolgte für eine C57BL/6(J), hC1/hC1 / / mWT/mWT, ...

<ol>
	<li>Regus-Leidig, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+knockdown+of+Piccolino+disrupts+presynaptic+ribbon+morphology+in+mouse+photoreceptor+synapses.">In-vivo knockdown of Piccolino disrupts presynaptic ribbon morphology in mouse photoreceptor synapses.</a> Front Cell Neurosci. 8 (259), 1-13 (2014).</li><li>Jiang, L., Frederick, J. M., Baehr, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+gene+therapy+in+dominant+retinitis+pigmentosa+and+cone-rod+dystrophy+mouse+models+caused+by+GCAP1+mutations.">RNA interference gene therapy in dominant retinitis pigmentosa and cone-rod dystrophy mouse models caused by GCAP1 mutations.</a> Front Mol Neurosci. 7 (25), 1-8 (2014).</li><li>Seo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+gene+therapy+of+mice+with+Bardet-Beidl+Syndrome+Type-1.">Subretinal gene therapy of mice with Bardet-Beidl Syndrome Type-1.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (9), 6118-6132 (2013).</li><li>Molday, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RD3+gene+delivery+restores+guanylate+cyclase+localization+and+rescues+photoreceptors+in+the+RD3+mouse+model+of+Leber+congenital+amaurosis+12.">RD3 gene delivery restores guanylate cyclase localization and rescues photoreceptors in the RD3 mouse model of Leber congenital amaurosis 12.</a> Hum. Mol. Genet. 22 (19), 3894-3905 (2014).</li><li>Pang, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+gene+therapy+in+mouse+models+of+recessive+retinal+degeneration.">AAV-mediated gene therapy in mouse models of recessive retinal degeneration.</a> Curr. Mol. Med. (3), 316-330 (2012).</li><li>Vandenberghe, L. H., Auricchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+adeno-associated+viral+vectors+for+retinal+gene+therapies.">Novel adeno-associated viral vectors for retinal gene therapies.</a> Gene Ther. 19 (2), 162-168 (2012).</li><li>Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+risks+related+to+the+use+of+adeno-associated+virus-based+vectors.">Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors.</a> Curr. Gene Ther. 3 (6), 545-565 (2003).</li><li>Parikh, S., Le, A., Davenport, J., Gorin, M. B., Nusinowitz, S., Matynia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+and+validated+injection+method+for+accessing+the+subretinal+space+via+a+transcleral+posterior+approach.">An alternative and validated injection method for accessing the subretinal space via a transcleral posterior approach.</a> J. Vis. Exp. (118), e54808 (2016).</li><li>Bainbridge, J. W. B., Mistry, A. R., Thrasher, A. J., Ali, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+ocular+angiogenesis.">Gene therapy for ocular angiogenesis.</a> Clinical Science. 104, 561-575 (2003).</li><li>Igarashi, T., Miyake, K., Asakawa, N., Miyake, N., Shimada, T., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparison+of+administration+routes+for+AAV-8+mediated+ocular+gene+therapy.">Direct comparison of administration routes for AAV-8 mediated ocular gene therapy.</a> Curr. Eye Res. 38 (5), 569-577 (2013).</li><li>Bennett, J., Duan, D., Engelhardt, J. F., Maguire, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+noninvasive+in+vivo.assessment+of+adeno-associated+virus-mediated+retinal+transduction.">Real-time noninvasive in vivo.assessment of adeno-associated virus-mediated retinal transduction.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 38, 2857-2863 (1997).</li><li>Ruggeri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+three-dimensional+high-resolution+imaging+of+the+rodent+retinal+with+spectral-domain+optical+coherence+tomography.">In vivo three-dimensional high-resolution imaging of the rodent retinal with spectral-domain optical coherence tomography.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (4), 1808-1814 (2007).</li><li>Berger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+domain+optical+coherence+tomography+of+the+rodent+eye:+highlighting+layers+of+the+outer+retina+using+signal+averaging+and+comparison+with+histology.">Spectral domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology.</a> PLoS One. 9 (5), 96494 (2014).</li><li>Dysli, C., Enzmann, V., Sznitman, R., Zinkernagel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+mouse+retinal+layers+using+automated+segmentation+of+spectral+domain+optical+coherence+tomography+images.">Quantitative analysis of mouse retinal layers using automated segmentation of spectral domain optical coherence tomography images.</a> TVST. 4 (4), 9 (2015).</li><li>Bhootada, Y., Choudhury, S., Gully, C., Gorbatyuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+caspase-12+to+preserve+vision+in+mice+with+inherited+retinal+degeneration.">Targeting caspase-12 to preserve vision in mice with inherited retinal degeneration.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56, 4725-4733 (2015).</li><li>Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+injection+of+gene+therapy+vectors+and+stem+cells+in+the+perinatal+mouse+eye.">Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye.</a> J. Vis. Exp. (69), e4286 (2012).</li><li>Berger, A., al, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral-domain+optical+coherence+tomography+of+the+rodent+eye:+highlighting+layers+of+the+outer+retina+using+signal+averaging+and+comparison+with+histology.">Spectral-domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology.</a> PLoSOne. 9 (5), 96494 (2014).</li><li>Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garrido, M. G., Biel, M., Seeliger, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+technique+for+subretinal+injections+in+mice.">Optimized technique for subretinal injections in mice.</a> Methods in Molecular Biology. , (2013).</li><li>Sarra, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+transgene+expression+in+mouse+retina+following+subretinal+injection+of+recombinant+adeno-associated+virus.">Kinetics of transgene expression in mouse retina following subretinal injection of recombinant adeno-associated virus.</a> Vision Res. 42, 541-549 (2002).</li><li>Yan, Q. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-corneal+subretinal+injection+in+mice+and+its+effect+on+the+function+and+morphology+of+the+retina.">Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina.</a> PLoS One. 10 (8), 0136523 (2015).</li><li>Park, S. W., Kim, J. H., Park, W. J., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbal+approach-subretinal+injection+of+viral+vectors+for+gene+therapy+in+mice+retinal+pigment+epithelium.">Limbal approach-subretinal injection of viral vectors for gene therapy in mice retinal pigment epithelium.</a> J. Vis. Exp. (102), e53030 (2015).</li><li>Westenskow, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performing+subretinal+injections+in+rodents+to+deliver+retinal+pigment+epithelium+cells+in+suspension.">Performing subretinal injections in rodents to deliver retinal pigment epithelium cells in suspension.</a> J. Vis. Exp. (95), e52247 (2015).</li><li>Butler, M. C., Sullivan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+real-time,+in+vivo+mouse+retinal+imaging+system.">A novel, real-time, in vivo mouse retinal imaging system.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56 (12), 7159-7168 (2015).</li><li>Rolling, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+adeno-associated+virus-mediated+gene+transfer+into+the+rat+retina+by+clinical+fluorescence+photography.">Evaluation of adeno-associated virus-mediated gene transfer into the rat retina by clinical fluorescence photography.</a> Hum. Gene Ther. 10, 641-648 (1999).</li><li>Ferguson, L. R., Grover, S., Dominguez, J. M., Balaiya, S., Chalam, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+thickness+measurement+obtained+with+spectral+domain+optical+coherence+tomography+assisted+optical+biopsy+accurately+correlates+with+ex+vivo+histology.">Retinal thickness measurement obtained with spectral domain optical coherence tomography assisted optical biopsy accurately correlates with ex vivo histology.</a> PLoS One. 9 (10), 111203 (2014).</li><li>Li, T., Snyder, W. K., Olsson, J. E., Dryja, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+carrying+the+dominant+rhodopsin+mutation+P347S:+evidence+for+defective+vectorial+transport+of+rhodopsin+to+the+outer+segments.">Transgenic mice carrying the dominant rhodopsin mutation P347S: evidence for defective vectorial transport of rhodopsin to the outer segments.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 14176-14181 (1996).</li><li>Brill, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+form+of+transducin-dependent+retinal+degeneration:+accelerated+retinal+degeneration+in+the+absence+of+rod+transducing.">A novel form of transducin-dependent retinal degeneration: accelerated retinal degeneration in the absence of rod transducing.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48, 5445-5453 (2007).</li><li>Olsson, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+with+a+rhodopsin+mutation+(Pro23His):+a+mouse+model+of+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa.">Transgenic mice with a rhodopsin mutation (Pro23His): a mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa.</a> Neuron. 9, 815-830 (1992).</li><li>Humphries, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinopathy+induced+in+mice+by+targeted+disruption+of+the+rhodopsin+gene.">Retinopathy induced in mice by targeted disruption of the rhodopsin gene.</a> Nat. Genet. 15, 216-219 (1997).</li><li>Hruby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+examination+of+the+vitreous+body.">Clinical examination of the vitreous body.</a> Proc. Roy. Soc. Med. 47, 163-170 (1953).</li><li>Kolniak, T. A., Sullivan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cell-based+toxicity+screen+of+potentially+therapeutic+post-transcriptional+gene+silencing+agents.">cell-based toxicity screen of potentially therapeutic post-transcriptional gene silencing agents.</a> Experimental Eye Research. 92, 328-337 (2011).</li><li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-corneal+subretinal+injection+in+mice+and+its+effect+on+the+function+and+morphology+of+the+retina.">Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina.</a> PLoS One. 10 (8), 0136523 (2015).</li><li>Timmers, A. M., Zhang, H., Squitieri, A., Gonzalez-Pola, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+injections+in+rodent+eyes:+effects+on+electrophysiology+and+histology+of+rat+retina.">Subretinal injections in rodent eyes: effects on electrophysiology and histology of rat retina.</a> Mol. Vis. 7, 131-137 (2000).</li><li>Johnson, C. J., Berglin, L., Chrenek, M. A., Redmond, T. M., Boatright, J. H., Nickerson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+brief:+subretinal+injection+and+electroporation+into+adult+mouse+eyes.">Technical brief: subretinal injection and electroporation into adult mouse eyes.</a> Mol. Vis. 14, 2211-2226 (2008).</li><li>Sullivan, J. M., Yau, E. H., Taggart, R. T., Butler, M. C., Kolniak, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottlenecks+in+development+of+therapeutic+post-transcriptional+gene+silencing+agents.">Bottlenecks in development of therapeutic post-transcriptional gene silencing agents.</a> Vision Res. 48, 453-469 (2008).</li></ol>

HR-SD-OCT bietet eine einfache Methode zur Charakterisierung von potenziellen Tiermodellen der Krankheit beim Menschen zu bestimmen, ihre Nützlichkeit bei der Prüfung möglicher Therapeutika. Die Fähigkeit, schnell und zuverlässig eine potenzielle Tiermodell für menschliche Krankheiten zu charakterisieren ist entscheidend für den Prozess der therapeutischen Arzneimittelforschung (z.B.gen-Ersatz-Therapie, Ribozyme oder ShRNA Knockdown Gentherapie, kombinierte Gentherapie). HR-SD-OCT bietet eine einfache, sc...

Forscher entwickeln Gentherapien für eine Vielzahl von Netzhaut und Netzhaut degenerativen Erkrankungen mit der Hoffnung der Übersetzung neuen Therapeutika in Behandlungen für menschliche Krankheit1,2,,3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. Zeitbereich oder spectral-Domain optische Kohärenztomographie (SD-OCT) verwendet wurde, um die Aspekte der äußeren Netzhautdegeneration bei bestimmten Mausmodellen Krankheit12,13,14 untersuchen . HR-SD-OCT wurde nicht jedoch ausgiebig im Zusammenhang mit der Optimierung der Bewertung von Mausmodellen verwendet, um festzustellen, die Rate und räumliche Homogenität der Netzhautdegeneration oder im Rahmen der präklinischen Bewertung des Gens basierten Therapeutika, z. B. zu bewerten Sie Rettung, Toxizität oder der räumlichen Ausdehnung der Vektor Lieferung8,15,16. Sobald ein Maus-Modell vollständig charakterisiert ist, können die HR-SD-OCT Daten als eine informative und zuverlässige Ressource, um die Auswirkungen der Therapeutika Rettungs- oder Toxizität in Mausmodellen der Netzhautdegeneration17ausüben zu dienen. Viele Gruppen nutzen subretinale Injektion als eine Methode der Vektor Lieferung aufgrund seiner Effizienz bei transducing Photorezeptoren und retinalen Pigmentepithels (RPE) Pigmentzellen. Dies bleibt jedoch eine schwierige Methode zu meistern, angesichts der Tatsache, dass es in der Regel durch frei-Hand-Chirurgie von der Hornhautoberfläche erfolgt und oft mit Katarakt ist, Blutungen und unbeabsichtigte Netzhautablösungen auftritt, einfach durch Manipulation der hinteren Glaskörper. Viele Gruppen noch versuchen subretinale Injektionen blind und liefern das Virus mit manuellen Injektionen mit relativ großem Durchmesser Edelstahl Nadeln (34G)8,17,18,19 ,20,21,22und ein paar nutzt optische Kohärenztomographie (OCT) Bildgebung zur Bestätigung der ordnungsgemäßen Auslieferung des Vektors auf die Netzhaut8,17, 20 , 22. einige Verbesserungen in der Methode haben vor kurzem mit Microscale Nadeln, angetrieben von einem Mikromanipulator22beschrieben.
Wir präsentieren einen integrierten Ansatz hilft bei der Positionierung der Nadel und die Injektionen werden erleichtert durch eine benutzerdefinierte gerichtete Stereo-Ophthalmoskop entwickelt im Labor speziell für die Visualisierung im Inneren des kleinen Auges der Maus17, 23. die Verwendung von gezogenem Glas Mikronadeln in Verbindung mit der stereotaktischen Mikromanipulator bieten bessere Kontrolle der Nadelplatzierung mit keine chirurgischen Schnitt nach unten erforderlich (z. B. durch Bindehautrötung und Bindegewebe) vor dem Injektion. Die Verwendung des Drucks geregelt Mikro Injektor hilft liefern konsistente Einspritzmengen und die Injektion möglich ist, mit wesentlich höherer Stabilität, Präzision und viel langsamer als manuelle Injektionen durchgeführt durch eine handgeführte Spritze, dadurch verringert die Auftreten von Blase Injektion in das Auge. Die kleinere Nadel verhindert Leckage nach Nadel Rückzug, da der Pfad selbstdichtend ist. Um das Ausmaß der Injektion/Lieferung bewerten, verlassen viele Ermittlungsgruppen zu finden und zu beurteilen, inwieweit der erweiterten grün fluoreszieren (EGFP) Proteinexpression in der Netzhaut (Ausdruck Konstrukt geliefert durch den Vektor) areal am experimentellen Ende Punkt (Euthanasie) zur Bestätigung der erfolgreichen Injektionen11,19,20,24. Diesen Ansatz (OCT nicht nutzen), um sicherzustellen, dass chirurgische Erfolg verschwendet eine enorme Menge an Ressourcen chirurgische Verfahren Zeit-und Tiere, da alle Tiere mit (unbekannten) chirurgische Fehler werden, gefolgt mit sich wiederholenden Maßnahmen bis gepflegt müssen Euthanasie und Auge zu ernten (wenn EGFP gemessen wird). Bestätigung des Standortes der Injektion in der Netzhaut kann mit HR-SD-OCT um zu zeigen, dass die Injektion befindet sich zwischen der korrekten Schichten der Netzhaut (d. h. den subretinalen Raum) verbessert werden. HR-SD-OCT kann auch verwendet werden, sofort erfolglose versuchen (chirurgische Fehler) relevante Variablen in realen chirurgischen Zeit Verbesserung auf dem Ansatz identifizieren abzugrenzen. Wir fanden, dass HR-SD-OCT zahlreiche Vorteile im präklinischen gen Therapiestudien stellt ermöglicht schnelle quantitative Bewertung der äußeren Netzhautdegeneration ermöglicht Identifikation/Keulung von Versuchstieren die experimentelle Kriterien ( nicht entsprechen z. B. falsche subretinale Injektion), und auf direkte Follow-up-Bildgebung in der Region des Auges, wo Vektor geliefert wurde (wobei präklinische Wirkung am wahrscheinlichsten ist) sowie die Steuern Regionen wo Vektor wurde nicht übermittelt. Seit seiner Entwicklung, die Verwendung von SD-OCT hat weiterhin akzeptiert und von Augenheilkunde Forschern genutzt werden und gilt heute als den Standard der retinale Bildgebung in der Netzhaut wissenschaftliche Studien in der Maus oder Nagetier Modelle13,25. HR-SD-OCT und seine Software-Funktionen wurden in einzigartigen integrierten Möglichkeiten, um das Ziel der erfolgreichen Quantitative Gentherapie in Mausmodellen bei jedem Schritt in diesem Prozess, einschließlich Tiermodell Auswahl, Charakterisierung der Degeneration in gewählten weiter genutzt. Krankheitsmodelle, therapeutische Lieferung, Zuordnung von Vektor-Lieferung und Beurteilung der Toxizität/Wirksamkeit. Die Verwendung von HR-SD-OCT ermöglicht eine effizientere Wirkstoffforschung auf allen Ebenen des Prozesses. Hier beschreiben wir diese Ansätze, mit denen in unserem RNA Drug Discovery-Programm.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:775px;" width="774">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">C57BL6 (J)</td>
			<td style="width:245px;">Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:215px;">664</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">N129R-</td>
			<td style="width:245px;">N/A</td>
			<td style="width:215px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">2HRho 1T/1T</td>
			<td style="width:245px;">N/A</td>
			<td style="width:215px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="78" style="height:78px;width:251px;">Envisu R-2200 Ocular Coherence Tomography Instrument (OCT)</td>
			<td style="width:245px;">Bioptigen</td>
			<td style="width:215px;">90-R2200-U1-120.&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Retinal Imaging System (RIS)</td>
			<td style="width:245px;">In-house</td>
			<td style="width:215px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Stemi 2000C Microscope</td>
			<td style="width:245px;">Zeiss</td>
			<td style="width:215px;">000000-1106-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">P-97 Flaming/Brown micropipette puller</td>
			<td style="width:245px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:215px;">p-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">MMN-33 micro manipulator&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Narishige USA</td>
			<td style="width:215px;">MMN-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">PLI-100&#160; micro injector</td>
			<td style="width:245px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:215px;">64-1736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Micropipette Holder (Rotating)</td>
			<td style="width:245px;">In-house</td>
			<td style="width:215px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Micropipette Storage Receptacle</td>
			<td style="width:245px;">World Precision Instruments Inc.</td>
			<td style="width:215px;">E210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">&#160;Borosilicate glass capillary tubes 1.5-1.8 X 100mm,&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:215px;">30-0053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">2,2,2-Tribromoethanol</td>
			<td style="width:245px;">SIGMA Aldrich</td>
			<td style="width:215px;">T48402-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Tert-amyl Alcohol</td>
			<td style="width:245px;">SIGMA Aldrich</td>
			<td style="width:215px;">240486-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Atropine Sulfate Ophthalmic Solution, USP 1%</td>
			<td style="width:245px;">Akorn Inc.</td>
			<td style="width:215px;">NDC 17478-215-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Goniovisc</td>
			<td style="width:245px;">BioVision Limited</td>
			<td style="width:215px;">NDC 17238-610-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Cyclopentolate Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP&#160; 2%</td>
			<td style="width:245px;">Akorn Inc.</td>
			<td style="width:215px;">NDC 17478-097-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Gentamicin Sulfate Ointment USP, 0.1%</td>
			<td style="width:245px;">Perigo</td>
			<td style="width:215px;">NDC 45802-046-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Systane Ultra</td>
			<td style="width:245px;">Alcon Laboratories, Inc.</td>
			<td style="width:215px;">9006619-1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Tetracaine Hydrochloride</td>
			<td style="width:245px;">Bausch and Lomb</td>
			<td style="width:215px;">NDC 24208-920-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Ophthalmic Solution, USP 0.5%</td>
			<td style="width:245px;">Bausch and Lomb</td>
			<td style="width:215px;">NDC 24208-920-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">DPBS</td>
			<td style="width:245px;">Gibco Life Technologies</td>
			<td style="width:215px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Virus Preparations</td>
			<td style="width:245px;">ViGene /UNC</td>
			<td style="width:215px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Gold nanorods</td>
			<td style="width:245px;">NANOPARTz</td>
			<td style="width:215px;">D12M-850-1.75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Fluorescein Sulfate AK-FLUOR 25%</td>
			<td style="width:245px;">Akorn Inc.</td>
			<td style="width:215px;">NDC 17478-250-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Coverslips</td>
			<td style="width:245px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:215px;">12-548-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Forceps</td>
			<td style="width:245px;">Milton</td>
			<td style="width:215px;">18-825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Needles 30 guage</td>
			<td style="width:245px;">Beckton Dickenson&#160;&#160;</td>
			<td style="width:215px;">W11604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Syringes</td>
			<td style="width:245px;">Beckton Dickenson&#160;&#160;</td>
			<td style="width:215px;">309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Bioptigen software Package</td>
			<td style="width:245px;">Bioptigen</td>
			<td style="width:215px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 0.5%</td>
			<td style="width:245px;">Akorn Inc.</td>
			<td style="width:215px;">NDC 17478-263-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Windows Excel</td>
			<td style="width:245px;">Microsoft</td>
			<td style="width:215px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Adobe Illustrator</td>
			<td style="width:245px;">Adobe&#160;</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Scale</td>
			<td style="width:245px;">Mettler</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Scissors</td>
			<td style="width:245px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Ear punch</td>
			<td style="width:245px;">Nat&#8217;l band</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">CL 100 Light source</td>
			<td style="width:245px;">Welch Allyn</td>
			<td style="width:215px;">CL100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Nitrogen Gas</td>
			<td style="width:245px;">Jackson Welding Supply</td>
			<td style="width:215px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Heated Water bath</td>
			<td style="width:245px;">Neslab</td>
			<td style="width:215px;">RTE-140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Heating plate</td>
			<td style="width:245px;">In House</td>
			<td style="width:215px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Heating mat</td>
			<td style="width:245px;">Cincinnatti Sub Zero</td>
			<td style="width:215px;">273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Clay mouse holder</td>
			<td style="width:245px;">Plast.i.clay American Art Clay Co.</td>
			<td style="width:215px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Betadine</td>
			<td style="width:245px;">MedLine&#160;</td>
			<td style="width:215px;">NDC53329-938-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Cotton Tip Applicators</td>
			<td style="width:245px;">American Health Service</td>
			<td style="width:215px;">Ctag</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">EtOH 70%</td>
			<td style="width:245px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:215px;">BP2818-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Gloves Nitrile</td>
			<td style="width:245px;">VWR</td>
			<td style="width:215px;">89038-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Diagnosys ERG Color Dome instrument</td>
			<td style="width:245px;">Diagnosys Inc.</td>
			<td style="width:215px;">D125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Contact lenses</td>
			<td style="width:245px;">In-house</td>
			<td style="width:215px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Diagnosys Software</td>
			<td style="width:245px;">Diagnosys Inc.</td>
			<td style="width:215px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Origin 6.1 software</td>
			<td style="width:245px;">OriginLab Corp.</td>
			<td style="width:215px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Reference electrodes</td>
			<td style="width:245px;">Ocuscience</td>
			<td style="width:215px;">F-Thread Electrode (DTL) 24&#8221;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultrahigh resolution mouse optical coherence tomography to aid intraocular injection in retinal gene therapy research

HR-SD-OCT wird genutzt, um das Fortschreiten der Degeneration der Photorezeptoren in live Mausmodellen überwachen, bewerten die Lieferung von Therapeutika in den subretinalen Raum und Toxizität und Wirksamkeit in Vivozu bewerten. HR-SD-OCT in der Nähe von Infrarot-Licht (800-880 nm) verwendet und hat Optik speziell für die einzigartige Optik des Auges Maus mit Sub-µm-2 axiale Auflösung ausgelegt. Transgenen Mausmodellen der äußeren Netzhaut (Photorezeptoren) Degeneration und Steuerelemente wurden abgebildet, um das Fortschreiten der Erkrankung zu bewerten. Gezogenem Glas Mikronadeln wurden verwendet, um Sub retinalen Injektionen von Adeno-assoziierte Virus (AAV) oder Nanopartikeln (NP) über einen Trans-skleralen und Trans-choroidale Ansatz liefern. Sorgfältige Positionierung der Nadel in den subretinalen Raum bedurfte es vor einem kalibrierten Druck Injektion, die Flüssigkeit in den Sub-Netzhaut-Raum liefert. Real-Time subretinalen Chirurgie wurde auf unserer Netzhaut imaging-System (RIS) durchgeführt. HR-SD-OCT demonstriert schrittweise einheitliche Netzhautdegeneration durch Ausdruck einer toxischen mutierten menschlichen mutierten Rhodopsin (P347S) (RHOP347S) Transgene Mäuse. HR-SD-OCT ermöglicht konsequente Quantifizierung der Netzhaut Schichten. Nukleare Außenschicht (ONL) Dicke und Photorezeptor äußere Segment Länge (OSL) Messungen korrelieren mit Photorezeptor Vitalität, Degeneration oder Rettung. Die RIS-Delivery-System ermöglicht Echtzeit-Visualisierung von subretinalen Injektionen bei Neugeborenen (~ P10-14) oder erwachsener Mäuse und HR-SD-OCT sofort Karten areal Umfang und entscheidet über den Erfolg der Lieferung. HR-SD-OCT ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das den Erfolg der subretinalen Chirurgie bei Mäusen, zusätzlich zur Vitalität der Photorezeptoren in VivoMessung auswerten können. HR-SD-OCT kann auch verwendet werden, um einheitliche Tier Kohorten um das Ausmaß der Degeneration der Netzhaut, Toxizität und therapeutische Rettung in präklinischen Forschung Gentherapiestudien bewerten zu identifizieren.

Bewertung der Anwesenheit, Rate und Einheitlichkeit der äußeren Netzhautdegeneration Modell Messungen der ONL waren ELM, definieren die Grenzen der ONL mit dem Bremssattel-Werkzeug in der Gerätesoftware zur Verfügung gestellt von der OPL aufgezeichnet. Ziel war es, das Fortschreiten der äußeren Netzhautdegeneration in einem Mausmodell teilweise vermenschlichten AdRP zuordnen. Vergleichbare Bilder aus einer Kontrolle C57BL/6(J) Maus und ein hC1/hC1 / / mWT/mWT-Mau...

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Ultrahigh Resolution Mouse Optical Coherence Tomography to Aid Intraocular Injection in Retinal Gene Therapy Research

Hier zeigen wir einen neuartigen Ansatz zur Verwendung von hochauflösenden spectral-Domain optische Kohärenztomographie (HR-SD-OCT) Lieferung der Gen-Therapie-Agenten in den subretinalen Raum zu unterstützen, beurteilen seine areal Abdeckung und Photorezeptor Vitalität zu charakterisieren.

Höchste Auflösung Maus optische Kohärenztomographie, intraokulare Injektion in die retinale Gentherapie Forschung unterstützen

HR-SD-OCT is utilized to monitor the progression of photoreceptor degeneration in live mouse models, assess the delivery of therapeutic agents into the ...

Das übergeordnete Ziel dieses subretinalen Injektionsverfahrens ist es, einen Vektor auf minimal-invasive und reproduzierbare Weise an die Netzhaut zu liefern, der in Echtzeit beobachtbar ist. Hallo, diese Methode kann verwendet werden, um wichtige Fragen in der Gentherapie-Forschung über Vektor-Lieferwirksamkeit und therapeutische Agent Toxizität zu beantworten. Einige Vorteile dieser Technik sind minimale Schäden an der Netzhaut und anderen Augenstrukturen, präzise Injektionsstellenundierung und strenge quantitative In-vivo-Messungen, die solide statistische Rückschlüsse ermöglichen.Für die intraokulare Transgeninjektion eine anästhesierte Maus zuerst auf die Betrachtungsstufe eines retinalen Bildgebungssystemmikroskops legen und die Spitzen einer sterilen stumpfen Iriszange an den sieben und 10 Uhr Positionen des Augenlids platzieren, während die Zange auf und ab gedrückt wird, um sanft Proptose zu induzieren. Verwenden Sie die Zange, um die Augenlider unter der Augenkugel zu koaxieren und die Spitze der Nadel auf etwa ein bis 1,5 Millimeter unter dem Rand des Hornhautlimbus zu lenken. Als nächstes tragen Sie einen Tropfen sterile PBS-Lösung auf das Auge auf und bedecken Sie das Auge mit einem sterilen Abdeckungsschlupf.Schieben Sie die Nadel vorsichtig durch die Bindehaut ins Auge, bis eine Skleraldepression entsteht. Verwenden Sie den Mikromanipulator, um das Auge nach oben zu drehen, bis die Skleraldepression im Fokus ist, und treiben Sie dann die Nadel nach vorne, um mit der Spitze der Nadel einen scharfen Peak in der Netzhaut zu erzeugen. Drehen Sie die Nadel mit dem Nadelhalter nur so lange, bis die Nadelspitze durch die Sklera und das RPE bohrt, so dass das Mehlcein in der Nadelspitze unter dem Netzhautgewebe in unmittelbarer Nähe des subretinalen Raumes und der retinalen Pigmentepithelzellmonoschicht sichtbar ist.Fahren Sie die Spitze der Nadel nach unten, so dass sie tangential zum Globus ist, und aktivieren Sie dann die Einspritzpumpe mit dem Fußpedalschalter. Nachdem 0,5 bis ein Mikroliter Transgenlösung in den subretinalen Raum geliefert wurde, ziehen Sie die Nadel zurück und bestätigen Sie, dass das Blut stabil ist und dass Flüssigkeit nicht aus dem Injektionstrakt austritt. Um den Erfolg der Injektion zu bestätigen, nehmen Sie ein rechteckiges Volumen OCT auf und vergleichen Sie die Bilder mit Bildern der verschiedenen Arten von potenziellen Injektionsergebnissen.Nach Bestätigung der richtigen Injektionsplatzierung verwenden Sie dieses rechteckige OCT-Bild, um das Ausmaß der Blage dem Fundusbild zuzuordnen. Um das Ausmaß der subretinalen Bleb abzubilden, öffnen Sie ein rechteckiges Volumen-OCT-Bild der Bb, so dass ein erkennbares Wahrzeichen innerhalb des Auges in das Bild aufgenommen wird. Fügen Sie so viele Bremssättel wie nötig hinzu, um die Position des linken und rechten Rands des B-Scans sowie den Sehnervenkopf ONH, falls vorhanden, und den Wendepunkt, an dem sich die Netzhaut von der RPE und der Aderhaut löst, zu identifizieren und dann die Daten zu speichern.Dann kompilieren Sie die gespeicherten Dateien und zeichnen Sie die Daten, effektiv eine Karte der Injektion bleb auf die en face OCT Bild erstellen. Überlagern Sie die gezeichneten Daten auf das Fundusbild, das die Injektionsstelle enthält, und speichern Sie das zusammengeführte Bild. Verwenden Sie dieses Bild, um Bereiche von Interesse während der Nachverfolgung der OCT-Bildgebung zu finden.Um die Netzhautdegeneration nach der Injektion zu bewerten, öffnen Sie zunächst eine aufgezeichnete hochauflösende Spektraldomäne OCT oder HRSD OCT rechteckiges Volumenbild und wählen Sie einen zu messenden B-Scan aus. Vergrößern Sie das ausgewählte Bild, bis es den Bildschirm ausfüllt, und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild. Klicken Sie auf Sättel, um die entsprechende Anzahl von Bremssätteln auszuwählen, und verwenden Sie dann die Funktion "Sättel konfigurieren", um die Bremssättel in der Winkelblockspalte als vertikal zuzuweisen und die Position des Anzeigesattels einzuschalten, um eine gleichmäßige Position des Bremssattels über die Netzhaut zu erleichtern.Klicken Sie auf Anwenden und bewegen Sie jeden Bremssattel an die entsprechende Position 0,1 bis 0,2 Millimeter auseinander über den B-Scan, wobei darauf geachtet wird, dass ein Bremssattel gegebenenfalls in die Mitte des Sehnervenkopfes gestellt wird. Wenn alle Bremssättel platziert wurden, klicken und ziehen Sie jeden Bremssattel auf die Längenspanne des Interessenbereichs, wobei sie willkürlich Sättel festlegen, die messbare Bereiche des B-Scans nicht auf maximale Länge überlagern. Um die Dicke der äußeren Kernschicht zu messen, legen Sie die Oberseite jedes Bremssattels an der äußeren Begrenzungsmembran und den Boden jedes Bremssattels an der Unterseite der äußeren Plexiformschicht bei 0,1 bis 0,2 Millimeter Schritten über die Netzhaut.Nachdem alle Bremssättel platziert und an die Größe angepasst wurden, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild und klicken Sie auf Speichern von Bremssatteldaten"und wiederholen Sie dann die Messungen, wie gerade bei jedem zehnten B-Scan gezeigt, wobei die Bremssättel offen und an der gleichen Stelle auf der x-Achse gehalten werden und die Längen der Bremssättel nach Bedarf angepasst werden, ohne sie in x-Richtung zu bewegen. Wenn alle Scans gemessen wurden, öffnen Sie die gespeicherten Datendateien und klicken Sie auf Datum geändert", um die Dateien nach der gespeicherten Zeit anzuordnen. Öffnen Sie alle Dateien für jeden gemessenen B-Scan, und kompilieren Sie die Rohdaten jedes B-Scans in einer einzigen Datei von der niedrigsten zur höchsten Framenummer, und wählen Sie die Datenspalten aus, einschließlich des Sättelnamens, der Länge und der mittleren X-Spalten.Stellen Sie sicher, dass das Mittlere X für alle B-Scans, die für jedes verarbeitete OCT-Bild mit rechteckigem Volumen gemessen wurden, gleich ist, und löschen Sie alle Daten aus den Bremssätteln, die nicht zum Aufzeichnen von Messungen verwendet wurden. Stellen Sie den Sättel in der Mitte des Sehnervenkopfes auf Null ein und zeichnen Sie die Daten für X-im Vergleich zu mehreren Y-Datensätzen auf, um eine 3D-Plotfunktion für die Dicke der äußeren Kernschicht oder einer anderen gemessenen Netzhautschicht zu erhalten. Vergleichen Sie dann die Messungen der äußeren Kernschicht zwischen der Kontrolle und Versuchstieren mit dem entsprechenden Alter, um die Rate und Homogenität einer möglichen Netzhautdegeneration zu bestimmen.Für die 3D-Mapping der Netzhautmessungen, überprüfen Sie die Post-Injektion OCT-Bilder und notieren Sie alle identifizierbaren Landmarken, dann positionieren Sie das Tier, um ein Follow-up-SDO-CT-Bild aus der gleichen Region zu erhalten, wobei darauf zu achten ist, dass dieselben identifizierbaren Landmarken enthalten sind, und die aufgezeichneten Bilder verarbeiten, wie gerade gezeigt. Es ist sehr wichtig, hochwertige OCT-Bilder zu erhalten, die identifizierbare Landmarken enthalten, um die Reimaging der zuvor injizierten Netzhautregionen zu erleichtern. Um die Veränderungen der OS-Länge zu messen, wurden Sättel von der externen Begrenzungsmembran zur Brooks-Membran platziert, was zuverlässige Messungen ermöglichte, da diese Schichten leicht in OCT-Bildern identifiziert werden können.Unterschiede in den Messungen zwischen diesen Schichten aus verschiedenen Mauslinien wurden kürzeren äußeren Segmentlängen zugeschrieben. Wenn die subretinale Injektion erfolgreich durchgeführt wird, induziert die Öffnung des subretinalen Raumes die Produktion eines Blebs, der sowohl in der En-Face-Ansicht des HRSD OCT-Imagers als auch in den B-Scanbildern klar visualisiert werden kann. Die Überlagerung der Grenzkarte der Injektionsstelle ermöglicht die Segmentierung der Netzhautgewebemessungen und Sättelpositionsdatensätze, um nachfolgende statistische Tests der Auswirkungen spezifischer therapeutischer Wirkstoffe auf die Netzhautdegeneration zu ermöglichen.Einmal gemeistert, kann diese Technik in zehn Minuten abgeschlossen werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die chirurgische Umgebung sauber und steril zu halten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Gentherapie, den gesamten subretinalen chirurgischen Injektionsprozess in Echtzeit zu überwachen und schuf eine Möglichkeit, den chirurgischen Erfolg in vivo sofort zu bestimmen.Nach diesem Injektionsverfahren können OCT und andere Methoden wie die Elektroretinographie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur transgenen funktionellen Rettung und/oder Toxizität zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie verstehen, wie Sie transsklerale und transchoroidale subretinale Injektionen durchführen, wie Sie das Ausmaß der Injektionsblüftung aus diesem Bild auf das OCT abbilden und strenge Messungen der äußeren Netzhautschichten erhalten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Gentherapie-Vektoren gefährlich sein kann und dass Vorsichtsmaßnahmen, wie das Tragen der entsprechenden persönlichen Schutzausrüstung, immer während der Durchführung dieses Verfahrens verwendet werden sollten.

Research

JoVE Journal

Medicine

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Aufbau und Verbreitung der Menschenrechte Retinoblastoma Tumore in immundefizienten Mäuse

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Forschung

Medizin

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Produktion und Nachweis von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Cancers

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

Doppler Optical Coherence Tomography of Retinal Circulation

Doppler Optical Coherence Tomography der retinalen Zirkulation

Noncontact retinal blood flow measurements are performed with a Fourier domain optical coherence tomography (OCT) system using a circumpapillary double ...

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

A Novel Surgical Ansatz intratracheale Verabreichung von Wirkstoffen in einem Fetal Mouse Model

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

Subretinalen Injektion von Vektoren für die Gentherapie und Stammzellen in die Maus Eye

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research

Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Mass Distribution in Diabetes Research

Near Infrared Optical Projection Tomography für Assessments von β-Zellen Massenverteilung im Diabetes Research

By adapting OPT to include the capability of imaging in the near infrared (NIR) spectrum, we here illustrate the possibility to image larger bodies of ...

Generation and 3-Dimensional Quantitation of Arterial Lesions in Mice Using Optical Projection Tomography

Generation und 3-Dimensional Quantifizierung der arterielle Läsionen in Mäuse mit optischen Projektionstomographie

The generation and analysis of vascular lesions in appropriate animal models is a cornerstone of research into cardiovascular disease, generating ...

In Vivo, Percutaneous, Needle Based, Optical Coherence Tomography of Renal Masses

In Vivo, Percutaneous, Needle Based, Optical Coherence Tomography of Renal Masses

In Vivo, perkutane, Nadel Based, Optical Coherence Tomography von Nierentumoren

Optical coherence tomography (OCT) is the optical equivalent of ultrasound imaging, based on the backscattering of near infrared light. OCT provides real ...

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson's Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

Entwicklung eines Alpha-Synuklein Based Rattenmodell für Parkinson-Krankheit durch stereotaktische Injektion eines rekombinanten Adeno-assoziierten viralen Vektor,

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on ...

A Mouse Model of Retinal Ischemia-Reperfusion Injury Through Elevation of Intraocular Pressure

Ein Maus-Modell der Netzhautischämie-Reperfusionsschaden Durch Erhöhung des intraokularen Druck

Retinal ischemia-reperfusion (I/R) is a pathophysiological process contributing to cellular damage in multiple ocular conditions, including glaucoma, ...