Name: chromatin immunoprecipitation (chip) in mouse t-cell lines
Uploaded: 2017-06-17T14:00:00
Duration: 11 min 39 s
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उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए हम पी। केस और टी। श्मिट-वॉल का आभारी हैं। यह काम सहयोगी अनुसंधान अनुदान TRR81 और डीएफ़जी (जर्मन अनुसंधान फाउंडेशन), मैक्स प्लैंक सोसायटी और फ्रीबर्ग में एसीसी 2 9 4 के हाइजेनबर्ग कार्यक्रम (बीओ 1639 / 5-1) और कार्डियो पल्मोनरी सिस्टम के लिए उत्कृष्टता क्लस्टर द्वारा समर्थित था (ईसीसीपीएस) जीएससेन में टीबी

नोट: इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किए गए सभी बफ़र्स और मध्यम तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं दिन 1 और 2 1. कोशिकाओं को क्रॉसलिंकिंग <ol><li> एक 6-अच्छी तरह से थाली से माउस टी-कोशिकाओं को 50 एमएल ट्यूब और 4 डिग्री सेल्सियस और ~ 271 x जी पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र में स्थानांतरित करें। आईएमडीएम सेल संस्कृति माध्यम के 30 एमएल में सेल गोली resuspend और एक Neubauer कक्ष का उपयोग कोशिकाओं की गणना </li><li> नए 50 एमएल ट्यूबों में 20 x 10 6 कोशिकाओं के अलियंत्रकों को इकट्ठा करें। </li><li> सीधे सेल संस्कृति माध्यम के लिए 1% अंतिम एकाग्रता में फॉर्मलाडीहाइड (एफएमए) जोड़ें और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते रहें। सावधानी: एफएमए अगर साँस लेता है, तो धुएं के नीचे काम करते हैं और उचित सुरक्षा उपकरण पहनते हैं। इसके अलावा, कृपया होस्ट संस्थान के नियमों के अनुसार एफएमए अपशिष्ट को संभाल लें। </li><li> 1 एम ग्लाइसिन का 1/8-मात्रा जोड़ें, पीएच 7.0, और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं। </li><li> 5 के लिए सेंटीफ्यूगेशन द्वारा कोशिकाओं को गोली मारोन्यूनतम 4 डिग्री सेल्सियस और ~ 271 xg और फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस) के 10 एमएल के साथ धो लें। </li><li> पीबीएस के 1 एमएल के साथ सेल गोली धो लें और 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरण करें। </li></ol> 2. सेल lysis और क्रोमैटिन बाल काटना <ol><li> 1 एमएल एसडीएस लिसेफेशन बफर में सेल गोली को फिर से खोलें और 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेते रहें। </li><li> प्रत्येक नमूना को एक sonication ट्यूब में स्थानांतरित करें और तालिका 2 में संकेतित सेटिंग्स के अनुसार ध्यान केंद्रित ultrasonicator का उपयोग करके कर्तन करें । </li><li> कर्तन के बाद, नमूनों को 1.5 एमएल ट्यूब और सेंटीफ्यूज को 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और ~ 18,000 x जी पर स्थानांतरित करें। </li><li> सतह पर तैरनेवाला को नई ट्यूबों में स्थानांतरित करें। </li><li> चरण 3 के अनुसार बाल कर्तन की क्षमता निर्धारित करने के लिए 50 μL लीजिए और तरल नाइट्रोजन में शेड लाइसेट को स्नैप-फ्रीज करें। -80 डिग्री सेल्सियस पर सिंगल-उपयोग अल्कोट्स में lysate स्टोर करें </li></ol> 3. बाल काटना क्षमता का निर्धारण <ol><li> 50 और एल्यूएशन 50 एल्यूएल बफर को जोड़ें181; प्रत्येक शेयर्ड लोयसेट के एल और 65 डिग्री सेल्सियस पर रात में, मिलाते हुए। </li><li> ते बफर के 100 μL और 4 μL 10 मिलीग्राम / एमएल आरएनज़ ए (0.2 माइक्रोग्राम / μL अंतिम एकाग्रता) जोड़ें। मिक्स और 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए मिलाते हुए, मिलाते हुए। </li><li> प्रत्येक नमूने के लिए 2 μL 20 मिलीग्राम / एमएल प्रोटीनेस के (0.2 माइक्रोग्राम / μL अंतिम एकाग्रता) को जोड़ें और 2 डिग्री सेल्सियस पर 55 डिग्री सेल्सियस पर मिलाकर मिलाएं। </li><li> फ़िनोल / क्लोरोफॉर्म / आईसोमिल अल्कोहल निकासी के लिए उपयुक्त प्रत्येक जेल ट्यूब में प्रत्येक नमूना स्थानांतरण करें; निर्माता के निर्देशों के अनुसार संभाल </li><li> 200 μL फिनोल / क्लोरोफॉर्म / आइसोमिल अल्कोहल (25: 24: 1) जोड़ें और ट्यूबों को हिलाएं। 24 डिग्री सेल्सियस और ~ 16,000 XG पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र और नए ट्यूबों के ऊपरी चरण को स्थानांतरित करें। सावधानी: श्वास और संक्षारक होने पर फेनोल, क्लोरोफॉर्म, और आइसोमिल अल्कोहल विषैले होते हैं; एक धूआं हुड के नीचे काम करते हैं और उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनते हैं इसके अलावा, फिनोल, क्लोरोफॉर्म, और आइसोमिल अल्कोहल अपशिष्ट एसी को संभालनामेजबान संस्था के नियमों के अनुसार। <ol><li> एक बार पुन: दोहराएं। </li></ol></li><li> निर्माता के निर्देश के अनुसार शुद्धीकरण कॉलम का उपयोग करके निम्नलिखित संशोधनों के साथ डीएनए शुद्ध करें: <ol><li> झिल्ली को दो बार धो लें आखिरी धोने के बाद, कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए ट्यूब को छोड़ दें और अवशिष्ट इथनॉल को लुप्त हो जाना। </li><li> एच्युओटी के लिए, 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 50 μL जोड़ें, 1 मिनट के लिए ट्यूब को घुमाएं और झिल्ली को ठीक से गीला कर दें, और 1 मिनट के लिए 1 मिनट के लिए डीएनए से पहले 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेवन करें। 24 डिग्री सेल्सियस और ~ 17,900 x जी </li></ol></li><li> निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक उच्च संवेदनशीलता किट का उपयोग कर एक फ्लोरोरोमीटर पर शुद्ध डीएनए को बढ़ाएं। </li><li> 1.8% agarose जेल पर शुद्ध डीएनए के लगभग 500 एनजी और उच्च संवेदनशीलता किट का उपयोग कर एक वैद्युतकणसंचलन प्रणाली पर लगभग 1 एनजी का विश्लेषण करें। नोट: उम्मीद की गई थीडीएनए टुकड़ों के ई 200 और 500 बीपी के बीच है। </li></ol> दिन 3 और 4 4. Immunoprecipitation <ol><li> कमजोर पड़ने वाले बफर के 5 संस्करणों के साथ लेयरेट की मात्रा 1 मात्रा पतला। </li><li> 30 μL / एमएल प्रोटीन के साथ प्रीलाइरल एक परिपत्र मोती ( परिशिष्ट ए के अनुसार तैयार) 30 मिनट के लिए ठंडे कमरे में घुमाने के दौरान। </li><li> 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट ~ 750 x ग्रा पर अपकेंद्रित्र </li><li> इनपुट का 10% ले लीजिए और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें </li><li> नई ट्यूबों में वांछित एलिसेट की मात्रा को विभाजित करना (विवरण के लिए तालिका 3 देखें)। प्रत्येक ट्यूब में इच्छित एंटीबॉडी जोड़ें (विवरण के लिए तालिका 3 देखें) और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाएं </li><li> घूर्णन करते समय 40 μL प्रोटीन एक मोती जोड़ें और 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस तक सेवन करें। </li><li> 1 एमएल कम नमक बफर, हाई-नमक बफर, लीक बफर, और ते बफर के साथ मोती धो लें (प्रत्येक धोने के लिए, 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस से घूर्णन और अपकेंद्रित्र3 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस और ~ 950 xg के लिए) विवरण के लिए तालिका 3 देखें </li><li> एल्यूएशन बफर के 110 μL को जोड़ें और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेवन करें, हर 2 मिनट में vortexing। </li><li> 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और ~ 950 XG के लिए अपकेंद्रित्र और एक नई 1.5-एमएल ट्यूब पर सतह पर तैरनेवाला के 100 μL स्थानांतरण। </li><li> दोहराव 4.7-4.8 दोहराव बफर के 100 μL के साथ दोहराएं और एलावाओं को संयोजित करें। नमूनों को इनपुट करने के लिए 200 μL तक अल्युशन बफर जोड़ें </li><li> सभी नमूनों को रात भर 65 डिग्री सेल्सियस से मिलाते हुए मिलाते हुए। </li></ol> दिन 5 5. डीएनए शुद्धि <ol><li> प्रत्येक एल्यूएट और 8 μL 10 मिलीग्राम / एमएल आरएनस ए (0.2 माइक्रोग्राम / μL अंतिम एकाग्रता) के लिए 200 मील का ते बफर जोड़ें। मिक्स और 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए मिलाते हुए, मिलाते हुए। </li><li> प्रत्येक एल्यूएट में 4 μL 20 मिलीग्राम / एमएल प्रोटीनेस के (0.2 माइक्रोग्राम / μL अंतिम एकाग्रता) को जोड़ें और 2 डिग्री सेल्सियस 55 डिग्री सेल्सियस पर मिलाकर मिलाएं। </li><li> प्रत्येक नमूने को जेल में स्थानांतरित करेंफिनोल / क्लोरोफॉर्म / आईसोमिल शराब निकासी के लिए उपयुक्त ट्यूब; निर्माता के निर्देशों के अनुसार संभाल </li><li> 400 μL फिनोल / क्लोरोफॉर्म / आइसमैल अल्कोहल (25: 24: 1) जोड़ें और ट्यूबों को हिलाएं। 24 डिग्री सेल्सियस और ~ 16,000 x ग्रा पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र नए ट्यूबों के ऊपरी चरण को स्थानांतरित करें सावधानी: श्वास और संक्षारक होने पर फेनोल, क्लोरोफॉर्म, और आइसोमिल अल्कोहल विषैले होते हैं; एक धूआं हुड के नीचे काम करते हैं और उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनते हैं इसके अलावा, मेजबान संस्थान के नियमों के अनुसार फ़िनोल, क्लोरोफॉर्म, और आइसोमिल शराब अपशिष्ट को संभालना। <ol><li> एक बार पुन: दोहराएं। </li></ol></li><li> निम्नलिखित संशोधनों के साथ निर्माता के निर्देशों के अनुसार शुद्धिकरण कॉलम का उपयोग करके डीएनए को शुद्ध करना: </li><li> झिल्ली को दो बार धो लें आखिरी धोने के बाद, कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए खुले रहने के लिए अवशिष्ट इथनॉल को लुप्त हो जाना छोड़ दें। </li><li> एलायटिंग के लिए, एच 2 ओ के 50 μL जोड़ें, कमरे के तापमान पर सेते रहें1 मिनट के लिए, 1 एस के लिए ट्यूबों को ठीक से झिल्ली को गीला कर, और 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 24 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट और ~ 17,900 x ग्राम तक सेंटीफ्यूजेशन से डीएनए को जाने से पहले सेते हैं। </li></ol>

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लेखकों के पास कोई प्रतियोगी वित्तीय हित नहीं है

चिप एक विशिष्ट तकनीक है जो जांच कर रहा है कि प्रोटीन या उनके पीटीएम विशिष्ट जीनोमिक क्षेत्रों में समृद्ध हैं या नहीं। चिप परख परिणाम अक्सर जैविक या तकनीकी कारणों की वजह से व्याख्या करने के लिए चुनौतीपूर्ण होते हैं। जैविक कारण बहुत से होते हैं और इसमें डीएनए के लिए प्रोटीन की कमजोर या अप्रत्यक्ष बंधन शामिल है। इसमें तकनीकी सीमाएं भी हैं, जैसे कि सीमित एंटीबॉडी विशिष्टता और अक्षम सेल सेल या लिपटाइन की मात्रा। एक समस्या निवारण गाइड ( तालिका 5 ) रीढ़ की हड्डी के साथ समस्याओं का समाधान करने के लिए पाठक को मदद कर सकता है। यह प्रोटोकॉल, शीतलन केंद्रित ultrasonicator डिवाइस का उपयोग करता है, जिससे कि एक परिपक्व माउस T-cell लाइन के क्रोमेटिन को कुशलतापूर्वक कतरनी की अनुमति देता है। प्रोटोकॉल का मुख्य महत्वपूर्ण चरण क्रोमेटिन के कवच द्वारा दर्शाया जाता है, जिसे हमेशा प्रत्येक सेल प्रकार के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। यह कोशिकाओं की संख्या और सोनिक चक्र की संख्या भिन्न करने का सुझाव दिया गया है। इसके अलावा, वह<html> एसडीएस की उपस्थिति से नकारात्मक प्रभाव पड़ता है, जो नमूनों में प्रक्षेपित होता है, जो एसडीएस बिसर के साथ बर्फ पर कोशिकाओं के विश्लेषण के दौरान हो सकता है। इस मामले में, एसडीएस की उपस्थिति को कम करने के लिए कुछ मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एलिसेशन के बाद नमूना सेवन करना सबसे अच्छा होता है। यह प्रोटोकॉल को 200 से 500 बीपी के बीच शेड टुकड़े प्राप्त करने और इम्युनोपेरैगिज के साथ आगे बढ़ने से पहले नमूने की कतरनी की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए अनुशंसित है। इसके अतिरिक्त, निर्धारण समय, एंटीबॉडी और / या कोशिकाओं की मात्रा, और धोने की स्थिति को प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। चिप प्रक्रिया सफल बनाने में एक और महत्वपूर्ण कदम एंटीबॉडी का विकल्प है, क्योंकि कम विशिष्टता वाले एंटीबॉडी ने इम्युनोपेरेएबजी की दक्षता को काफी कम कर दिया है। इससे पहले, बाजार में उपलब्ध कई एंटीबॉडी की विशिष्टता के मूल्यांकन के लिए एक एकीकृत गुणवत्ता परीक्षण प्रक्रिया की अनुमति दी गई थी<html> Ss = &quot;xref&quot;&gt; 1 9 स्क्रीनिंग पाइप लाइन, डॉट ब्लोट, वेस्टर्न ब्लॉट, और चिप पर आधारित थी, जिसमें चिप 19 के लिए उपयुक्त उच्च गुणवत्ता वाला अभिकर्मकों की सूची उपलब्ध है। हाल ही में, कई वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी की विशिष्टता का मूल्यांकन उच्च घनत्व हिस्टोन पेप्टाइड माइक्रोएरे प्लेटफार्मों के द्वारा किया गया था, जो कि एंटीबॉडी विशिष्टता 20 पर एक डेटाबेस की स्थापना के लिए अनुमति देता है। चिपर प्रयोगों के लिए उपयोग किए जा सकने वाले सबसे विशिष्ट एंटीबॉडी की पहचान करने के लिए रीडर इस उपयोगी उपकरण का उपयोग कर सकते हैं। इस प्रोटोकॉल को प्राथमिक टी-कोशिकाओं के लिए परीक्षण नहीं किया गया है और, इस मामले में, पाठक को अन्य प्रकाशित प्रोटोकॉल का उल्लेख करना चाहिए जो सफलतापूर्वक प्राथमिक टी-कोशिकाओं 3 , 4 , 21 पर चिप का प्रदर्शन कर रहे हैं। विशेष रूप से, यह प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक माउस उत्प्रेरक टी सेल लाइन पर चिप के साथ-साथ माउस एंडोथेलियल सेल लाइन पर भी प्रदर्शन करने के लिए उपयोग किया गया है। Ove_content &quot;&gt; 5 x 10 6 कोशिकाओं को हिस्टोन अंकों के विश्लेषण के लिए प्रत्येक immunoprecipitation के लिए उपयोग किया जाना चाहिए। क्योंकि यह प्रोटोकॉल कुछ ऑप्टिमाइज़ेशन के साथ, TFs या cofactors पर चिप करने के लिए उपयुक्त भी हो सकता है, यह कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि करना सबसे अच्छा है इन मामलों में immunoprecipitation के लिए उपयोग किया जाता है। प्रत्येक प्रयोग के लिए आवश्यक संख्या में कोशिकाओं तक पहुंचने के लिए, कमजोर पड़ने वाले बफर में क्रोमेटिन को कम करने से पहले शेयर्ड लाइसेट के अधिक अलोकुट को एक साथ जमा किया जा सकता है। डीएनए को सीधे बाँध नहीं करते हैं जो अंतर्जात प्रोटीन पर चिप करने के लिए इस प्रोटोकॉल को संशोधित किया जा सकता है। इस मामले में, प्रोटीन-प्रोटीन क्रॉटलिंकर्स ( जैसे, डाइमिथाइल एडिपिमिडेट, डीएमए) के साथ पूर्व-निर्धारण की आवश्यकता हो सकती है (अधिक जानकारी के लिए परिशिष्ट बी देखें)। कॉफ़ेक्टर्स पर चिप के सफल प्रदर्शन को पहले से ही प्रोटीनों के बायोटीन-टैग में लगाए जाने वाले प्रोटीनों द्वारा किया गया था। इस मामले में, प्रोटीन को स्ट्रेक्टिविडिन-कंजुगा से शुद्ध किया गया थाटेड चुंबकीय मोतियों, और डीएमए के साथ एक पूर्व निर्धारण 22 प्रदर्शन किया था।

विकास, भेदभाव, और होमोस्टैसिस विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति कार्यक्रमों पर निर्भर करते हैं जो कि सिग्नलिंग इवेंट से स्थापित होते हैं जो क्रोमैटिन संरचना को विनियमित करते हैं और इसलिए निर्धारित करते हैं कि किसी विशिष्ट जीन को सक्रिय किया जाता है या सेल-और समय-विशिष्ट तरीके से दमन होता है या नहीं। टी-सेल के विकास के दौरान, टी-सेल के अग्रदूतों के परिप्रेक्ष्य को एक-पॉजिटिव (एसपी) राज्य में डबल-नेगेटिव (डीएन) से परिपक्व होने के लिए विशिष्ट जीन एक्सप्रेशन प्रोग्राम स्थापित किए जाने चाहिए, जो कि कई मध्यवर्ती अवस्थाएं 1 से गुजरती हैं। टी सेल विकास के दौरान गतिशील रूप से विनियमित जीन अभिव्यक्ति कार्यक्रम को पिछले वर्षों में मोटे तौर पर कई प्रयोगशालाओं 2 , 3 , 4 , 5 , 6 द्वारा जांच की गई है । हिस्टोन्स के बाद-अनुवादित संशोधनों (पीटीएम) द्वारा, एक्सचेंजहिस्टोन वेरिएंट, न्यूक्लियोसोम बेदखली के साथ कैनोनिकल हिस्टोन, और डीएनए मेथिलैलेशन जीन के ऑन / ऑफ स्विच को विनियमित करते हैं। कई समूहों ने पीटीएम और हिस्टोन वेरिएंट्स के जीनोम-विस्तृत वितरण का पता लगाया है जो अलग-अलग क्रोमेटिन के साथ संबद्ध हैं, जो 7 , 8 , 9 , 10 के दोनों समीपस्थ और बाह्य विनियामक क्षेत्रों में हैं। सिग्नलिंग कैसकेड विशिष्ट बढ़ाने वाले तत्वों पर सकारात्मक और नकारात्मक क्रोमैटिन-संशोधित एंजाइमों के आदान-प्रदान के माध्यम से गतिशील क्रोमेटिन विनियमन (जिसे क्रोमैटिन संशोधक भी कहा जाता है) का आयोजन करता है। ये क्रोमैटिन संशोधक क्रोमैटिन संरचना को विनियमित करते हैं और इस प्रकार ट्रांसक्रिप्शनल आउटपुट द्वारा, उदाहरण के लिए, गतिशील हिस्टोन मेथिलैशन और एसिटिलेशन। यह निशान सिग्नलिंग मार्ग 11 , 12 , 13 ,14 गतिशील हिस्टोन PTMs; हिस्टोन वेरिएंट के साथ एक्सचेंज; और हिस्टोन, ट्रांसक्रिप्शन कारकों और कॉफ़ैक्टर्स के गतिशील अधिभोग की जांच क्रोमैटिन इम्युनोपेरेग्रेशन (चिप) एसेल्स द्वारा की जा सकती है। अति विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग विशिष्ट डीएनए-प्रोटीन परिसरों को शुद्ध करने के लिए किया जाता है, और शुद्ध डीएनए का मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) द्वारा विश्लेषण किया जाता है; गहरे क्रमिक (चिप-सेक); या, आजकल कम बार, माइक्रोएरे (चिप-चिप) को संकरण। कोशिकाओं के विश्लेषण, क्रोमैटिन के कवच और / या एंटीबॉडी के निम्न विशिष्टता के साथ जटिलताओं के कारण चिप आर्च कभी-कभी चुनौती होती है। प्रोटोकॉल में सुधार के लिए कई रणनीतियों को अपनाया गया है, जैसा कि नेक्ससॉन 15 के मामले में है शीतलक जल-स्नान ध्वनियों का उपयोग नमूना हीटिंग से बचा जाता है जो जांच के तहत प्रोटीन पर मौजूद एपिटोप्स को नुकसान पहुंचा सकता है, लेकिन नमूनों की कतरनी के लिए जरूरी ऊर्जा को पानी में फैला दिया जाता है।ऊर्जा के फैलाव को रोकने वाले केंद्रित अल्ट्रासोनिक उपकरणों के विकास के साथ एक और सुधार किया गया था। इसलिए, ध्यान केंद्रित ultrasonicator उपकरणों सेल lysis और chromatin कर्तन में सुधार के लिए अनुमति देते हैं, ऑपरेटर प्रेरित विविधताओं को नष्ट करने और महत्वपूर्ण रूप से reproducibility बढ़ रही है। यह काम ईटीपीएचए 16 , 17 नामक एक परिपक्व माउस टी-सेल लाइन में हिस्टोन प्रोटीन के चिप को कुशलतापूर्वक करने के लिए प्रोटोकॉल ( चित्रा 1 में योजनाबद्ध अवलोकन) का वर्णन करता है। आमतौर पर टी कोशिकाओं को बोलना मुश्किल होता है, और उनके क्रोमैटिन के कवच को अक्षम होने का पता चला है। इस प्रोटोकॉल में, जो एक ठंडा ध्यान केंद्रित ultrasonicator का उपयोग करता है, कोशिकाओं की संख्या, lysis बफर, और कर्तन की स्थापना E2-10HA माउस T- सेल लाइन के लिए अनुकूलित थे यह प्रोटोकॉल एक उच्च प्रजनन क्षमता और उचित समय के साथ चिप को करने की अनुमति देता है। वास्तव में, यह requirक्रोमेटिन को कतरनी करने के लिए लगभग दो दिन और कर्तन की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए, और तीन दिनों में इम्यूनोपेरैजैज करने के लिए, क्रॉस्लिंक को उलट करें और डीएनए शुद्ध करें।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="912">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:496px;">Agilent High Sensitivity D5000 Reagents</td>
			<td style="width:223px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:129px;">5067-5593</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Agilent High Sensitivity D5000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-5592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Agilent Tapestation 4200</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Covaris S220 AFA System</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>500217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">dimethyl adipimidate (DMA)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>20660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Pan-Biotech</td>
			<td>1502-P121301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Formaldehyde (FMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Insulin solution human&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9278-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Iscove&#39;s modified Dulbecco&#39;s medium (IMDM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21980-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Minimum essential medium non-essential amino acids (MEM NEAA)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">nProtein A Sepharose 4 Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5280-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Peptone primatone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4963-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Phase Lock Gel Heavy 2 ml</td>
			<td>5 Prime</td>
			<td>2302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A156.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">QIAquick PCR Purification Kit (250)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Qubit assay tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Tube AFA Fiber &#38; Cap</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520081</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromatin immunoprecipitation (chip) in mouse t-cell lines

सिग्नलिंग पथ, अलग-अलग स्तरों पर क्रोमेटिन संरचना के मॉड्यूलेशन के माध्यम से जीन एक्सप्रेशन कार्यक्रमों को विनियमित करते हैं, जैसे कि हिस्टोन पूंछ के बाद-अनुवादित संशोधनों (पीटीएम), हिस्टोन वेरिएंट के साथ कैनोनिकल हिस्टोन का आदान-प्रदान, और न्यूक्लियोसोम बेदखली। ऐसे विनियमन के लिए संकेत-संवेदनशील प्रतिलेखन कारकों (टीएफ) की बाध्यकारी आवश्यकता होती है जो कि उच्चवर्धक के रूप में परिभाषित नियामक तत्वों पर क्रोमैटीन-संशोधित एंजाइमों की भर्ती करते हैं। समझ कैसे संकेतन कैसकेड अनुवर्ती गतिविधि को विनियमित करने के लिए टीएफ के बंधन, क्रोमैटिन संशोधित एंजाइमों और विशिष्ट हिस्टोन अंकों और हिस्टोन वेरिएंट के अधिभोग के लिए व्यापक विश्लेषण की आवश्यकता है। क्रोमैटिन इम्युनोपेरेग्रेशन (चिप) एसेज विशिष्ट प्रोटीन / डीएनए कॉम्प्लेक्स को अनियंत्रित करने के लिए अत्यधिक विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करता है। शुद्ध डीएनए के बाद के विश्लेषण में एंटीबॉडी द्वारा मान्यता प्राप्त प्रोटीन द्वारा कब्जा कर लिया क्षेत्र की पहचान के लिए अनुमति देता है। यह काम कुशलतापूर्वक पे के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता हैएक परिपक्व माउस टी-सेल लाइन में हिस्टोन प्रोटीन की चप्पे चीप प्रस्तुत प्रोटोकॉल चिप अवधि के उचित समय-सीमा में और उच्च प्रजनन क्षमता के साथ प्रदर्शन के लिए अनुमति देता है।

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Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

यह काम एक परिपक्व माउस टी-सेल लाइन का उपयोग करके क्रोमैटिन इम्युनोपेरेग्रेशन (चिप) के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। यह प्रोटोकॉल विशिष्ट प्रमोटर साइटों या जीनोम-वाइड पर विशिष्ट हिस्टोन अंकों के वितरण की जांच के लिए उपयुक्त है।

माउस टी-सेल लाइनों में क्रोमैटिन इम्युनोपेरिगेशन (चिप)

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

क्रोमैटिन इम्युनोपर्रेबिज़ का उपयोग करने वाली सी-केट लिगेंड प्रमोटर का विश्लेषण

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Nucleosome घनत्व विश्लेषण के लिए देशी क्रोमेटिन Immunoprecipitation अनुक्रमण पुस्तकालयों की पीढ़ी

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

क्रोमेटिन Immunoprecipitation (चिप) कम बहुतायत भ्रूण के नमूनों के लिए प्रोटोकॉल

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae से citrullinated संशोधनों की क्रोमेटिन Immunoprecipitation (चिप)

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-क्रोमेटिन लूप संरचना की मध्यस्थता पुनर्गठन

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Murine ब्राउन वसा ऊतक के क्रोमेटिन Immunoprecipitation

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

क्रोमैटिन इम्यूनोएमिनेशन असेसे मैमलियन सेल में माइक्रोकोकल न्यूक्लेस का उपयोग करते हुए

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing (ChIP-seq)

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing ChIP-seq

क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिसिप्रिशन और हाई-थ्रूपुट अनुक्रमण (ChIP-seq) का उपयोग करके साल्मोनेला बायोफिल्म में सीएसजीडी नियामक लक्ष्यों की खोज

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) is a technique that can be used to discover the regulatory targets of transcription ...

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease ChIP-Exo

क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिपिCIPिशन-एक्सोक्यूलेसेज (सीआईपी-एक्सो) का उपयोग करके माउस स्टेम सेल-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स में प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन का उच्च-संकल्प मानचित्रण

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled ...

Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

मैग्नापोर्टे ओरिज़ा में क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिपिटेशन अनुक्रमण पद्धति का उपयोग करके हिस्टोन संशोधनों के जीनोम-वाइड विश्लेषण

Chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) is a powerful and widely used molecular technique for mapping whole genome locations of transcription ...