Name: induction and diagnosis of tumors in drosophila imaginal disc epithelia
Uploaded: 2017-07-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia at JoVE.com

Nous remercions J. Vaughen pour la lecture critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par des subventions de JSPS KAKENHI Grant Numbers 26891025, 15H01500 et The Takeda Science Foundation Research Grant to YT

1. Fly Crosses and Clone Induction <ol><li> Retirez toutes les mouches dans le flacon 12 h avant de collecter les mouches vierges. </li><li> Anesthésier les mouches dans le flacon en injectant du CO 2 gaz et placer les mouches sur un coussin de CO 2 . </li><li> Transférer 10 à 20 femelles vierges et 10 mâles dans le flacon de CO 2 dans un flacon frais et incuber pendant 1 jour à 25 ° C. </li><li> Transférer ces mouches dans un flacon frais et incuber pendant 12 h à 25 ° C. <br...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hallmarks+of+cancer.">The hallmarks of cancer.</a> Cell. 100 (1), 57-70 (2000).</li><li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues.">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).</li><li>Struhl, G., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organizing+activity+of+wingless+protein+in+Drosophila.">Organizing activity of wingless protein in Drosophila.</a> Cell. 72 (4), 527-540 (1993).</li><li>Potter, C. J., Turenchalk, G. 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Le système GAL4-UAS est l&#39;un des outils génétiques les plus puissants pour l&#39;expression des gènes ciblés dans Drosophila 26 et facilite grandement l&#39;induction et l&#39;analyse des cellules tumorales in vivo 4 . Ce système permet de générer des clones portant un knockdown de gènes suppresseurs de tumeurs ou une surexpression d&#39;oncogènes dans un tissu épithélial de type sauvage, une situation très similaire aux stades initiaux d...

Les tissus épithéliaux sont des systèmes hautement organisés qui ont la capacité homéostatique remarquable de maintenir leur organisation par le développement et le renouvellement cellulaire. Ce système auto-organisé robuste, cependant, est progressivement perturbé lors du développement de la tumeur. Au début du développement de la tumeur, des cellules mutantes individuelles issues de l&#39;activation de l&#39;oncogène ou de l&#39;inactivation du gène suppresseur de tumeur apparaissent dans une couche épithéliale. Lorsque cette «cellule pro-tumorale» transformée évite un environnement suppresseur, perturbe l&#39;organisation épithéliale et commence la prolifération incontrôlée, la tumorigenèse survient 1 . Au cours des dernières décennies, les progrès technologiques exceptionnels en génétique et en biologie moléculaire ont fait des progrès remarquables dans la recherche sur le cancer. En particulier, des études récentes utilisant les outils d&#39;analyse de mosaïque génétique dans Drosophila melanogaster , telles que la recombinaison mitotique recombinante FLP-FRT (recombinant flippase / flippase recombinase)2 et les systèmes flip-out-GAL4-UAS (séquence d&#39;activation en amont) 3 ont grandement contribué à mieux comprendre les mécanismes génétiques impliqués dans la formation et la métastase des tumeurs 4 , 5 , 6 . Les études d&#39;un groupe de gènes suppresseurs de tumeurs Drosophila conservés, de larves géantes létales ( lgl ), de disques grands ( dlg ) et de griffonnages ( scrib ) ont mis en évidence le lien critique entre la perte d&#39;organisation épithéliale et le développement de la tumeur, car ces gènes jouent des rôles clés Dans la régulation de la polarité des cellules apicales-basales et de la prolifération cellulaire dans les tissus épithéliaux 7 . Alors que les disques imaginatifs de Drosophila sont normalement des épithéliums monocouches, des mutations homozygotes dans l&#39;un de ces trois gènes provoquent une perte de structure et de polarité des cellules, ne parviennent pas à diffuserRentier, surprolifier et, finalement, former des masses amorphes multicouches qui fusionnent avec des tissus adjacents 7 . De même, la rupture de ces gènes chez les mammifères est impliquée dans le développement de tumeurs malignes 8 , 9 . Les phénotypes néoplasiques exposés par les tissus mutants ont conduit à la classification de ces trois gènes comme conservateurs, les gènes suppresseurs de tumeurs néoplasiques (nTSG) 7 , 8 . Cependant, lorsque des cellules mutantes nTSG homozygotes sont générées sporadiquement dans le développement de disques imaginaux de type sauvage en utilisant une recombinaison mitotique médiée par FLP-FRT, les cellules mutantes sont éliminées du tissu par l&#39;apoptose dépendante de la kinase N-terminale c-Jun (JNK) 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , extrusion 15 </suP&gt; , 16 , ou engulfment et phagocytose par voisins 17 . Dans cette épithélium génétiquement mosaïque, l&#39;apoptose est surtout détectée dans les cellules mutantes nTSG situées à la limite des clones, ce qui suggère que les cellules normales adjacentes déclenchent l&#39;apoptose des cellules mutantes nTSG 10 , 11 , 12 , 18 . Des études récentes dans des cellules de mammifères ont confirmé que cette élimination dépendante de la cellule des cellules pro-tumorales est un mécanisme d&#39;autodéfense épithélial conservé de manière évolutive contre le cancer 19 , 20 , 21 , 22 , 23 . Une étude récente dans les disques imaginatifs de Drosophila , cependant, a montré que les clones de knots de nTSG de mosaïque induisent des tumeurs néoplasiques en spécimensDisques imaginatifs des régions de l&#39;aile 16 . La formation initiale des tumeurs a toujours été observée dans la région périphérique de la «charnière» et n&#39;a jamais été observée dans la région centrale de la poche de l&#39;épithélium du disque d&#39;aile, ce qui suggère que le potentiel tumorigène des cellules knock-nTSG dépend de l&#39;environnement local. La région de la poche centrale fonctionne comme une «tache de tumeur froide» où les cellules pro-tumorales ne présentent pas de prolifération dysplasique, alors que la région charnière périphérique se comporte comme un «hotspot tumoral» 16 . Dans les régions de poche &quot;coldspot&quot;, les cellules nTSG-knockdown se délamment du côté basal et subissent une apoptose. En revanche, les cellules de charnière &quot;hotspot&quot; possèdent un réseau de structures cytosquelettiques robustes sur leurs côtés basaux, les cellules knockdowns nTSG se délamment du côté apical de l&#39;épithélium et déclenchent une prolifération tumorigène 16 . Par conséquent, l&#39;analyse des phénotypes tumoraux dans les disques imaginatifs nécessite une attention particulièreDéduction de la susceptibilité spécifique à la région aux stimuli tumorigènes. Ici, nous décrivons un protocole pour induire une formation de tumeur néoplasique dans les disques imaginaux d&#39;ailes de Drosophila en utilisant le système GAL4-UAS- RNAi par lequel des cellules knock-nTSG sont générées dans des épithéliums à disque d&#39;aile normale. Bien que ces systèmes expérimentaux soient utiles pour étudier les premiers stades du cancer, une méthode de classification claire pour évaluer les étapes de la progression de la tumeur dans les épithéliums de disque imaginal n&#39;a pas été clairement décrite auparavant. Par conséquent, nous proposons également une méthode de diagnostic pour classer les phénotypes clonaux pro-tumoraux induits dans l&#39;épithélium du disque d&#39;aile en trois catégories: hyperplasie (accumulation d&#39;un nombre excessif de cellules apparaissant normalement avec une prolifération accrue), dysplasie (tissu prémalignant composé d&#39;apparences anormales Cellules) et néoplasies (tumeur bénigne ou maligne composée de cellules ayant un aspect anormal et un modèle de prolifération anormal).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>162-19321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Wako</td>
			<td>168-11805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Wako</td>
			<td>064-00406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>normal goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mounting medium, Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse-anti-Dlg 4F3</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203</td>
			<td>dilute in PBTG, 1:40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse-anti-MMP1</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>3A6B4, RRID:AB_579780</td>
			<td>3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse-anti-MMP1</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>3B8D12, RRID:AB_579781</td>
			<td>3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse-anti-MMP1</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>5H7B11, RRID:AB_579779</td>
			<td>3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse-anti-atubulin</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>AA4.3, RRID:AB_579793</td>
			<td>dilute in PBTG, 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 Phalloidin</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>A22283</td>
			<td>dilute in PBS, 1:40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>A11030</td>
			<td>dilute in PBTG, 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sd-Gal4</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#8609</td>
			<td>recombined with UAS-EGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>upd-Gal4</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#26796</td>
			<td>recombined with UAS-EGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-lgl-RNAi</td>
			<td>Vienna Drosophila RNAi center</td>
			<td>#51247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-scrib-RNAi</td>
			<td>Vienna Drosophila RNAi center</td>
			<td>#105412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-RasV12</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#64196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-Yki3SA</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#28817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hsFLP</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Act&#62;CD2&#62;GAL4 (flip-out GAL4)</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#4780</td>
			<td>recombined with UAS-EGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-EGFP</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#5428</td>
			<td>X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-EGFP</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#6658</td>
			<td>third chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-Dicer2</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#24650</td>
			<td>second chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-Dicer2</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#24651</td>
			<td>third chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vkg-GFP</td>
			<td>Morin et al. 2001</td>
			<td></td>
			<td>GFP protein trap</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction and diagnosis of tumors in drosophila imaginal disc epithelia

Aux premiers stades du cancer, les cellules mutantes transformées présentent des anomalies cytologiques, commencent une prolifération incontrôlée et perturbent progressivement l&#39;organisation du tissu. Drosophila melanogaster est apparue comme un système de modèle expérimental populaire dans la biologie du cancer pour étudier les mécanismes génétiques et cellulaires de la tumorigénèse. En particulier, les outils génétiques pour les disques imaginatifs de Drosophila (développement d&#39;épithélium dans les larves) permettent la création de cellules pro-tumorales transformées dans un tissu épithélial normal, une situation similaire aux étapes initiales du cancer humain. Cependant, une étude récente de la tumorigénèse dans les disques imaginaux d&#39;ailes de Drosophila a montré que l&#39;initiation de la tumeur dépend de la cytoarchitecture tissulaire-intrinsèque et du microenvironnement local, ce qui suggère qu&#39;il est important de considérer la susceptibilité spécifique à la région aux stimuli tumorigènes dans l&#39;évaluation des phénotypes tumoraux dans l&#39;imaginaire Disques. Pour faciliter l&#39;analyse phénotypique des progrès de la tumeurSur les disques imaginaux, nous décrivons ici un protocole pour les expériences génétiques utilisant le système GAL4-UAS pour induire des tumeurs néoplasiques dans des disques imaginaux d&#39;ailes. Nous introduisons en outre une méthode de diagnostic pour classer les phénotypes des lésions clonales induites dans les épithéliums imaginaux, car une méthode de classification claire pour discriminer les différentes étapes de la progression de la tumeur (comme l&#39;hyperplasie, la dysplasie ou la néoplasie) n&#39;a pas été décrite auparavant. Ces méthodes pourraient être largement applicables à l&#39;analyse clonale des phénotypes tumoraux dans divers organes de Drosophila .

Pour démontrer la formation de tumeur néoplasique induite expérimentalement par NTSG-knockdown médié par RNAi dans des disques imaginaux d&#39;ailes de Drosophila , trois pilotes GAL4 différents ont été utilisés pour exprimer UAS-RNAi pour lgl ou scrib : (1) sd-GAL4, qui conduit une forte expression d&#39;UAS dans le Poche d&#39;aile et expression douce dans les régions de charnière ( figure 2 ...

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Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia

L&#39;analyse de clones de mosaïque dans l&#39;épithélium de disque imaginal de Drosophila est un système modèle puissant pour étudier les mécanismes génétiques et cellulaires de la tumorigénèse. Nous décrivons ici un protocole pour induire des tumeurs dans des disques imaginaux d&#39;ailes de Drosophila en utilisant le système GAL4-UAS et introduire une méthode de diagnostic pour classer les phénotypes tumoraux.

Induction et diagnostic des tumeurs dans<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Epithelia

In the early stages of cancer, transformed mutant cells show cytological abnormalities, begin uncontrolled overgrowth, and progressively disrupt tissue ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia

Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

Le séquençage de prochaine génération pour la détection des Actionable mutations dans les tumeurs solides et liquides

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific ...

Recherche

Recherche en cancérologie

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

le<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Tumor Disc Modèle: Visualisation et quantification de l&#39;expression génique et de tumeurs invasives utilisant Mosaïques génétique

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

Développement d’un humain modèle préclinique de Osteoclastogenesis de Monocytes du sang périphérique conjointement mis en culture avec des lignées cellulaires de Cancer du sein

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

Mise en place d’une Culture primaire de sarcome des tissus mous dérivé de Patient

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

Enrichissement et la caractérisation des tumeur immunitaire et Non immuns micro-environnements dans les tumeurs murines sous-cutanée établis

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Murine Model of Metastatic Liver Tumors in the Setting of Ischemia Reperfusion Injury

Modèle de Murine des tumeurs métastatiques de foie dans le cadre des dommages de reperfusion d'ischémie

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce ...

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Obtenir des sphères de cellules souches cancéreuses à partir de tumeurs gynécologiques et du cancer du sein

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Transplantation orthotopique de tumeurs mammaires comme modèles précliniques pour le cancer du sein

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Quail Chorioallantoic Membrane - A Tool for Photodynamic Diagnosis and Therapy

Membrane chorio-allantoïdienne de caille - Un outil pour le diagnostic photodynamique et la thérapie

The chorioallantoic membrane (CAM) of an avian embryo is a thin, extraembryonic membrane that functions as a primary respiratory organ. Its properties ...

High-Resolution Ultrasonography for the Analysis of Orthotopic ATC Tumors in a Genetically Engineered Mouse Model

Échographie à haute résolution pour l’analyse des tumeurs ATC orthotopiques dans un modèle murin génétiquement modifié

Anaplastic thyroid carcinoma (ATC) is associated with a poor prognosis and short median survival time, but no effective treatment improves the outcomes ...