Name: procedure and key optimization strategies for an automated capillary electrophoretic-based immunoassay method
Uploaded: 2017-09-10T14:00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Keith Tarpley os EPA kontor forskning og udvikling-Research Triangle Park (AEI-RTP) grafik og medier team for udvikling, tape, og redigering af instruktions-video. Vi vil også gerne takke Deborah Pritchett fra ProteinSimple for nyttige samtaler om optimering af vores data. JM Guynn blev støttet af Oak Ridge Institut for videnskab og forskning/deltagelse uddannelsesprogram på den US Environmental Protection Agency.

Bemærk: sikre, at alle reagenser og prøver er udarbejdet ifølge producenten &#39; s protokol, skitseret nedenfor. Venligst bære ordentlig personlige værnemidler under denne procedure, som omfatter nitrilhandsker, laboratoriekittel, lukket-tåede sko og beskyttelsesbriller. En tabel af bestemte materialer, reagenser og udstyr, der kræves leveres separat. Total protein koncentrationen af prøver skal bestemmes på forhånd ved hjælp af etablerede metoder, der er kompatible med den lysate buffer, der bruges, såsom Bradford assay 11.
 1. forberedelse af prøver og reagenser fra den standard pack som leveret af fabrikanten <ol><li>at forberede 400 mM brugsopløsning af dithiothreitol (DTT), tilføje 40 µL deioniseret vand til den klare rør, der indeholder de leveret materiel fra producenten. Det er vigtigt at undgå at indføre bobler til løsningen ved at blande løsningen med langsom og blid pipettering.</li>
	<li>Tilføje 20 µL 10 X prøvebuffer og 20 µL af den forberedte 400 mM DTT løsning til det lyserøde rør, der indeholder fluorescerende 5 X master mix (Se Tabel of Materials). 
	Bemærk: Master Mix (MM) er forseglet af producent med en folie dækning og skal blive gennemboret af en pipette tip. Blandes forsigtigt ved langsom pipettering at undgå stænk DTT i pipetten.</li>
	<li>Næste, Tilføj 16 µL deioniseret vand, 2 µL af leveret 10 X prøvebuffer og 2 µL af rede 400 mM DTT løsning til det hvide biotinylated stige rør leveret af fabrikanten. Bland forsigtigt og overføres til en 0,6 mL tube til denaturering.</li>
	<li>Forbered 0,1 x prøvebuffer ved at fortynde de medfølgende 10 X løsning 1: 100 med vand. Forberede nok 0,1 x prøvebuffer at udvande alle prøver.</li>
	<li>Beregnes mængden af 0,1 x prøvebuffer, der er føjet til en prøve, som vil afhænge af den endelige ønskede koncentration af total protein. Bland 1 del 5 x fluorescerende MM med 4 dele fortyndet prøve for at opnå den ønskede endelige proteinkoncentration.
	<ol><li>Beregn diskenheder som følger: (i) bind 5 x fluorescerende MM = (ønskede endelige proteinkoncentration) / 5; (ii) mængden af protein lager = (ønskede endelige proteinkoncentration x samlede behov) / Protein lagerfører koncentration; (iii) volumen 0,1 x prøvebuffer = samlede volumen - 5 x MM volumen - Protein lager volumen.</li>
	</ol></li></ol> 2. Denaturering af prøver og stigen <ol><li>sted beredt prøver og biotinylated stigen i en 95 ° C varme blok for 5 min. Vortex rør umiddelbart efter inkubation, udføre en spin for ~ 5 s i en bordplade centrifuge, og sted på ice. 
	Bemærk: Nogle proteiner kan kræve blidere denaturering betingelser (fx, 70 o C i 10 min.) at forhindre protein sammenlægning og forbedre migration i matrixen kapillær. Overveje denne mulighed, hvis der er tunge udtværing på de højere Molekylær vægt (Se video f.eks).</li>
</ol> 3. Forberedelse af antistoffer <ol><li>som bestemt ved optimering (Se Repræsentant resultater og video), forberede den ønskede dilution(s) af primære antistof (f.eks. 1:50, 1: 100) i den medfølgende antistof Fortynder 2. 
	Bemærk: Antistoffer er generelt bruges ved højere koncentrationer for kapillær-baseret immunassay end for traditionelle western blotting. Den medfølgende sekundær antistof er klar til brug uden fortynding.</li>
</ol> 4. Forberedelse af Luminol-S og peroxid <ol><li>forberede en 1:1 blanding af luminol-S og peroxid.</li>
	<li>Vortex at blande og gemme på ice. 
	Bemærk: Det er vigtigt, at denne blanding er forberedt friske for hver eksperimentelle assay. 250ul samlede mix er nødvendig for at køre en fuld plade.</li>
</ol> 5. Forberedelse af assay plade <ol><li>som vist i figur 1, indlæses de prøver og reagenser forberedt ovenfor i assay pladen. Se detaljerede instruktioner nedenfor for hver række. For at minimere fordampning fra brøndene, sikre at pladen låget er erstattet mellem reagens tilføjelser.</li>
	<li>i række A, afpipetteres 5 µL af Biotinylated stige til godt A1. For de resterende træk, med pipette overfoeres udarbejdet prøver (5 µL) i brønd A2-A25. 
	Bemærk: Det er bydende nødvendigt, at A1 indeholder godt altid stigen, som den første kapillær i patronen er optimeret til at køre denne standard.</li>
	<li>i række B, afpipetteres 10 µL antistof fortyndingsmiddel 2 i hver brønd (B1-B25).</li>
	<li>i række C, afpipetteres 10 µL antistof fortyndingsmiddel 2 i godt C1. I den resterende række C brønde, afpipetteres 10 µL af primære antistof (wells C2-C25).</li>
	<li>i række D, afpipetteres 10 µL af Streptavidin-HRP i godt D1. I den resterende række D brønde, afpipetteres 10 µL af sekundær antistof (wells D2-D25).</li>
	<li>i række E, afpipetteres 10 µL af den frisk tilberedte luminol-peroxid mix i hver brønd (E1-E25).</li>
	<li>Endelig tilføje 500 µL wash buffer pr. rum til hver af top 3 rækkerne af buffer wells. 
	Bemærk: Det er vigtigt at minimere boble dannelsen af pipettering blidt og ikke udvise den endelige mængden fra spidsen som bobler kan forstyrre kapillær lastning og køre.</li>
	<li>Når alle brønde er indlæst, centrifugeres plade på ~ 1000 x g i 5 min ved stuetemperatur til at fjerne boblerne og sikre, at væsken er i bunden af brøndene. Pop alle synlige bobler med en lille pipette tip eller ren nål (f.eks., 25 gauge steril &#34; rep top &#34; nål).</li>
</ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig1.jpg" /> fig. 1 . Pipettering skabelon for assay plade. Farvekodning repræsenterer korrekt reagenser og prøver (op til 24 i alt) tilføjes assay plade. Tilføje biotinylated stige til godt A1 (orange), forberedt prøver fra brønde A2 indtil A25 (lyseblå), antistof fortyndingsmiddel 2 brønde B1-B25 og C1 (lysegrøn), primære antistof brønde C2 op til C25 (blå), streptavidin-HRP til godt D1 (mørk lyserød), sekundær antistof mod brønde D2 op til D25 (mørk grøn), og luminol-peroxid mix brønde E1 op til E25 (lilla). Vaskebuffer er føjet til de første tre rækker i større midt pladen wells (mørkeblå). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig1large.jpg" target="_blank"> venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
 6. Start kapillær immunassay instrument <ol><li>at sikre, at instrumentet og den tilhørende computer er tændt. Ingen varme op tid er nødvendigt.</li>
	<li>Åbne instrumentation-softwaren på computeren. Vælg først den &#34; analyse &#34; fane på højre side af vinduet og &#34; nye Assay &#34; under den &#34; fil Menu &#34; til venstre. Vælg størrelse, størrelsesområde (f.eks., 12-230 kDa) og cartridge type (f.eks., 25 kapillær), der blev brugt til den pågældende analysen. 
	Bemærk: En maj også input assay parametre, herunder proteinkoncentration, antistof type og fortynding, hvis ønsket, men disse er ikke nødvendige for at starte analysen.</li>
	<li>Åbne døren på apparatet ved at trykke på knappen øverst på panelet orange.</li>
	<li>Fjern forsigtigt kapillær patronen ud af emballagen. Uden at røre glas kapillærer placere sig, blækpatronen i patronholderen. Kontroller blækpatron siddepladser ved at observere den indvendige lys skifter fra orange til blå.</li>
	<li>Holde pladen fast på bænken og skrælle omhyggeligt fordampning segl fra den nederste del af pladen. Pop alle boblerne set i disse adskillelse matrix brønde med en smalle afpipetteres tip eller ren nål (f.eks., 25 gauge steril &#34; rep top &#34; nål).</li>
	<li>Assay pladen anbringes på plade-indehaveren, sikrer det helt sidder, og luk instrument.</li>
	<li>Klik på den &#34; Start &#34; knappen i softwaren. 
	Bemærk: Hvis der ingen Start-knappen vises, forbindelsen med instrumentet er gået tabt. Vælge Instrument fra den øverste venstre menu, og tilslut derefter. En pop op-vinduet skal vises med serienummer instrument; Vælg denne indstilling, og klik på Tilslut. Start-knappen vises nu.</li>
	<li>Når kørslen er afsluttet, kassere pladen. Fjern blækpatronen og sted i en skarpe container til bortskaffelse, samt enhver nåle, der kan have været brugt til at pop boblerne. Forlade magt på at undgå problemer med forbindelsen, hvis apparatet bruges regelmæssigt (f.eks. mindst ugentligt).</li>
</ol> 7. Eksperimentere analyse <ol><li>før analyse, sikre følgende kvalitetskontrol er udført.
	<ol><li>Bekræft fluorescerende standarder ved at vælge den &#34; Vis standarder &#34; ikon. Kontroller, at standarderne er korrekt identificeret i den &#34; grafvisning &#34; fane. Hvis de er forkert, gå til den &#34; enkeltvisning &#34; ikon, højreklikke på den korrekte peak, og vælg &#34; kraft Standard &#34;, eller Højreklik på den forkerte peak og vælge &#34; ikke en Standard &#34;. Udføre denne kontrol for hver ny kapillær.</li>
		<li>Bekræft biotinylated stigen ved at klikke på den &#34; prøver &#34; og &#34; enkeltvisning &#34; ikoner. Vælg stigen i fanen eksperiment. Hvis et højdepunkt er forkert identificeret, højre klikke på det i &#34; grafvisning &#34; og vælg &#34; Fjern Peak &#34;. 
		Bemærk: For eksempel, biotinylated stigen bruges til 12-230 kDa kit skal vise 12, 40, 66, 116, 180 og 230 kDa dimensionering toppe. Hvis dette trin ikke er udført, dimensionering af prøven toppe vil blive forkert beregnet, producerer falske resultater.</li>
		<li>Se og analysere prøve toppe. Udlede data fra tabellen toppe, herunder molekylvægt, topareal, tophøjde og signal-støj (S/N), som er nødvendig for eksperimenterende beregninger.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bradley, H. L., Sabnis, H., Pritchett, D., Bunting, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hematopoietic stem cell protocols. 1185, (2014).</li><li>Guo, L., Eldridge, S., Furniss, M., Mussio, J., Davis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+(hiPSC-CMs)+to+Monitor+Compound+Effects+on+Cardiac+Myocyte+Signaling+Pathways.">Use of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes (hiPSC-CMs) to Monitor Compound Effects on Cardiac Myocyte Signaling Pathways.</a> Curr Protoc Chem Biol. 7 (3), 141-185 (2015).</li><li>Chen, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantitation+of+endogenous+proteins+with+precision+and+accuracy+using+a+capillary+Western+system.">Absolute quantitation of endogenous proteins with precision and accuracy using a capillary Western system.</a> Anal Biochem. 442 (1), 97-103 (2013).</li><li>Chen, J. Q., Wakefield, L. M., Goldstein, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+nano-immunoassays:+advancing+quantitative+proteomics+analysis,+biomarker+assessment,+and+molecular+diagnostics.">Capillary nano-immunoassays: advancing quantitative proteomics analysis, biomarker assessment, and molecular diagnostics.</a> J Transl Med. 13, 182 (2015).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Application+of+a+Novel+Nanovolume+Capillary+Electrophoresis-+Based+Protein+Analysis+System+in+Personalized+&amp;+Translational+Medicine+Research.">The Application of a Novel Nanovolume Capillary Electrophoresis- Based Protein Analysis System in Personalized &amp; Translational Medicine Research.</a> J Bioanal Biomed. S3 (004), (2013).</li><li>ProteinSimple Western. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Size Assay Development Guide, Revision 1. , (2014).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+modern+quantitative+fluorescent+western+blotting+with+troubleshooting+strategies.">A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies.</a> J Vis Exp. (93), (2014).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western++blotting:+sample+preparation+to+detection.">Western blotting: sample preparation to detection.</a> J Vis Exp. (44), (2010).</li><li>Silva, J. M., McMahon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fastest+Western+in+town:+a+contemporary+twist+on+the+classic+Western+blot+analysis.">The fastest Western in town: a contemporary twist on the classic Western blot analysis.</a> J Vis Exp. (84), e51149 (2014).</li><li>Thorn, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin+pathways:+pharmacodynamics+and+adverse+effects.">Doxorubicin pathways: pharmacodynamics and adverse effects.</a> Pharmacogenet Genomics. 21 (7), 440-446 (2011).</li><li>Ernst, O., Zor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linearization+of+the+bradford+protein+assay.">Linearization of the bradford protein assay.</a> J Vis Exp. (38), (2010).</li><li>Taira, N., Yoshida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+of+p53+tumor+suppressor:+determinants+of+its+functional+targets.">Post-translational modifications of p53 tumor suppressor: determinants of its functional targets.</a> Histol Histopathol. 27 (4), 437-443 (2012).</li><li>Thompson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+p53+on+key+serines+is+dispensable+for+transcriptional+activation+and+apoptosis.">Phosphorylation of p53 on key serines is dispensable for transcriptional activation and apoptosis.</a> J Biol Chem. 279 (51), 53015-53022 (2004).</li><li>Currier, J. M., Cheng, W. Y., Menendez, D., Conolly, R., Chorley, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+Gene+Biomarker+at+the+Tipping+Point+of+Adaptive+and+Adverse+Responses+in+Human+Bronchial+Epithelial+Cells.">Developing a Gene Biomarker at the Tipping Point of Adaptive and Adverse Responses in Human Bronchial Epithelial Cells.</a> PLoS One. 11 (5), e0155875 (2016).</li><li>Moser, A. C., Hage, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+electrophoresis-based+immunoassays:+principles+and+quantitative+applications.">Capillary electrophoresis-based immunoassays: principles and quantitative applications.</a> Electrophoresis. 29 (16), 3279-3295 (2008).</li><li>Shintani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Capillary Electrophoresis Applications. , (1997).</li><li>. Wes reagents and consumables :: ProteinSimple Available from: <a target="_blank" href="https://www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html">https://www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html</a> (2017)</li></ol>

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser. Dette manuskript har gennemgået af nationale sundheds- og miljømæssige virkninger Research Laboratory og godkendt til offentliggørelse. Indhold afspejler ikke nødvendigvis synspunkter af US EPA heller udgør omtale af handelsnavne eller kommercielle produkter godkendelse eller anbefaling for brug.

I årtier, der har været vedholdende interesse i udviklingen af kapillær elektroforese-baseret immunassay metoder på grund af lav prøve og reagens udgifter, faldt behandling tid i forhold til traditionelle metoder, og høj kompatibilitet til automatisere procedure4,15. Der er en række forskellige protokoller til adskillelse af proteiner, der har udnyttet kapillærer, herunder elektroforese, elektrokinetiske, polymer sigtning og isoelektrisk metoder, som isolerer proteiner af forskellige egenskaber (henholdsvis, elektrostatisk opladning, partition ligevægt, sigtning egenskaber af adskille matrix, og pH)16. Her, beskriver vi et antistof-baseret (eller immunassay) kapillær elektroforese metode, ved hjælp af en polymer sigtning adskillelse, der er blevet automatiseret og kommercielt vedtagne3. Fordele ved dette system omfatter brugervenlighed og drift, standardiseret og kommercielt tilgængelige reagenser, og pålidelig, følsomme målinger, der kræver mindre reagens og prøver i forhold til traditionelle protein assays som vestlige skamplet, enzym-forbundet immunassay, og andre formater3,4,5. Det er blevet bemærket i tidligere vurderinger af denne teknologi, at størrelsesområde for protein, som kan vurderes har været begrænset af den tilgængelige adskillelse matrix4, men de seneste tilbud har udvidet den målbare spænder fra 2 til 440 kDa17 . Derudover skal nogle lysate buffere er kendt for at være uforenelig med assay18, udvalg af de eksperimentelle reagenser derfor på forhånd.
En stor fordel af en automatiseret procedure med kommercielt tilgængelige komponenter er konsekvens af resultater gennem standardiserede metoder og reagenser. Dette minimerer chancerne analysen fejl ved at automatisere kritiske trin i proceduren. Det er dog vigtigt at bemærke, at visse former for praksis skal overholdes under protokol til at minimere problemer med den kapillær elektroforese-baseret immunassay. Første, det er afgørende, at luminol-S/peroxid blandingen er forberedt friske og straks før pladen lastning. Konsekvent timing vil resultere i sammenhængende luminescence efter den oxidationsmiddel er tilføjet, hvilket vil resultere i sammenhængende målinger for et bestemt antistof assay efter assay. Derudover er det vigtigt, at ikke-udløbet reagenser der bruges, som påvirker primært styrken af den oxidationsmiddel. Derudover er det vigtigt, at lastning rækkefølgen af prøver, antistoffer og andre reagenser strengt følges (Se figur 1). Ethvert reagens pipetted malplaceret vil resultere i assay fiasko og en spildt køre.
Udover disse kritiske trin overvindes primære problemer oplevet med teknikken generelt gennem optimering. Disse betingelser er specifikke for hver model system/antistof kombination og derfor bør fastsættes empirisk for hver ny assay. I denne artikel vil vi fokusere på tre fælles optimering procedurer: eksponeringstid, lysate titrering og primære antistof fortynding. Evnen til at skabe målbare resultater afhænger analyse af en eksponeringstid når luminol substrat ikke er at være hurtigt forarmet, som substrat udtynding resulterer i tab af signal. Lysate titrering afgør den lineære dynamiske rækkevidde af hvert assay, som eventuelt kan afvige med forskellige modelsystemer, samt forskellige antistoffer, selv for den samme protein mål. Antistof fortyndinger valgt på eller i nærheden af mætte koncentrationer sikre ændringer i signalet ikke vil blive berørt af en mangel på frie antistof, men kun af forskellige mængden af tilgængelige protein target epitop. Andre overvejelser under optimeringsprocessen kan omfatte antistof inkubationstiden og stabling/prøve loading tid. I de fleste tilfælde tilbyder standardindstillingerne for instrumentet den bedste balance mellem opløsning og følsomhed. Dog i nogle tilfælde, kan dårlig opløsning eller følsomhed forbedres ved at justere disse parametre.
Kapillar elektroforese-baseret immunassay metoder giver hurtig, effektiv og reproducerbare protein målinger. Mens disse metoder har primært været udnyttet i indstillinger for forskning og udvikling, har konsistens af disse teknologier potentielle nytte i lovgivningsmæssige og kliniske applikationer. For eksempel, kan identifikation af modtagelige delpopulationer miljømæssige giftstoffer eller patienter med progression af sygdommen være baseret på protein biomarkører målt i tilgængelige matricer, blod, urin og spyt. Som reagens og drift omkostninger dråbe og antallet af prøver og mål, der kan være samtidig vurderes stiger, vil vi sandsynligvis se kapillær elektroforese-baseret immunassay metoder anvendes til disse typer af applikationer.

Kapillar elektroforese immunassays måle protein udtryk i cellelysater ved hjælp af størrelse eller afgift adskillelse systemer og giver adskillige fordele i forhold til de traditionelle immunassays. For eksempel, når sammenlignet med vestlige skamplet, den automatiserede kapillær-baseret procedure eliminerer behovet for geler, overførsel enheder, og manuel vasker. Desuden, er den absolutte mængde af protein kræves ca 10 gange mindre, hvilket gør kapillær-baserede systemer ideel til brug med sjældne celletyper eller begrænset stikprøve1,2. Resultater er opnået på så lidt som 3 h ved hjælp af automatiserede systemer og har tidligere vist sig for at være mere kvantitative og reproducerbare end konventionelle western duppes procedurer3,4,5. Processen for størrelse-baserede assays består af indlæsning af prøver indeholdende dodecyl natriumsulfat (SDS), dithiothreitol (DTT), og fluorescently hedder molekylvægt markører i kapillær kolonner, der indeholder stabling og adskillelse matricer. Anvendes til kapillærerne spænding adskiller proteiner i prøver efter størrelse, og UV-lys immobiliseres adskilt proteiner til kapillar væggen. Kapillar er derefter immuno-aftestede med target-specifikke primære antistof og peberrod peberrodsperoxidase (HRP)-konjugeret sekundær antistof. Luminol og peroxid katalyserer kemiluminescens lys generation, som er målt ved en afgift koblede enhed (CCD) kamera og analyseres for at kvantificere protein.
Trods den relative lethed og hastighed af en automatiseret kapillær-baserede elektroforese immunassay platform er optimering af assay betingelser såsom proteinkoncentration, antistof fortynding og eksponeringstid vigtig for at opnå nøjagtige og reproducerbare resultater. Generelt er bør følgende procedurer udføres for at optimere en analyse for disse systemer:
1) en skærm bør udføres for at vurdere og vælge antistoffer for signal og specificitet til protein målet. Hvis det er tilgængeligt, kan renset protein eller target epitop bruges til at vurdere specificiteten; dog er det stadig vigtigt at vurdere potentielle ikke-specifikke signal i total protein stammer fra modelsystemet.
2) næste, det dynamiske område af analysen skal bestemmes. I en ideel situation, er signal fordobling (målt ved hjælp af toparealet) observeret som prøve koncentration er fordoblet; men i praksis, en proportional ændring i signal til input på en forudsigelig måde (f.eks.lineær passer) er tilstrækkelig for protein kvantificering. Derudover vil denne optimering definere proteinkoncentration med højt signal men stadig inden for det lineære område for den eksperimentelle model.
3) bestemme optimal antistof koncentrationen ved hjælp af den faste proteinkoncentration valgt i optimering trin 2. Som antistof koncentrationen stiger, øges signalet indtil det plateauer på mætning. Et antistof koncentration i nærheden af denne mætning niveau der kræves nøjagtig måling af proteinkoncentration.
Processen, der bruges til at optimere protein fusioner, antistof fortyndinger og eksponering gange for en automatiseret kapillær-baserede størrelse assay6 påvises ved hjælp af hele cellen ekstrakter isoleret fra BEAS-2B, en SV-40 forvandlet menneskelige bronchiale epitelcelle linje. Protein isolation fra celle- eller vævsdel ekstrakter kan udføres ved hjælp af en række publicerede protokoller7,8,9 og vil ikke blive dækket her. Resultaterne af en retssag eksperiment ved hjælp af optimeret betingelserne er også rapporteret til samlet og fosforyleret (Serin 15, Serin 20) p53 i kulturer udsat for doxorubicin (en fælles kemoterapeutiske agent, der inducerer celle apoptose10) på 1,2, 1.8, og 2.4 µg/mL medier for 4 h før høst. P53 toparealer er normaliseret til ɑ-tubulin, der bruges som en loading kontrol.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Wes instrument</td>
			<td>ProteinSimple (Santa Clara, CA)</td>
			<td>004-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P53 DO-1 primary antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td>
			<td>sc-126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphorylated p53 (ser 15) primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphorylated p53 (ser 20) primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha-tubulin primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3873</td>
			<td>used as a loading control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compass Software</td>
			<td>ProteinSimple (Santa Clara, CA)</td>
			<td></td>
			<td>provided with the Wes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-230 kDa Master kit</td>
			<td>ProteinSimple (Santa Clara, CA)&#160;</td>
			<td>PS MK02 (since replaced by a new kit #)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html</td>
			<td>INCLUDES PART NO: 
			Wash Buffer (60 mL) 042-202 
			10X Sample Buffer (440 &#956;L) 042-195 
			Pre-Filled Microplates (8) PS-PP01 
			Capillary Cartridges (8) PS-CC01 
			Antibody Diluent II (20 mL) 042-203 
			Luminol-S (1.5 mL) 042-233 
			Peroxide (1.5 mL) 042-234 
			Streptavidin-HRP (132 &#956;L) 042-414 
			Standard Pack (8): Biotinylated ladder, fluorescent 5X master mix, DTT, and empty 0.6 mL tube PS-ST01 
			Anti-Rabbit Secondary Antibody 042-206 
			or 
			Anti-Mouse Secondary Antibody 042-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name&#160;</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Cell culture, treatment, and harvest (using vendor recommended protocols; protocols not included in manuscript)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEAS-2B cells</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA)</td>
			<td>CRL-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>keratinocyte growth medium, KGM Gold</td>
			<td>Lonza Ltd (Basel, Switzerland)</td>
			<td>192152</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>keratinocyte basal medium, KBM Gold</td>
			<td>Lonza Ltd (Basel, Switzerland)</td>
			<td>192151</td>
			<td>serum free medium for chemical dosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>doxorubicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>D1515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Blue Bradford Assays</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td>
			<td>23200</td>
			<td>for protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Extract kit</td>
			<td>Active Motif (Carlsbad, CA)</td>
			<td>D1515</td>
			<td>used to prepare whole cell lysates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>INCLUDES:</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Lysis Buffer AM1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1M dithiothreitol (DTT)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10X PBS&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Phosphatase Inhibitors</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

procedure and key optimization strategies for an automated capillary electrophoretic-based immunoassay method

Nye teknologier, der udnytter kapillær-baserede immunassays lover hurtigere og mere kvantitativ protein vurdering i forhold til traditionelle immunassays. Men i lighed med andre antistof-baseret protein assays, optimering af kapillær-baseret immunassay parametre, såsom proteinkoncentration, antistof fortynding og eksponeringstid er en vigtig forudsætning for generation af meningsfulde og pålidelig data. Målingerne skal ligge inden for det lineære område af analysen hvor ændringer i signalet er direkte proportional med ændringer i lysate koncentration. Processen med at vælge passende lysate koncentrationer, antistof fortyndinger og eksponering gange i den menneskelige bronchiale epitelcelle linje, BEAS-2B, er vist her. Assay linearitet er vist over en vifte af hele cellen ekstrakt protein fusioner med p53 og α-tubulin antistoffer. Et eksempel på signal udbrændthed er set ved de højeste koncentrationer med lange eksponeringstider, og en α-tubulin antistof fortynding kurve er vist demonstrerer mætning. Derudover er eksempel eksperimentelle resultater rapporteret for doxorubicin-behandlede celler ved hjælp af optimerede parametre.

Eksponeringstiden - Besluttende signal udbrændthed
Signal udbrændthed kan forekomme, når luminol og peroxid underlaget er forarmet for hurtigt. Dette kan bestemmes ved at undersøge dataene på forskellige kemiluminescens eksponering gange. I analyse software, gå til "Rediger - &#62; analyse - &#62; billeder". Engagementer, der spænder fra 5 til 480 s. Y-aksen i en elektroferogrammet rapporter signal/tid, så data fra hver eksponering bør have en tilsvarende signal/tid koefficient. Denne koefficient aftager med sekventielt længere eksponeringer, hvis luminol bliver forarmet, som set med p53-1 antistof (figur 2). På grund af substrat udtynding, kan dette assay betragtes målbare op til 0,2 µg/µL koncentrationen kun på 5-30 s engagementer. Derfor, i dette eksempel, 15 s var fast besluttet på at være den optimale data analyse eksponeringstid for p53.
Lysate titrering - Bestemmelse af lineære dynamiske område
Det er vigtigt, at målinger foretages inden for den lineære dynamiske rækkevidde af hvert assay, hvor ændringer i signal som målt ved topareal er proportional med ændringer i mængden af protein i prøven. Bruger den optimale eksponeringstid 15 s valgt i det foregående afsnit, analysen linearitet er påvist for både p53 og ɑ-tubulin over større end et 15-fold udvalg af koncentrationen (figur 3). Vores erfaring, Rasmussen2 værdien &#62; 0,9 af en lineær regression passer betragtes som acceptabelt for en fortynding række oprenset protein kendt mængde (hvis assay er en absolut kvantitativ måling) eller prøve lysate af ukendt mål protein (hvis assay er en relativ kvantitativ måling).
Optimering af antistof fortynding
Ved hjælp af antistoffer på mætte koncentrationer hjælper med at sikre, at signalet ændringer målt er kun på grund af ændringer i protein beløb. Som en demonstration, var to BEAS-2B cellelinje hele cellen ekstrakter (0,2 µg/µL total protein indlæses i analysen) aftestede med seriefremstillede fortyndet ɑ-tubulin antistof koncentrationer fra 1:25 - 1:800 (figur 4). Kemiluminescens signal (her, målt som topareal) var plottes antistof fortynding. Mætning blev observeret i nærheden af 1:50 fortynding hvor kurven begynder en mærkbar plateau.
Eksperimentelle forsøg - Doxorubicin behandling i BEAS-2B celler
Ved hjælp af optimeret assay betingelser BEAS-2B cellekultur blev behandlet med tre forskellige koncentrationer af doxorubicin (1.2, 1,8 og 2.4 µg/mL) for 4 h (figur 5, tabel 1). Aktivering af p53 gennem posttranslationelle modifikationer medierer flere cellulære svar, herunder celle cyklus anholdelse, ældning og apoptose12. Specifikt er blevet tilskrevet transcriptional aktivering af p53, resulterer i apoptose efter doxorubicin behandling13fosforylering af Serin 15. I denne demonstration normaliseret ɑ-tubulin peak områder præsenteres som fold af kontrol. Interessant, 3.5 4-fold stigninger i p53 fosforylering på Serin 15 og 2-fold stigning i niveauet af p53 fosforyleret på Serin 20 blev observeret efter 4 h eksponering for doxorubicin. Disse resultater tyder på aktivering af p53; dog ingen dosis-respons ses de koncentrationer, der er valgt (omvendt er den laveste dosis, der testes fremkaldte den højeste respons). Samlede p53 ikke påvise en klar behandlingsrespons i denne modelsystem. Vi har tidligere observeret aktivering af p53 fosforylering i mangel af forhøjede niveauer af total p53 under lignende forhold i zink-behandlede BEAS-2B celler14.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig2v3.jpg"> 
Figur 2 . Eksponering billede sammenligning at opdage signal udbrændthed. Lane synspunkter Vis faldende protein koncentrationer for BEAS-2B lysates aftestede med p53-1 antistof ved 1: 500. Kemiluminescens signal koefficienter, rapporteret som tophøjder i instrument-softwaren er overlejret. I modsætning til tophøjder, visuelle band intensiteter automatisk genereres og justeret instrument til at støtte visning af bands og er ikke sammenlignelige fra den ene panel til en anden. Bemærk nedgangen i kemiluminescens signal når eksponering tid øges, med det signal, der begynder at forsvinde (split peak) på de to længste engagementer, med angivelse af substrat udtynding. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig2v3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig3v3.jpg"> 
Figur 3 . Lysate titrering viser visningerne lane. Lysate titrering viser lane visninger (A) i BEAS-2B lysate når aftestede med 1: 500 p53-1 eller 1:50 ɑ-tubulin. I modsætning til området spidsværdier, visuelle band intensiteter automatisk genereres og justeret instrument til at støtte visning af bands og er ikke sammenlignelige fra den ene panel til en anden. Lineær regressionsanalyse (B) bekræfter assays er lineære over hele spektret testet, fra 0,01 til 0,20 µg/µL og 0,025 til 0,40 µg/mikroliter, med R2 værdier af 0.999 og 0.985, henholdsvis. Total protein koncentrationer i midten af det lineære område blev valgt at imødekomme potentielle mål protein variation i begge retninger (fx, 0,2 µg/µL til α-tubulin). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig3v3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig4.jpg"> 
Figur 4 . Α-tubulin antistof fortynding kurver for to separate BEAS-2B protein lysates med og uden baseline normalisering. En konkret departure fra linearitet ses på 1:50 (0.02) fortynding, der angiver mætning. 1:50 var derfor valgt som den optimale fortynding for denne antistof. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig5.jpg"> 
Figur 5. Effekt af 4 h doxorubicin (DXN) behandling på alt og serin fosforyleret p53 protein udtryk i BEAS-2B celler. Toparealer er normaliseret til α-tubulin og afbildet som fold af kontrol (CTL). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/55911/55911tbl1.jpg"> 
Tabel 1. Effekt af 4 h doxorubicin (DXN) behandling på alt og serin fosforyleret p53 protein udtryk i BEAS-2B celler. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911tbl1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af denne tabel.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method at JoVE.com

Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method

En kapillær-baseret immunassay ved hjælp af en kommerciel platform til at måle mål proteiner fra total protein præparater er påvist. Derudover er assay parametre eksponeringstid, proteinkoncentration og antistof fortynding optimeret til en celle kultur modelsystem.

Procedure og centrale optimeringsstrategier for en automatiseret kapillær elektroforese-baseret immunassay metode

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Optimization of the Ugi Reaction Using Parallel Synthesis and Automated Liquid Handling

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described.  Triplicate runs ...

Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay Testing Methodology and Troubleshooting

To ensure the quality of animal models used in biomedical research we have developed a number of diagnostic testing strategies and methods to determine if ...

Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies

In the biological sciences there have been technological advances that catapult the discipline into golden ages of discovery. For example, the field of ...

Spatial Multiobjective Optimization of Agricultural Conservation Practices using a SWAT Model and an Evolutionary Algorithm

Spatial Multiobjective Optimering af landbrugsprodukter Conservation Practices ved hjælp af en SWAT Model og en Evolutionary Algorithm

Finding the cost-efficient (i.e., lowest-cost) ways of targeting conservation practice investments for the achievement of specific water quality goals ...

LeafJ: An ImageJ Plugin for Semi-automated Leaf Shape Measurement

LeafJ: En ImageJ Plugin til Semi-automatiseret Leaf Shape Måling

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the ...

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

En innovativ metode til exosome Kvantificering og størrelse måling

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...