Name: quantitative immunofluorescence to measure global localized translation
Uploaded: 2017-08-22T13:00:00
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原稿の批判的読解ありがとう博士ラシッド Mazroui (ラヴァル大学、ケベック、カナダ)。その技術支援研究センター細胞イメージング ユニットに感謝いたします。M. é Huot はフォン ・ デ ・ ジュニア 1 研究学者 Recherche du ケベック州健康 (周波数 S)。この作品は、(許可番号機構、M. É とモップ 286437 健康研究のカナダの協会によって支えられました。Huot)。

1 です。 Puromycilation 条件の定量 注: この手法 MRC 5 セル接着プロセス 5 中にローカライズされた翻訳を評価する方法について説明します。Puromycilation は、任意のセルで行うことができます、処理条件が各セルライン ピューロマイシン濃度と目的の面で同一ではないので、使用する特定のセル行の puromycilation 条件を最適化することが重要です。インキュ?...

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	<li>Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+Translation+of+Single+mRNA+Molecules+In+Vivo.">Dynamics of Translation of Single mRNA Molecules In Vivo.</a> Cell. 165, 976-989 (2016).</li><li>Morisaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantification+of+single+RNA+translation+dynamics+in+living+cells.">Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells.</a> Science. 352, 1425-1429 (2016).</li><li>Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Analysis+of+mRNA,+Translation,+and+Protein+Localization:+Local+Translation+Is+a+Key+Regulator+of+Cell+Protrusions.">Global Analysis of mRNA, Translation, and Protein Localization: Local Translation Is a Key Regulator of Cell Protrusions.</a> Dev Cell. 35, 344-357 (2015).</li><li>Lacsina, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+translational+termination+products+are+rapidly+degraded+substrates+for+MHC+class+I+presentation.">Premature translational termination products are rapidly degraded substrates for MHC class I presentation.</a> PLoS One. 7, e51968 (2012).</li><li>Schneider-Poetsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+eukaryotic+translation+elongation+by+cycloheximide+and+lactimidomycin.">Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin.</a> Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).</li><li>Jacobs, J. P., Jones, C. M., Baille, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+a+human+diploid+cell+designated+MRC-5.">Characteristics of a human diploid cell designated MRC-5.</a> Nature. 227, 168-170 (1970).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale.">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> J Vis Exp. (87), (2014).</li></ol>

最近の技術の進歩は、並進運動の発現に関与するメカニズムの理解または神経の開発、薬剤応答、転移などの生物学的プロセスの特定の Mrna の抑圧の許可しています。ここで説明したコスト効果の高い方法により、翻訳イベント RNA 結合蛋白質が細胞接着、移行、侵略などの転移プロセスを調節する方法を研究する細胞で可視化することです。
De novoタンパク質翻?...

翻訳さまざまな細胞機能の調節は、新しいツールや mRNA の翻訳と規制タンパク質合成1,2 の細胞レベル下の局在を決定する方法を開発する多くの研究チームを求めています。、3,4。これらの最近の技術の進歩により翻訳アップレギュレーションや神経の開発、薬剤応答、5 転移などの生物学的プロセスの間に特定の Mrna の抑圧のメカニズムの理解の改善 ,6,7,8。ただし、これらのメソッドのほとんどは、高価なまたは危険な試薬およびほとんどの実験室にできない可能性があります特定の機器を必要。など、翻訳イベントの迅速な評価を可能にするコスト効果の高い方法は、具体的には、これらの潜在的な問題を回避するために開発されました。このメソッドは、特定の細胞プロセス中に発生する急性の並進変調を検出し、共焦点顕微鏡を用いた翻訳の局在化のためことができます。
ここで説明した方法は、拡散開始センター (SIC)5と呼ばれる細胞レベル下コンパートメント内にあるローカライズされた翻訳を監視する使用されました。Sic は、シード細胞初期接着複合体の上にローカライズされる一時的な構造です。Sic および接着複合体が異なるが、彼らの運命は密接に関連します。確かに、接着の初期段階で密着サイトへと焦点接着の複雑な成熟化に徐々 に消えてしまう Sic が知られています。分かった mRNA 翻訳 (例えばSam68、FMRP、および G3BP1) を具体的に制御する知られている RNA 結合蛋白質と Rna は、これらの濃縮した polyadenylated 構造5。ここで説明する方法を使用して、細胞接着の統合セルを SIC 関連 mRNA の翻訳ができるようにチェックポイントとして行為の規制にシードを紹介しました。翻訳の試金 (日没) の表面検出の適応バージョン ピューロマイシン定款に基づいて、このメソッドが考えられます。もともと非放射能標識アミノ酸を使用した世界のタンパク質合成速度を測定するために開発され、蛋白質 puromycilation はde novoタンパク質合成9を可視化する効率的な方法を提供しています。このメソッドは、ピューロマイシン、リボソーム10で時期尚早鎖終結経由で翻訳をブロックする抗生物質の固有の動作に依存します。確かに、ピューロマイシンはペプチド結合の形成によるペプチド鎖の伸長に混入の可能チロシル tRNA に構造的に似ています。しかし、成長しているペプチド鎖にピューロマイシン結合は、ピューロマイシン Trna の加水分解性エステル結合ではなく非加水分解性アミド結合を持っているので、次のアミノアシル tRNA が形成されてから新しいペプチド結合を防ぎます。したがって、ポリペプチド鎖の伸長にピューロマイシン定款の9,mRNA 積極的に翻訳された11,12 に対応する多数の切り捨てられた puromycilated ポリペプチドの早期リリースで結果します。.
このメソッドを使用すると、短時間未亡人内でアクティブな翻訳を評価することが可能だった (など5 分) 5 分期間の抗生物質と補われた細胞ピューロマイシンに対して指示される抗体を用いた細胞接着中細胞接着中に異なる時点で5を処理します。本法の精度は puromycilated 部位に対する特異性の高い抗体に依存しています。Puromycilated ポリペプチドの蛍光検出では、共焦点イメージング システムを使用して非常に正確に定量化することができますも新たに翻訳された mRNA の一般的な細胞レベル下の再パーティション化を提供します。
したがって、このメソッドは、神経肉芽6,13,14,などのプロセスに関与する並進運動の調節機構を調査する実験室の多数の関連するオプションを提供しています15、モルフォゲン mRNA の局在、および開発16,17時に翻訳。それはまた急速な生命現象、細胞遊走、接着、浸潤などまたは単に並進変更5,を誘導するかもしれない薬物治療を評価するために中にローカライズ済みまたは区分の翻訳の勉強にも適しています7,18. 全体的にみて、この方法は迅速かつ正確でコスト効果の高い方法でローカライズ済みまたは制御された翻訳イベントの可視化すること。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>wisent</td>
			<td>319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsine</td>
			<td>wisent</td>
			<td>325-043 EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12483020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puroycin antibody 12D10</td>
			<td>EMD millipore</td>
			<td>MABE343</td>
			<td>western blot dilution 1:25000 
			Immunofluoresence dilution 1:10000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>cell signaling technology</td>
			<td>7076</td>
			<td>western blot dilution 1:8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Lightning Plus-ECL</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEL104001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG (H+L), F(ab&#39;)2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate)</td>
			<td>cell signaling technology</td>
			<td>4408</td>
			<td>immunofluoresecence dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF568 Phalloidin</td>
			<td>biotium</td>
			<td>00044</td>
			<td>immunofluoresecence dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexmide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1988-1G</td>
			<td>50&#181;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>final concentration 1&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>bio-Basic</td>
			<td>PJ593</td>
			<td>2.5&#181;g/ml to 10&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi &#181;-Dish 35 mm, high, ibiTreat</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC-5 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huh-7 cells</td>
			<td colspan="2">from Dr. Mazroui (Universit&#233; Laval)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fv1000</td>
			<td>olympus</td>
			<td></td>
			<td>confocal imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://fiji.sc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate BuffeRed Saline)</td>
			<td>bio-Basic</td>
			<td>PD8117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 37% Solution</td>
			<td>bio-Basic</td>
			<td>C5300-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>bio-Basic</td>
			<td>TB0198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP9702-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative immunofluorescence to measure global localized translation

MRNA の翻訳を規定しているメカニズムは、複数の疾患だけでなく生殖細胞形成、細胞分化と器官形成などの様々 な生物学的過程に関与しています。多数の出版物は説得力のある特定のメカニズムがしっかりと mRNA の翻訳を調節する示されています。蛋白質の表現の翻訳による規制の高められた興味は調査し次のde novoタンパク質合成cellulo の新規手法の開発につながっています。ただし、これらのメソッドのほとんどは複雑で、高価なそれらを作ると、よく学ぶことができます mRNA ターゲット数の制限します。この原稿は、のみ基本的な試薬とを測定し、様々 な条件の下で任意のセルの行で発生する mRNA の翻訳の変化を可視化する共焦点蛍光イメージング システム必要とする手法を提案します。このメソッドはさまざまな生物の中に短い期間のde novo翻訳を可視化する可能性を提供しています、時間の短い期間で付着性のセルの細胞内の構造にローカライズした訳語を表示する最近使用されました。プロセスまたは特定の刺激への応答の橋渡し活動の変更を検証します。

ピューロマイシン定款を使用して翻訳イベントを正確に観察するには、それぞれは異なるピューロマイシン定款動態 (図 1)9,11 を示していますので、各セルラインの最適条件を決めることが大事です。 ,12,18。したがって、ピューロマイシン定款を検?...

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Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

本稿では、可視化し、細胞内コンパートメントのローカライズされた翻訳イベントを定量化する方法について説明します。本稿で提案する手法は基本的な共焦点イメージング システムと試薬が必要です、迅速かつ費用対効果。

グローバルを測定する定量的蛍光ローカライズ翻訳

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

リボソームのプロファイリングによる出芽酵母における翻訳のゲノムの定量化

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

哺乳類の Mrna の翻訳開始複合体形成の Toeprinting 分析

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

哺乳類細胞内の細胞内亜鉛プールを測定するための原子吸光度分光法

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

タンパク質-脂質相互作用を測定するためのマイクロスケール熱泳動の使用

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

並列反応モニタリングによるユビキチン連鎖解析

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

小ヌクレオチド基質のポリヌクレオチドリン酸化を測定する非放射性アッセイ

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

翻訳調節におけるRNA-タンパク質相互作用を研究する光ピンセット

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

生細胞におけるタンパク質相互作用とタンパク質ダイナミクスを研究するための二色蛍光相互相関分光法

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

DNA上に集合したEWS-FLI1凝縮体の1分子イメージング

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

クライオスパーク、リオン、サイピオンによる堅牢な単一粒子クライオ電子顕微鏡(クライオEM)処理ワークフロー

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...