Name: selection-dependent and independent generation of crispr/cas9-mediated gene knockouts in mammalian cells
Uploaded: 2017-06-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells at JoVE.com

Yazarlar, deneysel yardım için Gissell Sanchez, Megan Lee ve Jason Estep&#39;i ve reaktifleri paylaşmak için Weifeng Gu ve Xuemei Chen&#39;i onaylamak istiyorlar.

1. İstenilen Silinme Çevresindeki Homoloji Bölgelerinin Belirlenmesi NOT: Yalnızca seçim temelli düzenleme kullanılıyorsa gereklidir. <ol><li> HDR şablonunda homoloji kolları olarak görev yapacak istenen silme yerinin her iki tarafında başlangıçta 1.5-2 kb olan iki bölge seçin ( Şekil 1A ). Klonlamayı kolaylaştırmak için her iki zincirde (GGTCTC) BsaI tanıma sitelerinden yoksun bölgeler belirleyin. BsaI siteleri kaçınılmazsa alternat...

<ol>
	<li>Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+with+zinc-finger+nucleases.">Genome engineering with zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 188 (4), 773-782 (2011).</li><li>Kim, Y. G., Cha, J., Chandrasegaran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+restriction+enzymes:+zinc+finger+fusions+to+Fok+I+cleavage+domain.">Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (3), 1156-1160 (1996).</li><li>Bibikova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+homologous+recombination+through+targeted+cleavage+by+chimeric+nucleases.">Stimulation of homologous recombination through targeted cleavage by chimeric nucleases.</a> Mol Cell Biol. 21 (1), 289-297 (2001).</li><li>Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+chromosomal+cleavage+and+mutagenesis+in+Drosophila+using+zinc-finger+nucleases.">Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).</li><li>Porteus, M. H., Cathomen, T., Weitzman, M. D., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+targeting+mediated+by+adeno-associated+virus+and+DNA+double-strand+breaks.">Efficient gene targeting mediated by adeno-associated virus and DNA double-strand breaks.</a> Mol Cell Biol. 23 (10), 3558-3565 (2003).</li><li>Bogdanove, A. J., Voytas, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAL+effectors:+customizable+proteins+for+DNA+targeting.">TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting.</a> Science. 333 (6051), 1843-1846 (2011).</li><li>Miller, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+TALE+nuclease+architecture+for+efficient+genome+editing.">A TALE nuclease architecture for efficient genome editing.</a> Nat Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).</li><li>Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+cipher+governs+DNA+recognition+by+TAL+effectors.">A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors.</a> Science. 326 (5959), 1501 (2009).</li><li>Christian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+DNA+double-strand+breaks+with+TAL+effector+nucleases.">Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases.</a> Genetics. 186 (2), 757-761 (2010).</li><li>Jiang, W., Marraffini, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas:+New+Tools+for+Genetic+Manipulations+from+Bacterial+Immunity+Systems.">CRISPR-Cas: New Tools for Genetic Manipulations from Bacterial Immunity Systems.</a> Annu Rev Microbiol. 69, 209-228 (2015).</li><li>Barrangou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+provides+acquired+resistance+against+viruses+in+prokaryotes.">CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes.</a> Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).</li><li>Karginov, F. V., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR+system:+small+RNA-guided+defense+in+bacteria+and+archaea.">The CRISPR system: small RNA-guided defense in bacteria and archaea.</a> Mol Cell. 37 (1), 7-19 (2010).</li><li>Wiedenheft, B., Sternberg, S. H., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+genetic+silencing+systems+in+bacteria+and+archaea.">RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea.</a> Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).</li><li>Mojica, F. J., Diez-Villasenor, C., Garcia-Martinez, J., Soria, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intervening+sequences+of+regularly+spaced+prokaryotic+repeats+derive+from+foreign+genetic+elements.">Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements.</a> J Mol Evol. 60 (2), 174-182 (2005).</li><li>Pourcel, C., Salvignol, G., Vergnaud, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+elements+in+Yersinia+pestis+acquire+new+repeats+by+preferential+uptake+of+bacteriophage+DNA,+and+provide+additional+tools+for+evolutionary+studies.">CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies.</a> Microbiology. 151 (Pt 3), 653-663 (2005).</li><li>Brouns, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+CRISPR+RNAs+guide+antiviral+defense+in+prokaryotes.">Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes.</a> Science. 321 (5891), 960-964 (2008).</li><li>Deltcheva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+RNA+maturation+by+trans-encoded+small+RNA+and+host+factor+RNase+III.">CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III.</a> Nature. 471 (7340), 602-607 (2011).</li><li>Garneau, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR/Cas+bacterial+immune+system+cleaves+bacteriophage+and+plasmid+DNA.">The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA.</a> Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).</li><li>Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+interference+limits+horizontal+gene+transfer+in+staphylococci+by+targeting+DNA.">CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA.</a> Science. 322 (5909), 1843-1845 (2008).</li><li>Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9-crRNA+ribonucleoprotein+complex+mediates+specific+DNA+cleavage+for+adaptive+immunity+in+bacteria.">Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (39), E2579-E2586 (2012).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Davis, A. J., Chen, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double+strand+break+repair+via+non-homologous+end-joining.">DNA double strand break repair via non-homologous end-joining.</a> Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).</li><li>Guirouilh-Barbat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+the+KU80+pathway+on+NHEJ-induced+genome+rearrangements+in+mammalian+cells.">Impact of the KU80 pathway on NHEJ-induced genome rearrangements in mammalian cells.</a> Mol Cell. 14 (5), 611-623 (2004).</li><li>Moore, J. K., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+and+genetic+requirements+of+two+pathways+of+nonhomologous+end-joining+repair+of+double-strand+breaks+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Cell cycle and genetic requirements of two pathways of nonhomologous end-joining repair of double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Cell Biol. 16 (5), 2164-2173 (1996).</li><li>Liang, F., Han, M., Romanienko, P. J., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homology-directed+repair+is+a+major+double-strand+break+repair+pathway+in+mammalian+cells.">Homology-directed repair is a major double-strand break repair pathway in mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (9), 5172-5177 (1998).</li><li>Gratz, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+specific+and+efficient+CRISPR/Cas9-catalyzed+homology-directed+repair+in+Drosophila.">Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila.</a> Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+one+pot,+one+step,+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability.">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PLoS One. 3 (11), e3647 (2008).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Luo, Y., Lin, L., Bolund, L., Sorensen, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+construction+of+rAAV-based+gene+targeting+vectors+by+Golden+Gate+cloning.">Efficient construction of rAAV-based gene targeting vectors by Golden Gate cloning.</a> Biotechniques. 56 (5), 263-268 (2014).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).</li><li>Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+homology-directed+human+genome+engineering+by+controlled+timing+of+CRISPR/Cas9+delivery.">Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery.</a> Elife. 3, e04766 (2014).</li><li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins.">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Res. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li></ol>

CRISPR / Cas9 sistemi, diğer geçici manipülasyon yöntemlerine daha tutarlı bir alternatif sağlayan stabil genomik modifikasyonların verimli bir şekilde oluşturulmasına izin vermiştir. Burada, memeli hücre hatlarında CRISPR / Cas9 gen nakavtın hızlı tanımlanması için iki yöntem sunduk. Her iki yöntem de çok az hücresel malzeme gerektirir, bu nedenle test, klonal kültüre ait erken safhalarda yapılabilir, zamandan ve reaktiflerden tasarruf edilebilir. Her iki yöntemin verimliliğini artırmak iç...

<html> Kararlı genetik değişiklikler, verimlilik ve süre bakımından değişken olabilen geçici hücresel pertürbasyon yöntemlerine göre bir avantaj sağlar. Genomik düzenleme, çinko parmak nükleazları 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , transkripsiyon aktivatörü benzeri efektör nükleazları (TALEN&#39;ler) 6 , 7 , 8 , 9 gibi hedefe spesifik nükleazların gelişimi nedeniyle son yıllarda giderek yaygınlaşmaktadır. Ve kümelenmiş, düzenli olarak aralıklı kısa palindromik tekrarlardan (CRISPR) türemiş RNA yönlendirmeli nükleazlar 10 . CRISPR / Cas9 düzenleme makineleri bakterilerin ve arkeaların viral enfeksiyonlara karşı savunmak için kullandıkları bağışıklık sisteminden adapte edilmiştirAss = &quot;xref&quot;&gt; 11 , 12 , 13 . Bu süreçte, işgalci viral dizinin kısa, 20-30 nt fragmanları, tekrar eden birimler 14 , 15 tarafından çevrelenen &quot;aralayıcılar&quot; olarak genomik bir lokasyona dahil edilir. Ardından transkripsiyon ve RNA işleme, bir aktive edici crRNA 17 (tracrRNA) ile efektör Cas9 endonükleazı birleştiren küçük CRISPR ilişkili RNA&#39;lar16 (crRNA&#39;lar) üretir. Dolayısıyla, crRNA&#39;lar Cas9 hedeflemesine özgüllük sağlar, kompleksi tamamlayıcı viral DNA dizilerini bölmeye yönlendirir ve diğer enfeksiyonları önler 18,19. Hedeflenen DNA&#39;daki herhangi bir &quot;protospacer&quot; sekans, kısa bir protospazere komşu motife (PAM) doğrudan 5 &#39;, S. pyogenes Cas9 durumunda ise NGG olduğu sürece, crRNA&#39;nın kaynağı olarak görev yapabilir <sUp class = &quot;xref&quot;&gt; 20. Ev sahibinin CRISPR lokusu içindeki boşluk yakınında PAM sekansının olmaması, benliğin kendisi ile ben olmayan arasındaki ayrımı yaparak, ev sahibinin hedeflenmesini engeller. Evrenselliği ve esnekliği nedeniyle, bu biyolojik sistem genomik düzenleme için güçlü bir şekilde adapte edilmiştir, böylelikle hemen hemen her PAM bitişik DNA sitesi hedeflenebilir. Bu sürümde, başka bir değişiklik, crRNA ve tracRNA&#39;yı Cas9 protein 21&#39;e yüklenen tek bir rehber RNA (sgRNA) bileşenine kaynaştırdı. Ökaryotik hücrelerde Cas9 ve bir sgRNA ekspresyonu üzerine Cas9 proteini, her iki DNA kolunu hedeflenen lokusta parçalamaktadır. Uygun homolog bir dizinin yokluğunda hücre bu kopuşu tipik olarak küçük delesyonlar veya nadiren eklemeler başlatan homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) 22 , 23 , 24 aracılığıyla tespit eder. Bir açık hedefleme yaparkenOkuma çerçevesi, onarım muhtemelen işlevsel olmayan bir protein ürünü üreten bir translasyonel çerçeve kaymasına yol açar. Aksine, geniş homoloji bölgelerine sahip bir dışsal şablon ile sağlandığında, hücre homolog yöneltilmiş onarım 25 , 26 ile çift iplikçik kırılmasını sabitleyebilir. Bu yol, genomda daha büyük hassas silme, değiştirme veya eklemeye izin verir ve ölebilir seçim işaretleri 27&#39;nin eklenmesi ile birlikte. Burada, bu iki CRISPR / Cas9 yöntemlerinden biri ile nakavt hücre hatları üretmek için protokoller sunuyoruz ( Şekil 1A ). NHEJ yaklaşımı, tek bir sgRNA kesim bölgesini ve seçiciden bağımsız taramayı kullanır ve bu nedenle çok fazla ön hazırlık gerektirir. Bu yöntemi kullanırken, transkriptin 5 &#39;ucundaki eksonları tamamlayan ve en iyi nakavt üreten kılavuz RNA&#39;lar tasarlanmalıdır. Modifikattan beriBu durumda iyonların genoma küçük olması, nakavt klonlarının taranması, protein ürününün yüksek verimli bir şekilde değerlendirildiği nokta lekelerine dayanıyor. Bir örnek olarak ELAV benzeri 1 protein (ELAVL1) nakavt hatları neslini kullanırız. İkinci yaklaşım, homoloji yönelimli onarım (HDR) üzerine kuruludur ve onlarca kb silinmesine izin vererek ilgi geni veya bölgeyi kapsayan iki sgRNA kesim bölgesini kullanır. Yarılma bölgelerinin yanındaki iki homoloji bölgesine sahip bir plazmid, nakavt üretiminin verimliliğini arttıran seçilebilir bir direnç markeri tanıtan bir değiştirme şablonu ( Şekil 1B ) sağlar. Bu yöntem, uygun şekilde tasarlanmış homoloji kollarıyla gen modifikasyonlarını başlatmak için uyarlanabilir. Bu durumda, yeni bir DNA parçasının entegrasyonu PCR&#39;ye dayalı taramaya izin verir ( Şekil 1C ). Burada, örnek olarak Pumilio RNA bağlayıcı aile üyesi 2 (PUM2) nakavt hatları neslini kullanıyoruz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="740">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:227px;">Competent E. coli cells</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">plasmid prep kit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pSpCas9(BB) plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>42230</td>
			<td>Ran et al 2013, cloning sgRNAs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BbsI enzyme</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>FD1014</td>
			<td>Ran et al 2013, cloning sgRNAs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">T7 DNA ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0318L</td>
			<td>Ran et al 2013, cloning sgRNAs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tango Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BY5</td>
			<td>Ran et al 2013, cloning sgRNAs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PlasmidSafe exonuclease</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>E3105K</td>
			<td>Ran et al 2013, cloning sgRNAs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Q5 hot start high fidelity polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0494A</td>
			<td>HA amplification</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pUC19-BsaI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Modified pUC19 plasmid, mutated existing BsaI site and inserted two outward facing BsaI sites after BamHI/EcoRI digestion</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pGolden-Neo</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>51422</td>
			<td>Resistance cassette</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pGolden-Hygro</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>51423</td>
			<td>Resistance cassette</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BsaI enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3535S</td>
			<td>Homology arm contruction</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">T7 DNA ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0318L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PlasmidSafe exonuclease</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>E3105K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Toothpicks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>bacterial PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Taq polymerase</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>bacterial colony PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEK293 human cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT35010CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Strep (opt.)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6 well plates</td>
			<td>BioLite</td>
			<td>12556004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TransIT-LTI Transfection Reagent</td>
			<td>Mirus</td>
			<td>MIR2300</td>
			<td>for lipofection only</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Opti-MEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31985062</td>
			<td>for lipofection only</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">G418 (Neomycin)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A1720-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hygromycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3274-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96 well plates</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12556008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Passive Lysis Buffer, 5x</td>
			<td>Promega</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">1xSDS loading buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>recipe decribed in protocol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nitrocellulose Membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>162-0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TBST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>recipe decribed in protocol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dehydrated milk</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>34075</td>
			<td>for HRP-conjugated secondary antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Extracta DNA prep for PCR</td>
			<td>Quantabio</td>
			<td>95091-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KOD polymerase</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>71316</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

selection-dependent and independent generation of crispr/cas9-mediated gene knockouts in mammalian cells

CRISPR / Cas9 genom mühendisliği sistemi, az çaba sarf ederek hassas genom düzenlemesine izin vererek biyolojiye devrim yarattı. Spesifikliği kazandıran tek bir rehber RNA (sgRNA) yardımıyla Cas9 proteini, her iki DNA zincirini hedeflenen lokusta parçalamaktadır. DNA kopması homolog olmayan bitiş katılma (NHEJ) veya homoloji yönelimli onarım (HDR) tetikleyebilir. HDR, daha büyük ve daha hassas pertürbasyonlara izin verirken, NHEJ, çerçeve kayması mutasyonlarına yol açan küçük delesyonlar veya eklemeler başlatabilir. Burada, çökertilmiş hücre hatlarının üretilmesi için protokolleri, kurulu CRISPR / Cas9 yöntemlerini downstream seçim / tarama için iki seçenek ile birleştirerek sunuyoruz. NHEJ yaklaşımı, tek bir sgRNA kesim bölgesini ve seleksiyondan bağımsız taramayı kullanır; burada, protein üretiminin nokta imünoblotuyla yüksek verimli bir şekilde değerlendirildiği yerdir. HDR yaklaşımı ilgi geni boyunca uzanan iki sgRNA kesim bölgesini kullanır. Sağlanan HDR şablonuyla birlikte bu yöntem silme gerçekleştirebilirEklenebilen seçilebilir direnç işaretleyicisinin yardımıyla, onlarca kb arasında değişir. Her bir yöntemin uygun uygulamaları ve avantajları tartışılmıştır.

ELAVL1 nakavt hatlarının üretilmesi için sağlam bir antikor mevcuttu, bu nedenle tek sgRNA&#39;lar ( Şekil 1A , solda) kullanılarak düzenleme, ardından nokta immünoblot uygulandı. Elde edilen klonlarda verimlilikleri karşılaştırmak ve hedef etkileri dışarıda bırakmak için bağımsız olarak üç sgRNA transfekte edildi. Hücre lizatlarını, iki nitroselüloz zar üzerine klonal popülasyondan toplayıp blotladıktan sonra lekeler hem ELA...

Watch this Scientific Journal Video about Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells at JoVE.com

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells (Video) | JoVE

Somatik hücre dizilerini genetik olarak manipüle etme becerisindeki son gelişmeler, temel ve uygulamalı araştırmalar için büyük potansiyele sahiptir. Burada, CRISPR / Cas9&#39;un ürettiği nakavt üretimi ve seçilebilir işaretlerin kullanılıp kullanılmadığı memeli hücre hatlarında tarama için iki yaklaşım sunuyoruz.

Memeli Hücrelerinde CRISPR / Cas9 aracılı Gen Knockout&#39;larının Seçime Bağlı ve Bağımsız Üretimi

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures (Video) | JoVE

İnsan Primer Hücre Kültürleri içinde Sirkadyen Saat Gen İfade ve Hormon salgısını Paralel Ölçümü

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus (Video) | JoVE

Yetiştirme ve Gizle böcek RNA aracılı gen demonte çift sarmallı,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format (Video) | JoVE

CRISPR genotipine bir Floresan PCR kılcal jel elektroforezi Tekniği / yüksek verimli bir Format Nakavt Mutants Cas9 aracılı

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells (Video) | JoVE

Yerinde mutagenisitesinin CRISPR/Cas9 ve SsODN insan hücrelerinde tarafından katalize nokta mutasyon onarım bir fonksiyonu olarak incelemek için standart bir metodoloji

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning (Video) | JoVE

Nesil bir gen kesintiye Streptococcus mutans çoğunlukla zorlanma olmadan Gen Klonlama

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy (Video) | JoVE

Bir bitiş homoloji-aracılı katılmadan tabanlı strateji kullanarak hedeflenen Integration CRISPR/Cas9-aracılı Vivo içinde

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells (Video) | JoVE

Integrase-eksik Lentiviral vektörler üretimi için CRISPR/Cas9-aracılı Gene hücre bölünmesi içinde nakavt için bir iletişim kuralı

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio (Video) | JoVE

Verimli üretim ve Model sistem Danio rerio kimlik CRISPR/Cas9 tarafından oluşturulan Gene altını gizleme

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells (Video) | JoVE

Düzenleyici elemanlarının ölçü Kromatin erişilebilirlik memeli hücrelerinde formaldehit destekli izolasyon

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9 (Video) | JoVE

Fare ve insan hematopoetik progenitör hücre tarafından CRISPR/Cas9 yüksek verimli Gene bozulma

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...