Name: induction and diagnosis of tumors in drosophila imaginal disc epithelia
Uploaded: 2017-07-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia at JoVE.com

Agradecemos a J. Vaughen pela leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado por bolsas da JSPS KAKENHI Grant Numbers 26891025, 15H01500 e The Takeda Science Foundation Research Grant to YT

1. Fly Crosses e Clone Induction <ol><li> Remova todas as moscas no frasco 12 h antes de coletar moscas virgens. </li><li> Anestesiar as moscas dentro do recipiente através da injecção de gás de CO2 e voa lugar numa almofada de mosca de CO 2. </li><li> Transfira 10 - 20 fêmeas virgens e 10 machos da almofada de mosca CO 2 para um frasco fresco e incubar durante 1 dia a 25 ° C. </li><li> Transfira essas moscas para um frasco fresco e incube durante 12 h a 25 ° C. NOTA: Des...

<ol>
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O sistema GAL4-UAS é uma das ferramentas genéticas mais poderosas para a expressão de genes direcionados em Drosophila 26 e facilita grandemente a indução e análise de células tumorais in vivo 4 . Este sistema permite a geração de clones que suportam os genes supressores de tumores ou a superexpressão de oncogenes no tecido epitelial de tipo selvagem, uma situação altamente semelhante aos estágios iniciais do câncer humano onde as células p...

Os tecidos epiteliais são sistemas altamente organizados que possuem a habilidade homeostática notável para manter sua organização através do desenvolvimento e do turnover celular. Este robusto sistema de auto-organização, no entanto, é progressivamente interrompido durante o desenvolvimento do tumor. No início do desenvolvimento do tumor, as células mutantes individuais decorrentes da ativação do oncogene ou da inativação do gene supressor de tumor emergem dentro de uma camada epitelial. Quando esta &quot;célula pro-tumoral&quot; transformada evade um ambiente supressivo, interrompe a organização epitelial e começa a proliferação descontrolada, a tumorigênese ocorre 1 . Durante as últimas décadas, os avanços tecnológicos notáveis ​​em genética e biologia molecular fizeram progressos notáveis ​​na pesquisa do câncer. Em particular, estudos recentes utilizando ferramentas de análise de mosaico genetico em Drosophila melanogaster , como o recombinante mitótico recombinante FLP-FRT (flipase recombinase / flippase recombinase)Os sistemas 2 e flip-out-GAL4-UAS (seqüência de ativação upstream) 3 contribuíram grandemente para uma melhor compreensão dos mecanismos genéticos envolvidos na formação e metástase dos tumores 4 , 5 , 6 . Estudos de um grupo de genes de supressores de tumores Drosophila conservados, larvas gigantes letais ( lgl ), discos grandes ( dlg ) e rabiscos ( scrib ), evidenciaram a relação crítica entre perda de organização epitelial e desenvolvimento tumoral, pois esses genes desempenham papéis fundamentais Na regulação da polaridade das células basais apical e da proliferação celular nos tecidos epiteliais 7 . Enquanto os discos imaginários de Drosophila são normalmente epitélios monocamadas, mutações homozigóticas em qualquer um desses três genes fazem com que as células perdam estrutura e polaridade, não conseguem diferenciarRentiate, overproliferate e, finalmente, formam massas amorfas multicamadas que se fundem com tecidos adjacentes 7 . Da mesma forma, a interrupção desses genes em mamíferos está envolvida no desenvolvimento de tumores malignos 8 , 9 . Os fenótipos neoplásicos exibidos pelos tecidos mutantes levaram à classificação desses três genes como genes supressores tumorais neoplásicos (nTSGs) 7 , 8 preservados. No entanto, quando as células mutantes nTSG homozigóticas são geradas esporadicamente no desenvolvimento de discos imaginais de tipo selvagem usando a recombinação mitótica mediada por FLP-FRT, as células mutantes são eliminadas do tecido através da apoptose dependente da quinase N-terminal N-terminal (JNK) 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , extrusão 15 </suP&gt; , 16 , ou engulfment e fagocitose por vizinhos 17 . Neste epitelio de mosaico genetico, a apoptose é principalmente detectada em células mutantes nTSG localizadas no limite do clone, sugerindo que as células normais adjacentes desencadeiam a apoptose de células mutantes nTSG 10 , 11 , 12 , 18 . Estudos recentes em células de mamíferos confirmaram que esta eliminação dependente da competição celular das células pro-tumorais é um mecanismo de autodefesa epitelial conservado evolutivamente contra o câncer 19 , 20 , 21 , 22 , 23 . Um estudo recente em discos imagólicos de Drosophila , no entanto, mostrou que os clones de nTSG-knockdown em mosaico induzem tumores neoplásicos em especificaçõesRegiões ic de discos ideais de asa 16 . A formação inicial do tumor sempre foi encontrada na região periférica da &quot;dobradiça&quot; e nunca observada na região central da &quot;bolsa&quot; do epitélio do disco de asa, sugerindo que o potencial tumorigênico das células nTSG-knockdown depende do ambiente local. A região da bolsa central funciona como uma &quot;mancha fria do tumor&quot; onde as células pró-tumorais não apresentam crescimento excessivo displásico, enquanto que a região da dobradiça periférica se comporta como um &quot;ponto crítico do tumor&quot; 16 . Nas regiões da bolsa &quot;coldspot&quot;, as células nTSG-knockdown se delaminam do lado basal e sofrem apoptose. Em contraste, as células de dobradiça &quot;hotspot&quot; possuem uma rede de estruturas citoesqueléticas robustas em seus lados basais, as células de nTSG-knockdown se delaminam do lado apical do epitélio e iniciam o crescimento excessivo tumorigênico 16 . Portanto, a análise de fenótipos tumorais em discos imaginários exige consi cuidadoDerrame da susceptibilidade específica da região aos estímulos tumorigênicos. Aqui, descrevemos um protocolo para induzir a formação de tumor neoplásico nos discos imaginários da asa Drosophila utilizando o sistema GAL4-UAS- RNAi pelo qual as células nTSG-knockdown são geradas em epitélio de disco de asa normal. Embora esses sistemas experimentais sejam úteis para estudar os estágios iniciais do câncer, um método de classificação claro para avaliar os estágios da progressão tumoral no epitélio de disco imaginal não foi claramente descrito anteriormente. Portanto, também propomos um método de diagnóstico para classificar os fenótipos clonais pro-tumorais induzidos no epitélio do disco de asa em três categorias: hiperplasia (acumulação de um número excessivo de células que aparecem normalmente com aumento da proliferação), displasia (tecido pré-maligno composto de aparência anormal Células) e neoplasia (tumor benigno ou maligno composto de células com aparência anormal e padrão de proliferação anormal).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>162-19321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Wako</td>
			<td>168-11805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Wako</td>
			<td>064-00406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>normal goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mounting medium, Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse-anti-Dlg 4F3</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203</td>
			<td>dilute in PBTG, 1:40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse-anti-MMP1</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>3A6B4, RRID:AB_579780</td>
			<td>3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse-anti-MMP1</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>3B8D12, RRID:AB_579781</td>
			<td>3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse-anti-MMP1</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>5H7B11, RRID:AB_579779</td>
			<td>3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse-anti-atubulin</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>AA4.3, RRID:AB_579793</td>
			<td>dilute in PBTG, 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 Phalloidin</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>A22283</td>
			<td>dilute in PBS, 1:40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>A11030</td>
			<td>dilute in PBTG, 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sd-Gal4</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#8609</td>
			<td>recombined with UAS-EGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>upd-Gal4</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#26796</td>
			<td>recombined with UAS-EGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-lgl-RNAi</td>
			<td>Vienna Drosophila RNAi center</td>
			<td>#51247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-scrib-RNAi</td>
			<td>Vienna Drosophila RNAi center</td>
			<td>#105412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-RasV12</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#64196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-Yki3SA</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#28817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hsFLP</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Act&#62;CD2&#62;GAL4 (flip-out GAL4)</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#4780</td>
			<td>recombined with UAS-EGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-EGFP</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#5428</td>
			<td>X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-EGFP</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#6658</td>
			<td>third chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-Dicer2</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#24650</td>
			<td>second chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-Dicer2</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>#24651</td>
			<td>third chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vkg-GFP</td>
			<td>Morin et al. 2001</td>
			<td></td>
			<td>GFP protein trap</td>
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induction and diagnosis of tumors in drosophila imaginal disc epithelia

Nos estágios iniciais do câncer, as células mutantes transformadas apresentam anormalidades citológicas, começam o excesso de crescimento descontrolado e interromperam progressivamente a organização do tecido. Drosophila melanogaster emergiu como um sistema modelo experimental popular em biologia do câncer para estudar os mecanismos genéticos e celulares da tumorigênese. Em particular, as ferramentas genéticas para discos imagólicos de Drosophila (desenvolvimento de epitélios em larvas) possibilitam a criação de células pro-tumorais transformadas dentro de um tecido epitelial normal, uma situação semelhante às etapas iniciais do câncer humano. Um estudo recente da tumorigênese em discos imaginários da asa de Drosophila , no entanto, mostrou que a iniciação do tumor depende da citoarquitetura do tecido intrínseco e do microambiente local, sugerindo que é importante considerar a susceptibilidade específica da região aos estímulos tumorigênicos na avaliação de fenótipos tumorais em imaginações Discos. Para facilitar a análise fenotípica do tumor progressiEm discos imaginais, aqui descrevemos um protocolo para experiências genéticas usando o sistema GAL4-UAS para induzir tumores neoplásicos em discos imaginais de asa. Além disso, introduzimos um método de diagnóstico para classificar os fenótipos das lesões clonais induzidas em epitélios imaginais, pois um método de classificação claro para discriminar vários estágios de progressão tumoral (como hiperplasia, displasia ou neoplasia) não havia sido descrito anteriormente. Esses métodos podem ser amplamente aplicáveis ​​à análise clonal de fenótipos tumorais em vários órgãos em Drosophila .

Para demonstrar a formação de tumores neoplásicos induzidos experimentalmente por NTSG-knockdown mediado por RNAi em discos imaginais de asa de Drosophila , foram utilizados três drivers GAL4 diferentes para expressar UAS-RNAi para lgl ou scrib : (1) sd-GAL4, que conduz a expressão forte de UAS no Bolsa de asa e expressão suave nas regiões de dobradiça ( Figura 2 e Figura 3A</...

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Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia

A análise do clone de mosaico no epitélio do disco imaginal de Drosophila é um sistema modelo poderoso para estudar os mecanismos genéticos e celulares da tumorigênese. Aqui descrevemos um protocolo para induzir tumores em discos imaginários da asa de Drosophila usando o sistema GAL4-UAS e introduzir um método de diagnóstico para classificar os fenótipos do tumor.

Indução e diagnóstico de tumores em<em&gt; Drosophila</em&gt; Epitelio do disco imaginal

In the early stages of cancer, transformed mutant cells show cytological abnormalities, begin uncontrolled overgrowth, and progressively disrupt tissue ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia

Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

Próxima Geração Sequencing para Detecção de acionável mutações em tumores sólidos e líquidos

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific ...

Pesquisa do câncer

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

o<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Modelo Disc Tumor: visualização e quantificação da expressão gênica e invasão tumoral Usando Mosaicos Genéticos

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

Desenvolvimento de um modelo humano pré-clínicos de Osteoclastogenesis de monócitos do sangue periférico co cultivados com linhas de células de câncer de mama

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

Estabelecimento de uma cultura primária de Sarcoma macio do tecido derivado de paciente

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

Enriquecimento e caracterização do microambiente que imune e não imune Tumor em tumores murino subcutâneos estabelecidas

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Murine Model of Metastatic Liver Tumors in the Setting of Ischemia Reperfusion Injury

Modelo murino de tumores hepáticos metastáticos no cenário de lesão de reperfusão de isquemia

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce ...

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Obtenção de esferas de células-tronco cancerígenas de tumores ginecológicos e de câncer de mama

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Transplante Ortotópico de Tumores mamários como Modelos Pré-Clínicos para o Câncer de Mama

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

Quail Chorioallantoic Membrane - A Tool for Photodynamic Diagnosis and Therapy

Membrana corioalantóica de codorna - Uma ferramenta para diagnóstico fotodinâmico e terapia

The chorioallantoic membrane (CAM) of an avian embryo is a thin, extraembryonic membrane that functions as a primary respiratory organ. Its properties ...

High-Resolution Ultrasonography for the Analysis of Orthotopic ATC Tumors in a Genetically Engineered Mouse Model

Ultrassonografia de Alta Resolução na Análise de Tumores Ortotópicos ATC em Modelo de Camundongo Geneticamente Modificado

Anaplastic thyroid carcinoma (ATC) is associated with a poor prognosis and short median survival time, but no effective treatment improves the outcomes ...