Name: quantitative immunofluorescence to measure global localized translation
Uploaded: 2017-08-22T13:00:00
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Wir danken Dr. Rachid Mazroui (Université Laval, Québec, Kanada) für die kritische Lektüre des Manuskripts. Wir danken der Zelle Bildtrommel des Forschungszentrums für ihre technische Unterstützung. M.-É. Huot ist ein Junior 1 Research Scholar des Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQ-S). Diese Arbeit wurde von der Canadian Institutes of Health Research unterstützt (Anzahl CIHR, MOP-286437, M.-É zu gewähren. Huot).

1. Bestimmung der Puromycilation Bedingungen Hinweis: Diese Technik beschreibt die Methode verwendet, um lokalisierte Übersetzung während der MRC-5 Zelle Adhäsion Prozess 5 bewerten. Als Puromycilation in einer beliebigen Zelle getan werden kann, ist es wichtig, die Puromycilation Bedingungen für die spezifische Zelllinien verwendet werden, zu optimieren, da die Behandlungsbedingungen für jede Zelllinie in Bezug auf die Puromycin-Konzentration und die gewünschte ...

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	<li>Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+Translation+of+Single+mRNA+Molecules+In+Vivo.">Dynamics of Translation of Single mRNA Molecules In Vivo.</a> Cell. 165, 976-989 (2016).</li><li>Morisaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantification+of+single+RNA+translation+dynamics+in+living+cells.">Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells.</a> Science. 352, 1425-1429 (2016).</li><li>Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sam68+regulates+translation+of+target+mRNAs+in+male+germ+cells,+necessary+for+mouse+spermatogenesis.">Sam68 regulates translation of target mRNAs in male germ cells, necessary for mouse spermatogenesis.</a> J Cell Biol. 185, 235-249 (2009).</li><li>Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. S. U. n. S. E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUnSET,+a+nonradioactive+method+to+monitor+protein+synthesis.">SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis.</a> Nat Methods. 6, 275-277 (2009).</li><li>Azzam, M. E., Algranati, I. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Analysis+of+mRNA,+Translation,+and+Protein+Localization:+Local+Translation+Is+a+Key+Regulator+of+Cell+Protrusions.">Global Analysis of mRNA, Translation, and Protein Localization: Local Translation Is a Key Regulator of Cell Protrusions.</a> Dev Cell. 35, 344-357 (2015).</li><li>Lacsina, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+translational+termination+products+are+rapidly+degraded+substrates+for+MHC+class+I+presentation.">Premature translational termination products are rapidly degraded substrates for MHC class I presentation.</a> PLoS One. 7, e51968 (2012).</li><li>Schneider-Poetsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+eukaryotic+translation+elongation+by+cycloheximide+and+lactimidomycin.">Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin.</a> Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).</li><li>Jacobs, J. P., Jones, C. M., Baille, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+a+human+diploid+cell+designated+MRC-5.">Characteristics of a human diploid cell designated MRC-5.</a> Nature. 227, 168-170 (1970).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale.">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> J Vis Exp. (87), (2014).</li></ol>

Jüngsten technologischen Fortschritte haben für ein besseres Verständnis der Mechanismen translationale Hochregulation oder die Unterdrückung von bestimmten mRNAs in biologischen Prozessen, wie neuronale Entwicklung, Medikamente und Metastasierung zulässig. Die kostengünstige Methodik, die hier beschriebenen lässt die Übersetzung Ereignisse in Zellen zu studieren, wie RNA-bindende Proteine regulieren metastatische Prozesse, wie z. B. zelluläre Adhäsion, Migration und Invasion visualisiert werden.
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Die Regulierung der Übersetzung durch verschiedene Zellfunktionen veranlasste viele Forschungsgruppen zu entwickeln, neue Werkzeuge und Methoden zur Bestimmung der subzellulären Lokalisierung von mRNA Übersetzung und regulierte Protein Synthese1,2 ,3,4. Diese jüngsten technologischen Fortschritte ermöglichen ein besseres Verständnis der Mechanismen, bei denen Übersetzung Hochregulation oder die Unterdrückung von bestimmten mRNAs bei biologischen Prozessen wie neuronale Entwicklung, Medikamente und Metastasierung5 ,6,7,8. Die meisten dieser Methoden erfordern jedoch teuer oder gefährlichen Reagenzien und spezielle Ausrüstung, die möglicherweise nicht die meisten Laboratorien zur Verfügung. Als solche wurde eine kostengünstige Methode ermöglicht die schnelle Beurteilung der Übersetzung Veranstaltungen entwickelt, um speziell diese potenzielle Probleme zu umgehen. Diese Methode erkennt akute translationale Modulationen, die auftreten, während spezifische zelluläre Prozesse und ermöglicht auch für die Lokalisierung der Übersetzung mit der konfokalen Mikroskopie.
Die hier beschriebenen Methoden wurden verwendet, um lokalisierte Übersetzung innerhalb subzelluläre Kompartimente genannt Verbreitung Einleitung-Center (SIC)5zu überwachen. SICs sind vorübergehende Strukturen gefunden in gesetzte Zellen, die auf der Oberseite entstehende Haftung komplexe lokalisiert sind. Obwohl SICs und Adhäsion komplexe unterscheiden, sind ihre Schicksale eng verbunden. In der Tat SICs bekannt, um auf komplexe fokale Adhäsion Reifung zu einem Haftung während der Anfangsphase der Adhäsion allmählich. Wir fanden, dass RNA-bindende Proteine bekannt, um mRNA Übersetzung (z. B. Sam68, FMRP und G3BP1) gezielt zu steuern und Polyadenylated RNAs, innerhalb dieser angereichert wurden Strukturen5. Mit den beschriebenen Methoden hier, haben wir gezeigt, dass die Regulierung der SIC-assoziierte mRNA Übersetzung wirkt als ein Checkpoint erlaubt Zellen zur Konsolidierung der Zelladhäsion gesät. Diese Methode, basierend auf Puromycin Aufnahme konnte eine angepasste Version der Oberfläche Sensing Übersetzung Assay (Sonnenuntergang) betrachtet werden. Ursprünglich entwickelt, um globale Protein Synthese mit einem nicht radioaktiv markierte Aminosäure messen, bietet Protein Puromycilation eine effiziente Möglichkeit, de Novo Protein Synthese9zu visualisieren. Diese Methode beruht auf das innere Verhalten von Puromycin, ein Antibiotikum, das Übersetzung durch vorzeitigen Kettenabbruch in den Ribosom10blockiert. In der Tat ist Puromycin strukturell analog zu Tyrosyl-tRNA, wodurch für den Einbau in Peptidketten über die Bildung einer Peptidbindung verlängern. Puromycin Bindung an eine wachsende Peptid-Kette verhindert jedoch eine neue Peptidbindung gebildet wird mit der nächsten Aminoacyl-tRNA, da Puromycin eine nicht wasserlöslicher Amid-Bindung anstelle der wasserlöslicher Esterbindung in tRNAs gefunden hat. So entsteht die Einbeziehung von Puromycin in Polypeptide verlängern in der vorzeitigen Veröffentlichung von zahlreichen abgeschnittene Puromycilated Polypeptide entsprechend aktiv übersetzten mRNA9,11,12 .
Mit dieser Methode war es möglich, innerhalb kurzer Zeit Witwe aktive Übersetzung bewerten (z. B. 5 min.) während zellulare Adhäsion über einen spezifischen Antikörper gegen Puromycin auf Zellen, die über einen Zeitraum von 5 Minuten mit dem Antibiotikum ergänzt wurden verarbeiten Sie zu verschiedenen Zeitpunkten während der Zelladhäsion5. Die Genauigkeit dieser Assay stützt sich auf hochspezifische Antikörper gegen die Puromycilated glyko-gerichtet. Immunofluorescent Erkennung des Polypeptids Puromycilated bietet eine allgemeine subzelluläre Verteilung der neu übersetzten mRNA, die auch mit großer Genauigkeit mit konfokale bildgebenden Systemen quantifiziert werden kann.
Daher bietet diese Methode eine entsprechende Option für eine große Anzahl von Laboren Studium translationale Regulationsmechanismen in Prozesse wie neuronale Granulation6,13,14, 15, Morphogen mRNA Lokalisierung und Übersetzung während der Entwicklung16,17. Es eignet sich auch gut zum Studium lokalisierte oder unterteilte Übersetzung während der schnellen biologischen Ereignisse, wie Zellwanderung, Haftung oder Invasion oder einfach beurteilen medikamentöse Behandlungen, die translational Änderungen5, induzieren könnte 7 , 18. insgesamt ermöglicht diese Methode zur Visualisierung von lokalisierten oder kontrollierte Übersetzung Ereignisse auf eine schnelle, genaue und kostengünstige Weise.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>wisent</td>
			<td>319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsine</td>
			<td>wisent</td>
			<td>325-043 EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12483020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puroycin antibody 12D10</td>
			<td>EMD millipore</td>
			<td>MABE343</td>
			<td>western blot dilution 1:25000 
			Immunofluoresence dilution 1:10000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>cell signaling technology</td>
			<td>7076</td>
			<td>western blot dilution 1:8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Lightning Plus-ECL</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEL104001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG (H+L), F(ab&#39;)2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate)</td>
			<td>cell signaling technology</td>
			<td>4408</td>
			<td>immunofluoresecence dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF568 Phalloidin</td>
			<td>biotium</td>
			<td>00044</td>
			<td>immunofluoresecence dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexmide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1988-1G</td>
			<td>50&#181;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>final concentration 1&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>bio-Basic</td>
			<td>PJ593</td>
			<td>2.5&#181;g/ml to 10&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi &#181;-Dish 35 mm, high, ibiTreat</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC-5 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huh-7 cells</td>
			<td colspan="2">from Dr. Mazroui (Universit&#233; Laval)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fv1000</td>
			<td>olympus</td>
			<td></td>
			<td>confocal imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://fiji.sc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate BuffeRed Saline)</td>
			<td>bio-Basic</td>
			<td>PD8117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 37% Solution</td>
			<td>bio-Basic</td>
			<td>C5300-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>bio-Basic</td>
			<td>TB0198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP9702-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative immunofluorescence to measure global localized translation

Die Mechanismen zur Regulierung der mRNA Übersetzung sind in verschiedenen biologischen Prozessen, wie z. B. Entwicklung von Keim, Zelldifferenzierung und Organogenese, sowie mehrere Krankheiten beteiligt. Zahlreiche Publikationen haben überzeugend gezeigt, dass spezifische Mechanismen eng mRNA Übersetzung regulieren. Verstärktes Interesse an der Übersetzung-induzierte Verordnung der Proteinexpression führte zur Entwicklung neuer Methoden zu studieren und de Novo Protein Synthese in Cellulofolgen. Die meisten dieser Methoden sind jedoch komplex, so dass sie kostspielig und häufig Begrenzung der Anzahl der mRNA-Ziele, die studiert werden kann. Dieses Manuskript schlägt eine Methode, die erfordert nur grundlegende Reagenzien und konfokale Fluoreszenz-imaging-System zu messen und zu visualisieren, die Änderungen in der Übersetzung der mRNA, die in jede Zelllinie unter verschiedenen Bedingungen auftreten. Diese Methode wurde vor kurzem zur lokalisierte Übersetzung in die subzellulären Strukturen der adhärenten Zellen über einen kurzen Zeitraum hinweg, bietet somit die Möglichkeit der Visualisierung de Novo Übersetzung für eine kurze Zeit während einer Vielzahl von biologischen zeigen Prozesse oder Änderungen in translational Aktivität in Reaktion auf bestimmte Reize zu validieren.

Um Übersetzung Ereignisse mithilfe von Puromycin Aufnahme genau zu beobachten, ist es wichtig, die optimale Bedingungen für jede Zelllinie zu bestimmen, da jeder unterschiedliche Puromycin Einbeziehung Kinetik (Abbildung 1)9,11 zeigt ,12,18. Daher um Puromycin Aufnahme zu überprüfen, ist es notwendig, die gewünschte Zell-Linie...

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Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zum visualisieren und lokalisierte Übersetzung Veranstaltungen in subzelluläre Kompartimente zu quantifizieren. In diesem Manuskript vorgeschlagene Vorgehensweise erfordert eine grundlegende confocal imaging-System und Reagenzien und ist schnell und kostengünstig.

Quantitative Immunfluoreszenz Maßnahme Global lokalisierte Übersetzung

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Genomweite Quantifizierung der Übersetzung in der angehenden Hefe durch Ribosom Profilierung

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Forschung

Biochemie

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Toeprinting Analyse der Übersetzung Einleitung Komplexbildung auf Säugetier-mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

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Atomische Absorbance-Spektroskopie zur Messung von intrazellulären Zink-Pools in den Mamänarchalzellen

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Einsatz der mikroskaligen Thermophorese zur Messung von Protein-Lipid-Wechselwirkungen

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

Ubiquitin-Kettenanalyse durch Parallelreaktionsüberwachung

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Nichtradioaktiver Test zur Messung der Polynukleotid-Phosphorylierung kleiner Nukleotidsubstrate

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Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

Optische Pinzette untersucht RNA-Protein-Interaktionen in der Translationsregulation

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Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

Zweifarbige Fluoreszenz-Kreuzkorrelationsspektroskopie zur Untersuchung der Protein-Protein-Interaktion und Proteindynamik in lebenden Zellen

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

Einzelmolekül-Bildgebung von EWS-FLI1-Kondensaten auf DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

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Ein robuster Einzelteilchen-Kryo-Elektronenmikroskopie-Verarbeitungs-Workflow (Kryo-EM) mit cryoSPARC, RELION und Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...