Name: quantitative immunofluorescence to measure global localized translation
Uploaded: 2017-08-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation at JoVE.com

Мы благодарим д-р Рашид Mazroui (Университет Лаваля, Квебек, Канада) для критических чтении рукописи. Мы благодарим Imaging группа клеток научно-исследовательского центра для их технической помощи. М.-É. Хуот является младший 1 исследования ученый Fonds de Recherche дю Квебек-здоровью (FRQ-S). Эта работа была поддержана канадской институтов медицинских исследований (номер КНИИЗ, СС-286437 к. м.-É гранта. Хуот).

1. Определение Puromycilation условия Примечание: Этот метод описывается метод, используемый для оценки локализованный перевод во время процесса адгезии MRC-5 клеток 5. Как puromycilation может быть сделано в любой ячейке, важно оптимизировать puromycilation условий для конкретны?...

<ol>
	<li>Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+Translation+of+Single+mRNA+Molecules+In+Vivo.">Dynamics of Translation of Single mRNA Molecules In Vivo.</a> Cell. 165, 976-989 (2016).</li><li>Morisaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantification+of+single+RNA+translation+dynamics+in+living+cells.">Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells.</a> Science. 352, 1425-1429 (2016).</li><li>Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+dynamics+of+single+mRNAs+in+live+cells+and+neurons.">Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons.</a> Science. 352, 1430-1435 (2016).</li><li>Halstead, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRICK:+A+Single-Molecule+Method+for+Imaging+the+First+Round+of+Translation+in+Living+Cells+and+Animals.">TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals.</a> Methods Enzymol. 572, 123-157 (2016).</li><li>Bergeman, J., Caillier, A., Houle, F., Gagne, L. M., Huot, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+translation+regulates+cell+adhesion+and+transendothelial+migration.">Localized translation regulates cell adhesion and transendothelial migration.</a> J Cell Sci. 129, 4105-4117 (2016).</li><li>El Fatimy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+Fragile+X+Mental+Retardation+Protein+in+a+Highly+Ordered+Neuronal+RiboNucleoParticles+Population:+A+Link+between+Stalled+Polyribosomes+and+RNA+Granules.">Tracking the Fragile X Mental Retardation Protein in a Highly Ordered Neuronal RiboNucleoParticles Population: A Link between Stalled Polyribosomes and RNA Granules.</a> PLoS Genet. 12, e1006192 (2016).</li><li>Adjibade, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorafenib,+a+multikinase+inhibitor,+induces+formation+of+stress+granules+in+hepatocarcinoma+cells.">Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells.</a> Oncotarget. 6, 43927-43943 (2015).</li><li>Paronetto, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sam68+regulates+translation+of+target+mRNAs+in+male+germ+cells,+necessary+for+mouse+spermatogenesis.">Sam68 regulates translation of target mRNAs in male germ cells, necessary for mouse spermatogenesis.</a> J Cell Biol. 185, 235-249 (2009).</li><li>Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. S. U. n. S. E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUnSET,+a+nonradioactive+method+to+monitor+protein+synthesis.">SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis.</a> Nat Methods. 6, 275-277 (2009).</li><li>Azzam, M. E., Algranati, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+puromycin+action:+fate+of+ribosomes+after+release+of+nascent+protein+chains+from+polysomes.">Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 70, 3866-3869 (1973).</li><li>Goodman, C. A., Hornberger, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein+synthesis+with+SUnSET:+a+valid+alternative+to+traditional+techniques.">Measuring protein synthesis with SUnSET: a valid alternative to traditional techniques.</a> Exerc Sport Sci Rev. 41, 107-115 (2013).</li><li>David, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+translation+visualized+by+ribosome-bound+nascent+chain+puromycylation.">Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation.</a> J Cell Biol. 197, 45-57 (2012).</li><li>Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+muscular+atrophy:+the+role+of+SMN+in+axonal+mRNA+regulation.">Spinal muscular atrophy: the role of SMN in axonal mRNA regulation.</a> Brain Res. 1462, 81-92 (2012).</li><li>Costa-Mattioli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+of+hippocampal+synaptic+plasticity+and+memory+by+the+eIF2alpha+kinase+GCN2.">Translational control of hippocampal synaptic plasticity and memory by the eIF2alpha kinase GCN2.</a> Nature. 436, 1166-1173 (2005).</li><li>Costa-Mattioli, M., Sossin, W. S., Klann, E., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+of+long-lasting+synaptic+plasticity+and+memory.">Translational control of long-lasting synaptic plasticity and memory.</a> Neuron. 61, 10-26 (2009).</li><li>Du, T. G., Schmid, M., Jansen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+cells+move+messages:+the+biological+functions+of+mRNA+localization.">Why cells move messages: the biological functions of mRNA localization.</a> Semin Cell Dev Biol. 18, 171-177 (2007).</li><li>Ephrussi, A., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing:+the+bicoid+morphogen+gradient+matures.">Seeing is believing: the bicoid morphogen gradient matures.</a> Cell. 116, 143-152 (2004).</li><li>Mardakheh, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Analysis+of+mRNA,+Translation,+and+Protein+Localization:+Local+Translation+Is+a+Key+Regulator+of+Cell+Protrusions.">Global Analysis of mRNA, Translation, and Protein Localization: Local Translation Is a Key Regulator of Cell Protrusions.</a> Dev Cell. 35, 344-357 (2015).</li><li>Lacsina, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+translational+termination+products+are+rapidly+degraded+substrates+for+MHC+class+I+presentation.">Premature translational termination products are rapidly degraded substrates for MHC class I presentation.</a> PLoS One. 7, e51968 (2012).</li><li>Schneider-Poetsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+eukaryotic+translation+elongation+by+cycloheximide+and+lactimidomycin.">Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin.</a> Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).</li><li>Jacobs, J. P., Jones, C. M., Baille, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+a+human+diploid+cell+designated+MRC-5.">Characteristics of a human diploid cell designated MRC-5.</a> Nature. 227, 168-170 (1970).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale.">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> J Vis Exp. (87), (2014).</li></ol>

Последние технологические достижения позволили лучше понять механизмы, участвующие в трансляционной upregulation или репрессии в отношении конкретных mRNAs в биологических процессах, например развития нервной системы, ответ наркотиков и метастаз. Экономически эффективные методологии, опис?...

Правила перевода различных клеточных функций побудило многие исследовательские группы для разработки новых инструментов и методов для определения субцеллюлярные локализации перевод мРНК и регулируемых белка синтез1,2 ,3,4. Эти последние технологические достижения позволяют добиться более глубокого понимания механизмов, связанных с переводом upregulation или репрессий конкретные мРНК в биологических процессах, например развития нервной системы, ответ наркотиков и метастазов5 ,6,,78. Однако большинство из этих методов требуют дорогих или опасных реагентов и специального оборудования, которые не могут быть доступны для большинства лабораторий. Таким образом был разработан эффективный метод для быстрой оценки перевод событий специально обойти эти потенциальные проблемы. Этот метод обнаруживает острый трансляционная модуляций, которые происходят во время конкретных клеточных процессов, а также позволяет для локализации перевода с помощью конфокальной микроскопии.
Описанные здесь методы были использованы для мониторинга локализованный перевод в течение субцеллюлярные отсеков под названием распространяя возбуждение центров (SIC)5. Шиц являются переходных структур, обнаруженных в сеяный клеток, которые локализуются на вершине зарождающейся адгезии комплексов. Хотя Шиц и адгезии комплексы отличаются друг от друга, их судьбы тесно связаны. Действительно SICs известны постепенно исчезают после фокуса адгезии комплекс созревания в сайт адгезии на начальном этапе адгезии. Мы обнаружили, что RNA-связывая протеинов, известный специально контролировать мРНК перевода (например, Sam68, FMRP и G3BP1) и polyadenylated, РНК обогатились в рамках этих структур5. С помощью методов, описанных здесь, мы показали, что регулирование SIC-связанные мРНК, перевод действует как КПП позволяет посеян клетки для консолидации клеточной адгезии. Этот метод, основанный на puromycin включения, можно считать адаптированную версию поверхности зондирования перевод пробирного (закат). Первоначально разработанный для измерения скорости синтеза глобального белка с помощью радиоактивно обозначенные аминокислоты, протеин puromycilation предлагает эффективный способ визуализации белка de novo синтеза9. Этот метод полагается на внутренние поведение puromycin, антибиотик, который блокирует перевод через прекращение преждевременной цепи в рибосома10. Действительно puromycin структурно аналогичен тирозил тРНК, который позволяет для включения в удлинения пептидные цепи через образование пептидных связей. Однако puromycin привязки к растущей цепи пептида предотвращает формируется с следующей аминоацил тРНК, так как puromycin не hydrolysable Амид облигаций вместо hydrolysable Эстер Бонд в tRNAs нового Бонда пептид. Таким образом включение puromycin в удлинения полипептиды приводит к преждевременной выпуска многочисленных усеченная puromycilated полипептиды, соответствующий активно переводится мРНК9,11,12 .
С помощью этого метода, можно было оценить активный перевод в течение короткого времени вдова (например, 5 минут) во время клеточной адгезии с использованием специфического антитела, направленные против puromycin на клетки, которые были дополнены антибиотика для периодов 5-мин в точках в разное время в ходе процесса адгезии клеток5. Точность этот assay полагается на весьма специфические антитела, направленные против puromycilated группу. Immunofluorescent обнаружения puromycilated полипептида обеспечивает общий субцеллюлярные передел недавно переведенные мРНК, которые также могут быть количественно с большой точностью с помощью конфокальной систем тепловидения.
Следовательно этот метод предлагает соответствующую опцию для большого числа лабораторий, изучая трансляционная регулирующих механизмов, участвующих в процессах таких нейронов грануляции6,13,14, 15, morphogen мРНК локализации и перевода во время развития16,17. Это также хорошо подходит для изучения локализованных или разобщенным перевод во время быстрого биологических событий, например миграции клеток, адгезии или вторжения, или просто оценить медикаментозного лечения, которые могли бы побудить поступательные изменения5, 7 , 18. в целом, этот метод позволяет для визуализации событий локализованных или контролируемых перевод в быстрый, точный и экономически эффективным способом.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>wisent</td>
			<td>319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsine</td>
			<td>wisent</td>
			<td>325-043 EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12483020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puroycin antibody 12D10</td>
			<td>EMD millipore</td>
			<td>MABE343</td>
			<td>western blot dilution 1:25000 
			Immunofluoresence dilution 1:10000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>cell signaling technology</td>
			<td>7076</td>
			<td>western blot dilution 1:8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Lightning Plus-ECL</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEL104001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG (H+L), F(ab&#39;)2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate)</td>
			<td>cell signaling technology</td>
			<td>4408</td>
			<td>immunofluoresecence dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF568 Phalloidin</td>
			<td>biotium</td>
			<td>00044</td>
			<td>immunofluoresecence dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexmide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1988-1G</td>
			<td>50&#181;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>final concentration 1&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>bio-Basic</td>
			<td>PJ593</td>
			<td>2.5&#181;g/ml to 10&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi &#181;-Dish 35 mm, high, ibiTreat</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC-5 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huh-7 cells</td>
			<td colspan="2">from Dr. Mazroui (Universit&#233; Laval)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fv1000</td>
			<td>olympus</td>
			<td></td>
			<td>confocal imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://fiji.sc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate BuffeRed Saline)</td>
			<td>bio-Basic</td>
			<td>PD8117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 37% Solution</td>
			<td>bio-Basic</td>
			<td>C5300-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>bio-Basic</td>
			<td>TB0198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP9702-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative immunofluorescence to measure global localized translation

Механизмы, регулирующие перевод мРНК участвуют в различных биологических процессах, например зародышевой линии развития, дифференцировки клеток и органогенез, а также в нескольких заболеваний. Многочисленные публикации убедительно показали, что конкретные механизмы плотно регулировать перевод мРНК. Повышенный интерес в перевод индуцированной регуляции экспрессии белков привело к разработке новых методов изучать и следовать de novo белка синтеза в cellulo. Однако большинство этих методов являются сложными, что делает их дорогостоящей и зачастую ограничивает количество мРНК-мишеней, которые могут быть изучены. Эта рукопись предлагает метод, который требует только основные реагенты и конфокальный флуоресценции тепловизионные системы измерения и визуализировать изменения в переводе мРНК, которые происходят в любой ячейке линии при различных условиях. Этот метод был недавно используется локализованный перевод в внутриклеточных структур адэрентных клеток за короткий период времени, таким образом предлагая возможность визуализации de novo перевода короткий период во время различных биологических процессы или проверка изменений переводческая деятельность в ответ на конкретные стимулы.

Точно соблюдать перевод событий с помощью puromycin включения, важно, чтобы определить оптимальные условия для каждой ячейки строки, потому что каждый показывает различные puromycin включения кинетика (рис. 1)9,11 ,1...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation at JoVE.com

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

Эта рукопись описывает метод для визуализации и количественно локализованное события субцеллюлярные отсеков. Подход, предложенный в этой рукописи требует базовой конфокальный тепловизионные системы и реагенты и быстрое и экономически эффективным.

Количественные иммунофлюоресценции для измерения глобального локализованный перевод

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Геном широкий количественная оценка перевода в многообещающий дрожжей рибосома профилирования

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Toeprinting анализ перевода инициации комплекс формирования на Mammalian mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Атомная спектроскопия поглощения для измерения внутриклеточного цинка бассейны в клетках млекопитающих

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Использование микромасштабного термофореза для измерения белково-липидных взаимодействий

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

Убиквитин Цепной Анализ параллельным мониторингом реакции

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Нерадиоактивный анализ для измерения полинуклеотида фосфорилирования малых нуклеотидных субстратов

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

Оптический пинцет для изучения РНК-белковых взаимодействий в регуляции трансляции

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

Двухцветная флуоресцентная кросс-корреляционная спектроскопия для изучения белково-белкового взаимодействия и динамики белка в живых клетках

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

Одномолекулярная визуализация конденсатов EWS-FLI1, собранных на ДНК

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Надежный рабочий процесс обработки криоэлектронной микроскопии с одной частицей (крио-ЭМ) с криоСПАРК, RELION и Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...