Name: ultrahigh resolution mouse optical coherence tomography to aid intraocular injection in retinal gene therapy research
Uploaded: 2018-11-02T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ultrahigh Resolution Mouse Optical Coherence Tomography to Aid Intraocular Injection in Retinal Gene Therapy Research at JoVE.com

Questo materiale si basa su lavori sostenuta, in parte, dal Department of Veterans Affairs (VA), Veterans Health Administration, ufficio di ricerca e sviluppo (laboratorio ricerca e sviluppo biomedico) (Grant Merit VA 1I01BX000669). JMS è impiegato, in parte, come il personale medico-scienziato, oftalmologia, da WNY VA; MCB è impiegato, in parte, da VA WNY. Lo studio è stato condotto presso e in parte supportato da, il sistema del Healthcare di New York di Veterans Administration Western (Buffalo, NY). Contenuti non rappresentano le opinioni di Department of Veterans Affairs o di governo degli Stati Uniti. Supportati anche, in gran parte, di NIH/nia R01 concedere EY013433 (PI: JMS), NIH/nia R24 concedere EY016662 (UB Vision infrastruttura Center, PI: M macellazione, direttore - biofotonica modulo: JMS), una sovvenzione illimitata per il dipartimento di Oftalmologia/Università presso Buffalo da ricerca per prevenire la cecità (New York, NY) e una sovvenzione dalla Fondazione Oishei (Buffalo, NY). Riconosciamo il dono di hC1 transgenici RHOP347S linea e il mouse dell'esone 1 RHO knockout da Dr. Janis Lem (Tufts New England Medical Center, Boston, MA) e il dono del modello transgene NHR-E nella condizione eterozigotica sul esone 2 RHO knockout priorità bassa del mouse dalla d. ssa G. Jane Farrar e Peter Humphries (Trinity College, Dublino, IRE).

Protocolli di animali erano esaminati e approvati dalle commissioni di utilizzo VA WNY HCS e dall'Università di Buffalo-SUNY e istituzionali Animal Care. Gli animali sono stati utilizzati secondo le disposizioni dell'associazione per la ricerca in Oftalmologia (ARVO) e la visione e la dichiarazione di Helsinki.
1. Mouse modelli
<ol><li>Identificare i modelli di mouse da valutarsi includendo i controlli. Nota: Imaging è stata eseguita per un C57BL/6(J), mWT hC1/hC1 / / /...

<ol>
	<li>Regus-Leidig, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+knockdown+of+Piccolino+disrupts+presynaptic+ribbon+morphology+in+mouse+photoreceptor+synapses.">In-vivo knockdown of Piccolino disrupts presynaptic ribbon morphology in mouse photoreceptor synapses.</a> Front Cell Neurosci. 8 (259), 1-13 (2014).</li><li>Jiang, L., Frederick, J. M., Baehr, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+gene+therapy+in+dominant+retinitis+pigmentosa+and+cone-rod+dystrophy+mouse+models+caused+by+GCAP1+mutations.">RNA interference gene therapy in dominant retinitis pigmentosa and cone-rod dystrophy mouse models caused by GCAP1 mutations.</a> Front Mol Neurosci. 7 (25), 1-8 (2014).</li><li>Seo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+gene+therapy+of+mice+with+Bardet-Beidl+Syndrome+Type-1.">Subretinal gene therapy of mice with Bardet-Beidl Syndrome Type-1.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (9), 6118-6132 (2013).</li><li>Molday, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RD3+gene+delivery+restores+guanylate+cyclase+localization+and+rescues+photoreceptors+in+the+RD3+mouse+model+of+Leber+congenital+amaurosis+12.">RD3 gene delivery restores guanylate cyclase localization and rescues photoreceptors in the RD3 mouse model of Leber congenital amaurosis 12.</a> Hum. Mol. Genet. 22 (19), 3894-3905 (2014).</li><li>Pang, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+gene+therapy+in+mouse+models+of+recessive+retinal+degeneration.">AAV-mediated gene therapy in mouse models of recessive retinal degeneration.</a> Curr. Mol. Med. (3), 316-330 (2012).</li><li>Vandenberghe, L. H., Auricchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+adeno-associated+viral+vectors+for+retinal+gene+therapies.">Novel adeno-associated viral vectors for retinal gene therapies.</a> Gene Ther. 19 (2), 162-168 (2012).</li><li>Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+risks+related+to+the+use+of+adeno-associated+virus-based+vectors.">Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors.</a> Curr. Gene Ther. 3 (6), 545-565 (2003).</li><li>Parikh, S., Le, A., Davenport, J., Gorin, M. B., Nusinowitz, S., Matynia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+and+validated+injection+method+for+accessing+the+subretinal+space+via+a+transcleral+posterior+approach.">An alternative and validated injection method for accessing the subretinal space via a transcleral posterior approach.</a> J. Vis. Exp. (118), e54808 (2016).</li><li>Bainbridge, J. W. B., Mistry, A. R., Thrasher, A. J., Ali, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+ocular+angiogenesis.">Gene therapy for ocular angiogenesis.</a> Clinical Science. 104, 561-575 (2003).</li><li>Igarashi, T., Miyake, K., Asakawa, N., Miyake, N., Shimada, T., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparison+of+administration+routes+for+AAV-8+mediated+ocular+gene+therapy.">Direct comparison of administration routes for AAV-8 mediated ocular gene therapy.</a> Curr. Eye Res. 38 (5), 569-577 (2013).</li><li>Bennett, J., Duan, D., Engelhardt, J. F., Maguire, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+noninvasive+in+vivo.assessment+of+adeno-associated+virus-mediated+retinal+transduction.">Real-time noninvasive in vivo.assessment of adeno-associated virus-mediated retinal transduction.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 38, 2857-2863 (1997).</li><li>Ruggeri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+three-dimensional+high-resolution+imaging+of+the+rodent+retinal+with+spectral-domain+optical+coherence+tomography.">In vivo three-dimensional high-resolution imaging of the rodent retinal with spectral-domain optical coherence tomography.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (4), 1808-1814 (2007).</li><li>Berger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+domain+optical+coherence+tomography+of+the+rodent+eye:+highlighting+layers+of+the+outer+retina+using+signal+averaging+and+comparison+with+histology.">Spectral domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology.</a> PLoS One. 9 (5), 96494 (2014).</li><li>Dysli, C., Enzmann, V., Sznitman, R., Zinkernagel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+mouse+retinal+layers+using+automated+segmentation+of+spectral+domain+optical+coherence+tomography+images.">Quantitative analysis of mouse retinal layers using automated segmentation of spectral domain optical coherence tomography images.</a> TVST. 4 (4), 9 (2015).</li><li>Bhootada, Y., Choudhury, S., Gully, C., Gorbatyuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+caspase-12+to+preserve+vision+in+mice+with+inherited+retinal+degeneration.">Targeting caspase-12 to preserve vision in mice with inherited retinal degeneration.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56, 4725-4733 (2015).</li><li>Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+injection+of+gene+therapy+vectors+and+stem+cells+in+the+perinatal+mouse+eye.">Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye.</a> J. Vis. Exp. (69), e4286 (2012).</li><li>Berger, A., al, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral-domain+optical+coherence+tomography+of+the+rodent+eye:+highlighting+layers+of+the+outer+retina+using+signal+averaging+and+comparison+with+histology.">Spectral-domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology.</a> PLoSOne. 9 (5), 96494 (2014).</li><li>Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garrido, M. G., Biel, M., Seeliger, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+technique+for+subretinal+injections+in+mice.">Optimized technique for subretinal injections in mice.</a> Methods in Molecular Biology. , (2013).</li><li>Sarra, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+transgene+expression+in+mouse+retina+following+subretinal+injection+of+recombinant+adeno-associated+virus.">Kinetics of transgene expression in mouse retina following subretinal injection of recombinant adeno-associated virus.</a> Vision Res. 42, 541-549 (2002).</li><li>Yan, Q. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-corneal+subretinal+injection+in+mice+and+its+effect+on+the+function+and+morphology+of+the+retina.">Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina.</a> PLoS One. 10 (8), 0136523 (2015).</li><li>Park, S. W., Kim, J. H., Park, W. J., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbal+approach-subretinal+injection+of+viral+vectors+for+gene+therapy+in+mice+retinal+pigment+epithelium.">Limbal approach-subretinal injection of viral vectors for gene therapy in mice retinal pigment epithelium.</a> J. Vis. Exp. (102), e53030 (2015).</li><li>Westenskow, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performing+subretinal+injections+in+rodents+to+deliver+retinal+pigment+epithelium+cells+in+suspension.">Performing subretinal injections in rodents to deliver retinal pigment epithelium cells in suspension.</a> J. Vis. Exp. (95), e52247 (2015).</li><li>Butler, M. C., Sullivan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+real-time,+in+vivo+mouse+retinal+imaging+system.">A novel, real-time, in vivo mouse retinal imaging system.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56 (12), 7159-7168 (2015).</li><li>Rolling, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+adeno-associated+virus-mediated+gene+transfer+into+the+rat+retina+by+clinical+fluorescence+photography.">Evaluation of adeno-associated virus-mediated gene transfer into the rat retina by clinical fluorescence photography.</a> Hum. Gene Ther. 10, 641-648 (1999).</li><li>Ferguson, L. R., Grover, S., Dominguez, J. M., Balaiya, S., Chalam, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+thickness+measurement+obtained+with+spectral+domain+optical+coherence+tomography+assisted+optical+biopsy+accurately+correlates+with+ex+vivo+histology.">Retinal thickness measurement obtained with spectral domain optical coherence tomography assisted optical biopsy accurately correlates with ex vivo histology.</a> PLoS One. 9 (10), 111203 (2014).</li><li>Li, T., Snyder, W. K., Olsson, J. E., Dryja, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+carrying+the+dominant+rhodopsin+mutation+P347S:+evidence+for+defective+vectorial+transport+of+rhodopsin+to+the+outer+segments.">Transgenic mice carrying the dominant rhodopsin mutation P347S: evidence for defective vectorial transport of rhodopsin to the outer segments.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 14176-14181 (1996).</li><li>Brill, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+form+of+transducin-dependent+retinal+degeneration:+accelerated+retinal+degeneration+in+the+absence+of+rod+transducing.">A novel form of transducin-dependent retinal degeneration: accelerated retinal degeneration in the absence of rod transducing.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48, 5445-5453 (2007).</li><li>Olsson, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+with+a+rhodopsin+mutation+(Pro23His):+a+mouse+model+of+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa.">Transgenic mice with a rhodopsin mutation (Pro23His): a mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa.</a> Neuron. 9, 815-830 (1992).</li><li>Humphries, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinopathy+induced+in+mice+by+targeted+disruption+of+the+rhodopsin+gene.">Retinopathy induced in mice by targeted disruption of the rhodopsin gene.</a> Nat. Genet. 15, 216-219 (1997).</li><li>Hruby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+examination+of+the+vitreous+body.">Clinical examination of the vitreous body.</a> Proc. Roy. Soc. Med. 47, 163-170 (1953).</li><li>Kolniak, T. A., Sullivan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cell-based+toxicity+screen+of+potentially+therapeutic+post-transcriptional+gene+silencing+agents.">cell-based toxicity screen of potentially therapeutic post-transcriptional gene silencing agents.</a> Experimental Eye Research. 92, 328-337 (2011).</li><li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-corneal+subretinal+injection+in+mice+and+its+effect+on+the+function+and+morphology+of+the+retina.">Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina.</a> PLoS One. 10 (8), 0136523 (2015).</li><li>Timmers, A. M., Zhang, H., Squitieri, A., Gonzalez-Pola, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+injections+in+rodent+eyes:+effects+on+electrophysiology+and+histology+of+rat+retina.">Subretinal injections in rodent eyes: effects on electrophysiology and histology of rat retina.</a> Mol. Vis. 7, 131-137 (2000).</li><li>Johnson, C. J., Berglin, L., Chrenek, M. A., Redmond, T. M., Boatright, J. H., Nickerson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+brief:+subretinal+injection+and+electroporation+into+adult+mouse+eyes.">Technical brief: subretinal injection and electroporation into adult mouse eyes.</a> Mol. Vis. 14, 2211-2226 (2008).</li><li>Sullivan, J. M., Yau, E. H., Taggart, R. T., Butler, M. C., Kolniak, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottlenecks+in+development+of+therapeutic+post-transcriptional+gene+silencing+agents.">Bottlenecks in development of therapeutic post-transcriptional gene silencing agents.</a> Vision Res. 48, 453-469 (2008).</li></ol>

HR-SD-OCT fornisce un metodo semplice per la caratterizzazione dei potenziali modelli animali della malattia umana per determinare la loro utilità nella prova terapeutica potenziale. La capacità di rapido e affidabile caratterizzano un potenziale modello animale della malattia umana è fondamentale per il processo di scoperta della droga terapeutica (ad es., sostituzione terapia genica, la terapia genica atterramento ribozima o shRNA, terapia genica combinato). HR-SD-OCT fornisce un metodo semplice, rapido e n...

I ricercatori stanno sviluppando terapie geniche per una varietà di malattie degenerative della retina e della retina con la speranza di tradurre approcci terapeutici in trattamenti per la malattia umana1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. tempo dominio o tomografia a coerenza ottica dominio spettrale (SD-OCT) è stata utilizzata per indagare gli aspetti di degenerazione retinica esterna in modelli murini specifici di malattia12,13,14 . HR-SD-OCT non, tuttavia, è stato ampiamente utilizzato nel contesto della valutazione di modelli murini di ottimizzazione per determinare il tasso e l'omogeneità spaziale di degenerazione retinica, o nel contesto della valutazione preclinica di gene base terapeutica, ad esempio, a valutare l'estensione spaziale di vettore consegna8,15,16, tossicità o salvataggio. Una volta che un modello del topo è completamente caratterizzato, i dati di HR-SD-OCT possono servire come una risorsa informativa e affidabile per misurare l'impatto di terapeutica di esercitare tossicità in modelli murini di degenerazione retinica17o salvataggio. Molti gruppi sono tramite iniezione subretinal come metodo di consegna del vettore grazie alla sua efficienza alle transducing fotorecettori e cellule del pigmento retinico epitelio (RPE). Tuttavia, questo rimane un metodo difficile da padroneggiare, dato che essa viene in genere eseguita dalla chirurgia mano libera dalla superficie cornea e spesso è irto di cataratta, emorragia e le separazioni retiniche non intenzionali che accadono semplicemente tramite manipolazione del posteriore vitreo. Molti gruppi ancora tentano subretinal iniezioni ciecamente e consegnare il virus utilizzando iniezioni manuali con diametro relativamente grande in acciaio inox aghi (34G)8,17,18,19 ,20,21,22e alcuni usi tomografia a coerenza ottica (OCT) imaging per confermare la corretta consegna del vettore al retina8,17, 20 , 22. alcuni miglioramenti nel metodo recentemente sono state descritte usando gli aghi su microscala, guidati da un micromanipolatore22.
Vi presentiamo un approccio integrato che agevola il posizionamento dell'ago e le iniezioni sono facilitate da un oftalmoscopio stereo diretto personalizzato progettato in laboratorio specificamente per la visualizzazione all'interno dell'occhio piccolo del mouse17, 23. l'uso di micro aghi di vetro tirato in combinazione con il micromanipolatore stereotassiche forniscono un miglior controllo del posizionamento dell'ago con alcun taglio chirurgico giù richiesto (vale a dire, attraverso la congiuntiva e del tessuto connettivo) prima di iniezione. L'uso della pressione regolata iniettore micro aiuta a consegnare volumi di iniezione coerente, e l'iniezione può essere fatto con maggiore stabilità, precisione e molto più lenta di iniezioni manuali eseguite da una siringa portatile, diminuendo in tal modo la avvenimento di iniezione bolla nell'occhio. L'ago più piccolo aiuta a prevenire perdite dopo ritiro di ago perché il percorso è autosigillante. Per valutare la portata dell'iniezione/consegna, molti gruppi investigativi si basano sulla ricerca e la valutazione dell'estensione area di fluorescenza verde avanzata espressione della proteina (EGFP) nella retina (costrutto di espressione consegnato dal vettore) all'estremità sperimentale punto (eutanasia) per confermare il successo iniezioni11,19,20,24. Questo approccio (che non utilizzano OCT) per verificare il successo chirurgico rifiuti una quantità enorme di risorse in tempo chirurgico procedurale e gli animali, dato che tutti gli animali con guasti chirurgici (sconosciuti) devono essere mantenuti, seguita con misure ripetitive fino al eutanasia e occhio vendemmia (quando EGFP è misurata). Conferma della posizione di iniezione nella retina può essere migliorata utilizzando HR-SD-OCT per dimostrare che l'iniezione è situato tra gli strati corretti della retina (cioè lo spazio subretinal). HR-SD-OCT è utilizzabile anche per delineare immediatamente tentativi infruttuosi (guasti chirurgici) per identificare le variabili rilevanti in tempo reale chirurgico per migliorare l'approccio. Abbiamo trovato che HR-SD-OCT fornisce numerosi vantaggi nel gene preclinici terapia studi consentendo la rapida valutazione quantitativa della degenerazione retinica esterna, consentendo l'identificazione/abbattimento di animali di studio che non soddisfano i criteri sperimentali ( ad esempio, iniezione subretinal non corretto) e a dirigere la formazione immagine di follow-up nella regione dell'occhio dove il vettore è stato consegnato (dove è più probabile effetto preclinico) così come le aree dove non è stato recapitato vettoriale controlli. Dal suo sviluppo, l'uso di SD-OCT ha continuato ad essere accettati e utilizzati da ricercatori di oftalmologia ed è ora considerato lo standard di imaging retinico in studi scientifici retinici in mouse o roditore modelli13,25. HR-SD-OCT e le sue capacità di software sono stati utilizzati in modi unici integrati per portare avanti l'obiettivo di successo quantitativa di terapia genica in modelli murini in ogni fase del processo, tra cui selezione modello animale, caratterizzazione di degenerazione nella vostra modelli di malattia, consegna terapeutico, mappatura di consegna del vettore e la valutazione di efficacia/tossicità. L'uso di HR-SD-OCT permette per la scoperta di nuovi farmaci più efficiente ad ogni livello del processo. Qui descriviamo questi approcci che vengono utilizzati nel nostro programma di RNA Drug Discovery.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:775px;" width="774">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">C57BL6 (J)</td>
			<td style="width:245px;">Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:215px;">664</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">N129R-</td>
			<td style="width:245px;">N/A</td>
			<td style="width:215px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">2HRho 1T/1T</td>
			<td style="width:245px;">N/A</td>
			<td style="width:215px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="78" style="height:78px;width:251px;">Envisu R-2200 Ocular Coherence Tomography Instrument (OCT)</td>
			<td style="width:245px;">Bioptigen</td>
			<td style="width:215px;">90-R2200-U1-120.&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Retinal Imaging System (RIS)</td>
			<td style="width:245px;">In-house</td>
			<td style="width:215px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Stemi 2000C Microscope</td>
			<td style="width:245px;">Zeiss</td>
			<td style="width:215px;">000000-1106-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">P-97 Flaming/Brown micropipette puller</td>
			<td style="width:245px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:215px;">p-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">MMN-33 micro manipulator&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Narishige USA</td>
			<td style="width:215px;">MMN-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">PLI-100&#160; micro injector</td>
			<td style="width:245px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:215px;">64-1736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Micropipette Holder (Rotating)</td>
			<td style="width:245px;">In-house</td>
			<td style="width:215px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Micropipette Storage Receptacle</td>
			<td style="width:245px;">World Precision Instruments Inc.</td>
			<td style="width:215px;">E210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">&#160;Borosilicate glass capillary tubes 1.5-1.8 X 100mm,&#160;</td>
			<td style="width:245px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:215px;">30-0053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">2,2,2-Tribromoethanol</td>
			<td style="width:245px;">SIGMA Aldrich</td>
			<td style="width:215px;">T48402-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Tert-amyl Alcohol</td>
			<td style="width:245px;">SIGMA Aldrich</td>
			<td style="width:215px;">240486-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Atropine Sulfate Ophthalmic Solution, USP 1%</td>
			<td style="width:245px;">Akorn Inc.</td>
			<td style="width:215px;">NDC 17478-215-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Goniovisc</td>
			<td style="width:245px;">BioVision Limited</td>
			<td style="width:215px;">NDC 17238-610-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Cyclopentolate Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP&#160; 2%</td>
			<td style="width:245px;">Akorn Inc.</td>
			<td style="width:215px;">NDC 17478-097-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Gentamicin Sulfate Ointment USP, 0.1%</td>
			<td style="width:245px;">Perigo</td>
			<td style="width:215px;">NDC 45802-046-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Systane Ultra</td>
			<td style="width:245px;">Alcon Laboratories, Inc.</td>
			<td style="width:215px;">9006619-1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Tetracaine Hydrochloride</td>
			<td style="width:245px;">Bausch and Lomb</td>
			<td style="width:215px;">NDC 24208-920-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Ophthalmic Solution, USP 0.5%</td>
			<td style="width:245px;">Bausch and Lomb</td>
			<td style="width:215px;">NDC 24208-920-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">DPBS</td>
			<td style="width:245px;">Gibco Life Technologies</td>
			<td style="width:215px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Virus Preparations</td>
			<td style="width:245px;">ViGene /UNC</td>
			<td style="width:215px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Gold nanorods</td>
			<td style="width:245px;">NANOPARTz</td>
			<td style="width:215px;">D12M-850-1.75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Fluorescein Sulfate AK-FLUOR 25%</td>
			<td style="width:245px;">Akorn Inc.</td>
			<td style="width:215px;">NDC 17478-250-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Coverslips</td>
			<td style="width:245px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:215px;">12-548-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Forceps</td>
			<td style="width:245px;">Milton</td>
			<td style="width:215px;">18-825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Needles 30 guage</td>
			<td style="width:245px;">Beckton Dickenson&#160;&#160;</td>
			<td style="width:215px;">W11604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Syringes</td>
			<td style="width:245px;">Beckton Dickenson&#160;&#160;</td>
			<td style="width:215px;">309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Bioptigen software Package</td>
			<td style="width:245px;">Bioptigen</td>
			<td style="width:215px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 0.5%</td>
			<td style="width:245px;">Akorn Inc.</td>
			<td style="width:215px;">NDC 17478-263-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Windows Excel</td>
			<td style="width:245px;">Microsoft</td>
			<td style="width:215px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Adobe Illustrator</td>
			<td style="width:245px;">Adobe&#160;</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Scale</td>
			<td style="width:245px;">Mettler</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Scissors</td>
			<td style="width:245px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Ear punch</td>
			<td style="width:245px;">Nat&#8217;l band</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">CL 100 Light source</td>
			<td style="width:245px;">Welch Allyn</td>
			<td style="width:215px;">CL100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Nitrogen Gas</td>
			<td style="width:245px;">Jackson Welding Supply</td>
			<td style="width:215px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Heated Water bath</td>
			<td style="width:245px;">Neslab</td>
			<td style="width:215px;">RTE-140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Heating plate</td>
			<td style="width:245px;">In House</td>
			<td style="width:215px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Heating mat</td>
			<td style="width:245px;">Cincinnatti Sub Zero</td>
			<td style="width:215px;">273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Clay mouse holder</td>
			<td style="width:245px;">Plast.i.clay American Art Clay Co.</td>
			<td style="width:215px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Betadine</td>
			<td style="width:245px;">MedLine&#160;</td>
			<td style="width:215px;">NDC53329-938-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Cotton Tip Applicators</td>
			<td style="width:245px;">American Health Service</td>
			<td style="width:215px;">Ctag</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">EtOH 70%</td>
			<td style="width:245px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:215px;">BP2818-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Gloves Nitrile</td>
			<td style="width:245px;">VWR</td>
			<td style="width:215px;">89038-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Diagnosys ERG Color Dome instrument</td>
			<td style="width:245px;">Diagnosys Inc.</td>
			<td style="width:215px;">D125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Contact lenses</td>
			<td style="width:245px;">In-house</td>
			<td style="width:215px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Diagnosys Software</td>
			<td style="width:245px;">Diagnosys Inc.</td>
			<td style="width:215px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Origin 6.1 software</td>
			<td style="width:245px;">OriginLab Corp.</td>
			<td style="width:215px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:251px;">Reference electrodes</td>
			<td style="width:245px;">Ocuscience</td>
			<td style="width:215px;">F-Thread Electrode (DTL) 24&#8221;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultrahigh resolution mouse optical coherence tomography to aid intraocular injection in retinal gene therapy research

HR-SD-OCT è utilizzata per monitorare la progressione della degenerazione dei fotorecettori in modelli murini dal vivo, valutare la consegna degli agenti terapeutici nello spazio subretinal e per valutare la tossicità e l'efficacia in vivo. HR-SD-OCT utilizza nel vicino infrarosso (800-880 nm) e ha ottica specificamente progettato per l'unica ottica dell'occhio del mouse con risoluzione assiale sub-2 micron. Modelli murini transgenici di degenerazione retinica esterna (fotorecettori) e i controlli erano imaged per valutare la progressione di malattia. Vetro tirato microaghi erano usati per fornire sub retiniche iniezioni di virus adeno-associato (AAV) o nanoparticelle (NP) tramite un approccio trans-sclerale e trans-coroideale. Attento posizionamento dell'ago nello spazio subretinal è stato richiesto prima di un'iniezione di pressione calibrata, che trasporta il fluido nello spazio retinico sub. Tempo reale subretinal chirurgia è stato condotto su nostro retinica imaging system (RIS). HR-SD-OCT ha dimostrato la progressiva degenerazione retinica uniforme dovuto l'espressione di un tossico rodopsina mutante umano mutante (P347S) (RHOP347S) transgene in topi. HR-SD-OCT permette rigorosa quantificazione di tutti gli strati della retina. Strato nucleare esterno (ONL) del fotoricettore e spessore segmento esterno (OSL) misure di lunghezza si correlano con la vitalità dei fotorecettori, degenerazione o salvataggio. Il sistema di consegna RIS consente la visualizzazione in tempo reale delle iniezioni subretinal in neonatale (~ P10-14) o topi adulti e HR-SD-OCT immediatamente determina il successo di consegna e mappe estensione areale. HR-SD-OCT è un potente strumento che può valutare il successo della chirurgia subretinal in topi, inoltre a misurare la vitalità di fotorecettori in vivo. HR-SD-OCT consente anche di identificare coorti uniforme animale per valutare l'entità della degenerazione retinica, la tossicità e soccorso terapeutico in studi di ricerca di terapia genica preclinici.

Valutazione della presenza, tasso e uniformità del modello di degenerazione retinica per esterno Misurazioni della ONL sono stati registrati dall'OPL a Olmo, definire i limiti di ONL utilizzando lo strumento pinza fornito nel software dello strumento. L'obiettivo era di mappare la progressione della degenerazione retinica esterna in un modello murino di adRP parzialmente umanizzato. Immagini comparabili da un C57BL/6(J) di controllo mouse e un mWT hC1/hC1 / / / modell...

Watch this Scientific Journal Video about Ultrahigh Resolution Mouse Optical Coherence Tomography to Aid Intraocular Injection in Retinal Gene Therapy Research at JoVE.com

Ultrahigh Resolution Mouse Optical Coherence Tomography to Aid Intraocular Injection in Retinal Gene Therapy Research

Qui dimostriamo un nuovo approccio all'utilizzo di tomografia a coerenza ottica spectral-domain ad alta risoluzione (HR-SD-OCT) per assistere la consegna degli agenti di terapia genica nello spazio subretinal, valutare la sua copertura area e caratterizzano la vitalità del fotoricettore.

Tomografia ottica di coerenza di risoluzione ultraelevata Mouse per aiutare l'iniezione intraoculare nella ricerca retinica terapia genica

HR-SD-OCT is utilized to monitor the progression of photoreceptor degeneration in live mouse models, assess the delivery of therapeutic agents into the ...

L'obiettivo generale di questa procedura di iniezione subretinica è quello di fornire un vettore alla retina in modo minimamente invasivo e riproducibile che sia osservabile in tempo reale. Ciao, questo metodo può essere utilizzato per rispondere a domande chiave nella ricerca sulla terapia genica sull'efficacia della consegna vettoriale e sulla tossicità degli agenti terapeutici. Alcuni vantaggi di questa tecnica includono danni minimi alla retina e ad altre strutture oculari, una precisa mappatura del sito di iniezione e rigorose misurazioni quantitative in vivo che consentono una solida inferenza statistica.Per l'iniezione intraoculare di transgene, posizionare prima un mouse anestetizzato sullo stadio di visualizzazione di un microscopio del sistema di imaging retinico e posizionare le punte di un'iride smussata sterile alle posizioni delle sette e delle 10 della palpebra mentre si spingono le forcep aperte e verso il basso per indurre delicatamente la proptosi. Usa le pinie per convincere le palpebre sotto il globo oculare e dirigere la punta dell'ago a circa uno o 1,5 millimetri sotto il bordo del limbo corneale. Quindi, applicare una goccia di soluzione PBS sterile sull'occhio e coprire l'occhio con un foglietto di copertura sterile.Guidare con cura l'ago nell'occhio attraverso la congiuntiva fino a quando non viene creata una depressione sclerale. Utilizzare il micro manipolatore per ruotare l'occhio verso l'alto fino a quando la depressione sclerale non è a fuoco, quindi guidare l'ago in avanti per creare un picco acuto nella retina con la punta dell'ago. Utilizzando il supporto dell'ago, ruotare l'ago appena fino a quando la punta dell'ago non porta attraverso la sclera e l'RPE, consentendo alla farina nella punta dell'ago di essere visibile sotto il tessuto retinico nelle immediate vicinanze dello spazio subretinale e del monostrato della cellula dell'epitelio del pigmento retinico.Guidare la punta dell'ago verso il basso in modo che sia tangenziale al globo, quindi attivare la pompa di iniezione con l'interruttore del pedale. Dopo che 0,5 a un microlitri di soluzione transgena è stato consegnato allo spazio subretinale, ritirare l'ago e confermare che il sangue è stabile e che il fluido non fuoriesce dal sito del tratto di iniezione. Per confermare il successo dell'iniezione, registrare uno Strumento di personalizzazione di Office a volume rettangolare e confrontare le immagini con le immagini dei diversi tipi di potenziali risultati di iniezione.Dopo la conferma del corretto posizionamento dell'iniezione, utilizzare quell'immagine rettangolare dello Strumento di personalizzazione di Office per mappare l'estensione del bleb sull'immagine del fondo. Per mappare l'estensione del bleb subretinale, aprire un'immagine dello Strumento di personalizzazione di Office in volume rettangolare del bleb in modo che un punto di riferimento riconoscibile all'interno dell'occhio sia incluso nell'immagine. Aggiungere tutte le pinze necessarie per identificare la posizione dei bordi sinistro e destro della scansione B, così come la testa del nervo ottico, ONH, se presente, e il punto di flessione in cui la retina si stacca dall'RPE e dalla coroide e quindi salvare i dati.Quindi compilare i file salvati e tracciare i dati, creando in modo efficace una mappa del bleb di iniezione sull'immagine dello Strumento di personalizzazione di Office. Sovrapporre i dati tracciati all'immagine del fundus contenente il sito di iniezione e salvare l'immagine unita. Utilizzare questa immagine per individuare le aree di interesse durante l'imaging dello Strumento di personalizzazione di Office di follow-up.Per valutare la degenerazione retinica post-iniezione, aprire innanzitutto un'immagine del volume rettangolare del dominio spettrale ad alta risoluzione registrata OCT o HRSD OCT e selezionare una scansione B da misurare. Ingrandisci l'immagine selezionata fino a riempire lo schermo e fai clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine. Fare clic su pinze per selezionare il numero appropriato di pinze, quindi utilizzare la funzione configura pinza per assegnare le pinze come verticali nella colonna del blocco angolare e attivare la posizione della pinza del display per facilitare il posizionamento uniforme della pinza attraverso la retina.Fare clic su applica e spostare ogni pinza nella posizione appropriata da 0,1 a 0,2 millimetri di distanza attraverso la scansione B, facendo attenzione a posizionare una pinza al centro della testa del nervo ottico quando appropriato. Una volta posizionate tutte le pinze, fare clic e trascinare ogni pinza sull'intervallo di lunghezza della regione di interesse, impostando arbitrariamente le pinze che non sovrappostano le regioni misurabili della scansione B alla lunghezza massima. Per misurare lo spessore dello strato nucleare esterno, posizionare la parte superiore di ogni pinza sulla membrana limitante esterna e la parte inferiore di ogni pinza nella parte inferiore dello strato plexiforme esterno con incrementi da 0,1 a 0,2 millimetri attraverso la retina.Dopo che tutte le pinze sono state posizionate e regolate in base alle dimensioni, fare clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine e scegliere salva i dati della pinza", quindi ripetere le misurazioni come appena dimostrato per ogni decimo B di scansione, mantenendo le pinze aperte e nella stessa posizione sull'asse x e regolando le lunghezze delle pinze in base alle esigenze, senza spostarle nella direzione x. Una volta misurate tutte le scansioni, aprire i file di dati salvati e fare clic sulla data modificata"per disporre i file in base al tempo risparmiato. Aprire tutti i file per ogni scansione B misurata e compilare i dati non elaborati da ogni scansione B in un unico file dal numero di fotogramma più basso a quello più alto e selezionare le colonne di dati, incluso il nome della pinza, la lunghezza e le colonne X centrale.Assicurarsi che il centro X sia lo stesso per tutte le scansioni B misurate per ogni immagine dello Strumento di personalizzazione di Office a volume rettangolare elaborata ed eliminare tutti i dati dalle pinze che non sono stati utilizzati per registrare le misurazioni. Impostare la pinza situata al centro della testa del nervo ottico su zero e tracciare i dati per I set di dati X rispetto a più Y per ottenere una funzione di plottaggio 3D per lo spessore dello strato nucleare esterno o di qualsiasi altro strato retinico misurato. Confrontare quindi le misurazioni dello strato nucleare esterno tra il controllo e gli animali da esperimento con le età corrispondenti per determinare la velocità e l'uniformità di qualsiasi potenziale degenerazione retinica.Per la mappatura 3D delle misurazioni retiniche, rivedere le immagini dello Strumento di personalizzazione di Office post-iniezione e notare eventuali punti di riferimento identificabili, quindi posizionare l'animale per ottenere un'immagine SDO CT di follow-up dalla stessa regione, facendo attenzione a includere gli stessi punti di riferimento identificabili ed elaborare le immagini registrate come appena dimostrato. È molto importante ottenere immagini oct di alta qualità che includano punti di riferimento identificabili per facilitare la rivisitazione delle regioni retiniche precedentemente iniettate. Al fine di misurare i cambiamenti nella lunghezza del sistema operativo, le pinze sono state posizionate dalla membrana limitante esterna alla membrana brooks, consentendo misurazioni affidabili poiché questi strati sono facilmente identificabili nelle immagini oct.Le differenze nelle misurazioni tra questi strati di diverse linee del mouse sono state attribuite a lunghezze del segmento esterno più brevi. Se l'iniezione subretinale viene eseguita correttamente, l'apertura dello spazio subretinale induce la produzione di un bleb che può essere chiaramente visualizzato sia nella vista en face dell'imager HRSD OCT che nelle immagini di scansione B. La sovrapposizione della mappa di confine del sito di iniezione consente la segmentazione delle misurazioni del tessuto retinico e dei set di dati sulla posizione della pinza per consentire successivi test statistici degli effetti di specifici agenti terapeutici sulla degenerazione retinica.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in dieci minuti se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di mantenere l'ambiente chirurgico pulito e sterile. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della terapia genica per monitorare l'intero processo di iniezione chirurgica subretinica in tempo reale e ha creato un modo per determinare immediatamente il successo chirurgico in vivo.Seguendo questa procedura di iniezione, oct e altri metodi come l'elettro retinografia possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande sul salvataggio funzionale transgene e / o tossicità. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una comprensione di come eseguire iniezioni subretiniche transsclerali e transchoroidali, come mappare l'estensione del bleb di iniezione sullo Strumento di personalizzazione di Office da questa immagine e ottenere misurazioni rigorose degli strati retinali esterni. Non dimenticare che lavorare con i vettori di terapia genica può essere pericoloso e che le precauzioni, come indossare i dispositivi di protezione individuale appropriati, dovrebbero sempre essere utilizzate durante l'esecuzione di questa procedura.

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