Name: quantitative immunofluorescence to measure global localized translation
Uploaded: 2017-08-22T13:00:00
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원고의 중요 한 읽기에 감사 박사 Rachid Mazroui (라 발 대학교, 퀘벡, 캐나다) 하 고. 우리는 그들의 기술 지원에 대 한 연구 센터의 세포 이미징 단위 감사. M. É. Huot는 Fonds 드의 주니어 1 연구 학자 검색 뒤 퀘벡-건강 (FRQ-S). 이 작품은 건강 연구의 캐나다 학회 (번호 CIHR, 걸 레-286437 M. É를 부여에 의해 지원 되었다 합니다. Huot)입니다.

1. 결정의 Puromycilation 조건 참고:이 기술은 MRC 5 세포 접착 과정 5 동안 지역화 된 번역을 평가 하는 데 사용 하는 방법에 설명 합니다. Puromycilation 셀에 행 해질 수 있다, 그것은 치료 조건 puromycin 농도 및 원하는 각 셀 라인에 대 한 동일 하지 않기 때문에 사용 될 특정 셀 라인에 대 한 puromycilation 조건을 최적화 하는 것이 중요 보육 시간입니다. 이러한 조건이 ...

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	<li>Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+Translation+of+Single+mRNA+Molecules+In+Vivo.">Dynamics of Translation of Single mRNA Molecules In Vivo.</a> Cell. 165, 976-989 (2016).</li><li>Morisaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantification+of+single+RNA+translation+dynamics+in+living+cells.">Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells.</a> Science. 352, 1425-1429 (2016).</li><li>Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+cells+move+messages:+the+biological+functions+of+mRNA+localization.">Why cells move messages: the biological functions of mRNA localization.</a> Semin Cell Dev Biol. 18, 171-177 (2007).</li><li>Ephrussi, A., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing:+the+bicoid+morphogen+gradient+matures.">Seeing is believing: the bicoid morphogen gradient matures.</a> Cell. 116, 143-152 (2004).</li><li>Mardakheh, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Analysis+of+mRNA,+Translation,+and+Protein+Localization:+Local+Translation+Is+a+Key+Regulator+of+Cell+Protrusions.">Global Analysis of mRNA, Translation, and Protein Localization: Local Translation Is a Key Regulator of Cell Protrusions.</a> Dev Cell. 35, 344-357 (2015).</li><li>Lacsina, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+translational+termination+products+are+rapidly+degraded+substrates+for+MHC+class+I+presentation.">Premature translational termination products are rapidly degraded substrates for MHC class I presentation.</a> PLoS One. 7, e51968 (2012).</li><li>Schneider-Poetsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+eukaryotic+translation+elongation+by+cycloheximide+and+lactimidomycin.">Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin.</a> Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).</li><li>Jacobs, J. P., Jones, C. M., Baille, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+a+human+diploid+cell+designated+MRC-5.">Characteristics of a human diploid cell designated MRC-5.</a> Nature. 227, 168-170 (1970).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale.">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> J Vis Exp. (87), (2014).</li></ol>

최근의 기술 진보는 변환 upregulation에 관련 된 메커니즘의 이해 또는 신경 개발, 약물 반응 및 전이 등의 생물학적 프로세스에서 특정 한 mRNAs의 억압에 대 한 수 있다. 여기에 설명 된 비용 효율적인 방법론 번역 이벤트를 RNA 의무적인 단백질 세포 접착, 마이그레이션, 및 침략 등의 전이성 프로세스를 규제 하는 방법을 공부 하는 셀에 구상 될 수 있습니다.
수많은 방법은 de ...

다른 세포질 기능에 의해 번역의 규칙 새로운 도구와 mRNA 번역 및 규제 단백질 합성1,2 의 subcellular 지 방화를 결정 하는 방법을 개발 하기 위해 많은 연구 팀을 묻는 메시지가 있다 ,34. 이러한 최근의 기술 진보에 대 한 번역 upregulation 또는 신경 개발, 약물 반응 및 전이5 같은 생물 학적 과정 동안 특정 mRNAs의 억압 메커니즘의 향상 된 이해 허용 ,6,,78. 그러나, 이러한 방법의 대부분 비싼 또는 유해 시 약 및 특정 장비를 대부분 실험실을 사용할 수 없는 필요 합니다. 따라서, 번역 이벤트의 급속 한 평가 대 한 허용 하는 비용 효율적인 방법은 구체적으로 이러한 잠재적인 문제를 회피 하 개발 되었다. 이 방법은 특정 세포 프로세스 동안 발생 하는 급성 변환 변조 감지 및 또한 번역 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 지역화에 대 한.
여기에 설명 된 방법은 확산 개시 센터 (SIC)5라는 subcellular 구획 내에서 지역화 된 번역을 모니터링 하는 데 사용 되었다. SICs 과도 구조 초기 접착 단지 위에 지역화 된 시드 셀에 있습니다. SICs 및 접착 단지 가지는, 비록 그들의 운명은 밀접 하 게 연결 됩니다. 실제로, SICs 접착의 초기 단계 동안 접착 사이트에 초점 접착 복잡 한 성숙에 점차적으로 사라질 알려져 있습니다. 우리는 발견 특히 mRNA 번역 (예를 들어, Sam68, FMRP, 및 G3BP1)을 제어 하려면 알려진 RNA 의무적인 단백질 및 RNAs 이러한 내에서 농축 된 polyadenylated 구조5. 여기 설명 된 방법을 사용 하 여, 우리는 SIC 관련 mRNA 번역 검사점 수 역할의 규칙 세포 세포 접착을 통합 시드 보였다. Puromycin 설립에 따라이 메서드는 적응된 버전의 번역 분석 결과 (일몰) 표면 감지의 간주 될 수 있습니다. 원래는 비 방사성 레이블이 아미노산을 사용 하 여 글로벌 단백질 합성 속도 측정을 개발, 단백질 puromycilation de novo 단백질 합성9를 시각화 하는 효율적인 방법을 제공 합니다. 이 방법은 puromycin, 번역 리보솜10조 체인 종료를 차단 하는 항생제의 고유 동작에 의존 합니다. 실제로, puromycin tyrosyl-tRNA, 펩 티 드 사슬 펩 티 드 결합의 형성을 통해 elongating으로 수 있는 구조적으로 유사한 이다. 그러나, 성장 펩 티 드 사슬에 puromycin 바인딩 puromycin tRNAs에서 발견 hydrolysable 에스테 르 결합 대신 비 hydrolysable 아 미드 유대를가지고 있기 때문에 다음 aminoacyl-tRNA와 함께 형성 되 고에서 새로운 펩 티 드 결합을 방지 합니다. 따라서, polypeptides를 elongating에 puromycin의 설립 적극적으로 번역 mRNA9,11,12에 해당 하는 수많은 잘린된 puromycilated polypeptides의 조기 출시에 결과 .
짧은 시간과 부 내에서 활성 번역 평가 가능 했다이 메서드를 사용 하 여 (예를 들어, 5 분) 동안 puromycin 항생제 5 분 동안 보충 된 셀에 대 한 지시는 특정 항 체를 사용 하 여 세포 접착 세포 접착 하는 동안 다른 시간 지점에서5를 처리 합니다. 이 분석 결과의 정밀도 높은 특정 항 체에 대하여 puromycilated moiety 지시에 의존 합니다. Puromycilated polypeptide의 immunofluorescent 감지 또한 confocal 이미징 시스템을 사용 하 여 좋은 정확성과 계량 수 새로 번역 된 mRNA의 일반적인 subcellular 재분할을 제공 합니다.
이 방법은 신경 알갱이 만듦6,,1314, 등의 프로세스에 관련 된 변환 규제 메커니즘을 공부 하는 실험실의 많은 수에 대 한 관련 옵션을 제공 하는 15, morphogen mRNA 지역화, 그리고 개발16,17동안 번역. 그것은 또한 급속 한 생물 학적 이벤트, 셀 이동, 접착, 또는 침략, 또는 단순히 변환 변경5, 를 일으킬 수 있는 약물 치료를 평가 하기 위해 동안 지역화 된 또는 compartmentalized 번역을 공부 하는 데 적합 7 , 18. 전반적으로,이 메서드를 사용 하면 지역화 된 또는 제어 번역 이벤트의 시각화를 위한, 정확, 신속 하 고 비용 효율적인 방식으로.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>wisent</td>
			<td>319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsine</td>
			<td>wisent</td>
			<td>325-043 EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12483020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puroycin antibody 12D10</td>
			<td>EMD millipore</td>
			<td>MABE343</td>
			<td>western blot dilution 1:25000 
			Immunofluoresence dilution 1:10000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>cell signaling technology</td>
			<td>7076</td>
			<td>western blot dilution 1:8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Lightning Plus-ECL</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEL104001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG (H+L), F(ab&#39;)2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate)</td>
			<td>cell signaling technology</td>
			<td>4408</td>
			<td>immunofluoresecence dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF568 Phalloidin</td>
			<td>biotium</td>
			<td>00044</td>
			<td>immunofluoresecence dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexmide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1988-1G</td>
			<td>50&#181;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>final concentration 1&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>bio-Basic</td>
			<td>PJ593</td>
			<td>2.5&#181;g/ml to 10&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi &#181;-Dish 35 mm, high, ibiTreat</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC-5 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huh-7 cells</td>
			<td colspan="2">from Dr. Mazroui (Universit&#233; Laval)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fv1000</td>
			<td>olympus</td>
			<td></td>
			<td>confocal imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://fiji.sc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate BuffeRed Saline)</td>
			<td>bio-Basic</td>
			<td>PD8117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 37% Solution</td>
			<td>bio-Basic</td>
			<td>C5300-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>bio-Basic</td>
			<td>TB0198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP9702-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative immunofluorescence to measure global localized translation

MRNA 번역 조절 메커니즘 여러 질병에서 뿐만 아니라 세균 선 개발, 세포 분화, organogenesis, 등 다양 한 생물학 과정에서 포함 된다. 다 수의 출판물에서는 특정 메커니즘 단단히 mRNA 번역 규제 설득 나타났습니다. 단백질 식의 번역 유도 규칙에 대 한 관심 증가 연구 하 고 de novo 단백질 합성에서 cellulo에따라 새로운 방법의 개발을 주도하 고 있다. 그러나, 이러한 방법의 대부분은 복잡 한, 그들이 비용이 많이 드는 고 공부 될 수 있다 mRNA 대상의 수를 제한 하는 자주. 이 원고만 기본적인 시 약 및 측정 하 고 다양 한 조건에서 어떤 셀 라인에서 발생 하는 mRNA 번역에 변화를 시각화 confocal 형광 이미징 시스템을 필요로 하는 방법을 제안 합니다. 이 메서드는 최근 시간, 따라서 생물 다양 한 동안 짧은 기간에 대 한 드 노 보 번역 시각화의 가능성을 제공 하는 짧은 기간 동안 부착 셀의 subcellular 구조에서 지역화 된 번역을 표시 하는 데 사용 됩니다. 프로세스 또는 특정 자극에 응답에서 변환 활동에 변화를 확인.

관찰 하기 위해 정확 하 게 번역 이벤트 puromycin 관을 사용 하 여, 그것은 각각 다른 puromycin 법인 활동 (그림 1)9,11 보여주기 때문에 각 셀 라인에 대 한 최적의 조건을 결정 하는 중요 한 ,,1218. 따라서, puromycin 설립의 유효성을 검사, 그것은 puromycin의 농도 ...

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Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

이 원고 시각화 및 subcellular 구획에서 지역화 된 번역 이벤트를 계량 하는 방법을 설명 합니다. 이 원고에 제안 접근 기본 confocal 이미징 시스템 및 시 약을 필요로 하 고 신속 하 고 비용 효율적인.

정량적 면역 형광 측정 글로벌 현지화 번역

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

리보솜을 프로 파일링 하 여 신진 효 모에 번역의 게놈 넓은 정량화

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

연구

생화학

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

번역 개시 포유류 mRNAs에 복잡 한 대형의 Toeprinting 분석

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

포유류 세포에서 세포내 아연 풀을 측정 하는 원자 흡 광도 분광학

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

단백질-지질 상호작용을 측정하기 위한 마이크로스케일 열영동 사용

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

병렬 반응 모니터링에 의한 유비퀴틴 연쇄 분석

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

작은 뉴클레오티드 기판의 폴리뉴클레오티드 인산화를 측정하는 비방사성 분석

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Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

번역 조절에서 RNA 단백질 상호 작용을 연구하는 광학 핀셋

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

살아있는 세포에서 단백질 단백질 상호 작용 및 단백질 역학을 연구하기 위한 이중 색 형광 교차 상관 분광법

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

DNA에 조립되는 EWS-FLI1 응축수의 단일 분자 이미징

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

cryoSPARC, RELION 및 Scipion을 사용한 견고한 단일 입자 Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) 처리 워크플로우

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...