Name: procedure and key optimization strategies for an automated capillary electrophoretic-based immunoassay method
Uploaded: 2017-09-10T14:00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method at JoVE.com

Les auteurs tiennent à remercier Keith Tarpley nous EPA du Bureau de l’équipe recherche et développement-Research Triangle Park (RTP-ORD) graphique et des médias pour le développement, enregistrement et montage de la vidéo d’instruction. Nous tenons également à remercier Deborah Pritchett de ProteinSimple pour les conversations utiles au sujet de l’optimisation de nos données,. JM Guynn a été soutenu par l’Institut d’Oak Ridge pour la Science et l’éducation programme de recherche/Participation à la US Environmental Protection Agency.

Remarque : s’assurer que tous les réactifs et les échantillons sont préparés selon le fabricant &#39; protocole s, décrite ci-dessous. Veuillez porter des équipements de protection individuelle approprié au cours de cette procédure, qui comprend des gants en nitrile, blouse, chaussures à bout fermé et des lunettes de sécurité. Un tableau des matériaux spécifiques, les réactifs et les équipements nécessaires est fourni séparément. Protéines totales concentration d’échantillons doit être déterminée à l’avance à l’aide des méthodes établies qui sont compatibles avec le tampon de lysat utilisé, tels que Bradford dosage 11.
 1. préparation des échantillons et de réactifs provenant du pack standard comme fourni par le fabricant <ol><li>pour préparer la solution de travail de 400 mM de dithiothréitol (DTT), ajouter 40 µL désionisée l’eau dans le tube transparent contenant la fourni de stock du fabricant. Il est important d’éviter d’introduire des bulles à la solution en mélangeant la solution lentement et en douceur le pipetage.</li>
	Tampon <li>Ajouter 20 µL 10 X et 20 µL de la solution préparée de 400 mM de TNT dans le tube rose contenant 5 fluorescents X master mix (voir la Table des matières). 
	Remarque : Le Master Mix (MM) est scellé par le fabricant avec un film protecteur et doivent être percés par une pointe de pipette. Mélanger doucement par pipetage lente pour éviter les éclaboussures de TNT dans la pipette.</li>
	<li>Ajoutez ensuite l’eau 16 µL d’eau désionisée, 2 µL de fourni 10 X tampon et 2 µL de la solution préparée de 400 mM DTT au tube blanc biotinylé échelle fournie par le fabricant. Mélanger doucement et transvaser dans un tube à 0,6 mL pour dénaturation.</li>
	<li>Prepare 0,1 x tampon en diluant les 10 fourni de solution au 1/100 avec de l’eau. Préparer suffisamment 0,1 x tampon pour diluer les échantillons.</li>
	<li>Calculer le montant de 0,1 tampon x qui est ajouté à un échantillon, qui dépendra de la concentration finale souhaitée des protéines totales. Mélanger 1 partie 5 x MM fluorescent avec 4 parties dilué échantillon pour atteindre la concentration de la protéine finale désirée.
	Volumes <ol><li>calculer comme suit : (i) Volume 5 x fluorescent MM = (concentration en protéines final désiré) / 5 ; (ii) le volume du stock de protéines = (concentration de protéine finale désirée x volume Total nécessaire) / protéine stock concentration ; (iii) le volume 0,1 x tampon échantillon = volume Total - 5 x volume de MM - protéine stock volume.</li>
	</ol></li></ol> 2. Dénaturation des échantillons et échelle <ol><li>lieu préparé échantillons et biotinylés échelle dans un bloc chauffant de 95 ° C pour 5 min. les tubes Vortex immédiatement après l’incubation, exécuter une rotation pendant ~ 5 s dans une centrifugeuse sur table et place sur Ice 
	Remarque : Certaines protéines peuvent nécessiter plus douces conditions de dénaturation (p. ex., 70 o C pendant 10 min) pour empêcher l’agrégation des protéines et améliorer la migration dans la matrice capillaire. Envisager cette option s’il est lourd bavures à poids moléculaire plus élevés (voir la vidéo par exemple).</li>
</ol> 3. Préparation des anticorps <ol><li>tel que déterminé par l’optimisation (voir Résultats représentant et vidéo), préparer le puits désiré d’anticorps primaire (par exemple, 01:50, 1/100) dans l’anticorps fournis Diluant 2. 
	NOTE : Anticorps sont généralement utilisés à des concentrations plus élevées d’immunoessai axée sur le capillaire que pour éponger occidental traditionnel. L’anticorps secondaire fourni est prêt à l’emploi sans dilution.</li>
</ol> 4. Préparation du Luminol-S et peroxyde de <ol><li>préparer un mélange de 1:1 de luminol-S et peroxyde.</li>
	<li>Vortex pour mélanger et stocker sur glace 
	Remarque : Il est important que ce mélange est préparé frais pour chaque série de tests expérimentaux. 250ul mélange total est nécessaire pour exécuter une assiette pleine.</li>
</ol> 5. Préparation de la plaque de test <ol><li>, comme illustré à la Figure 1, charger les échantillons et les réactifs préparés au-dessus dans la plaque de test. Voir les instructions détaillées ci-dessous pour chaque ligne. Pour minimiser l’évaporation par les puits, s’assurer que le couvercle de la plaque est remplacé entre les ajouts réactif.</li>
	<li>à la ligne A, ajouter 5 µL de Biotinylated Ladder en puits A1. Pour la ligne restante, pipette a préparé des échantillons (5 µL) dans puits A2-A25. 
	Remarque : Il est impératif que l’A1 contient bien toujours coupée, comme le premier capillaire dans la cartouche est optimisé pour l’exécution de la présente norme.</li>
	<li>à la ligne B, ajouter 10 µL d’anticorps diluant 2 dans chaque puits (B1-B25).</li>
	<li>à la ligne C, ajouter 10 µL d’anticorps diluant 2 en C1 bien. Dans la ligne restante C wells, ajouter 10 µL d’anticorps primaire (puits C2-C25).</li>
	<li>En ligne D, ajouter 10 µL de streptavidine-HRP en D1 bien. Dans la ligne restante D wells, ajouter 10 µL de l’anticorps secondaire (puits D2-D25).</li>
	<li>En ligne E, ajouter 10 µL du mélange luminol-peroxyde fraîchement préparé dans chaque puits (E1-E25).</li>
	<li>Enfin, ajouter 500 µL de tampon de lavage par compartiment à chacune des lignes d’un puits de tampon top-3. 
	Remarque : Il est important de minimiser la formation de bulles de pipetage doucement et ne pas expulser le dernier volume de la pointe comme bulles peuvent interférer avec le capillaire de chargement et exécutez.</li>
	<li>Une fois que tous les puits sont chargés, centrifuger la plaque à ~ 1000 x g pendant 5 min à température ambiante pour enlever les bulles et s’assurer que le liquide est dans le fond des puits. Éclater les bulles visibles avec un petit bout de pipette ou une aiguille propre (par exemple, calibre 25 stérile &#34; haut rep &#34; needle).</li>
</ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig1.jpg" /> figure 1 . Modèle de pipetage pour plaque de test. Codage couleur représente bon réactifs et des échantillons (total jusqu'à 24) ajoutés à la plaque de test. Ajouter biotinylé échelle à puits A1 (orange), préparé des échantillons provenant de puits A2 jusqu'à A25 (bleu clair), 2 diluant anticorps aux puits B25-B1 et C1 (vert clair), anticorps primaire aux puits C2 jusqu'à C25 (bleu), streptavidine-HRP à bien D1 (rose foncé), un anticorps secondaire à puits de D2 jusqu'à D25 (vert foncé) et le luminol au peroxyde mix aux puits E1 jusqu'à E25 (violet). Tampon de lavage est ajouté pour les trois premières rangées de la plus grande Mid-plaque puits (bleu foncé). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig1large.jpg" target="_blank"> s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
 6. à partir de l’instrument de test immunologique capillaire <ol><li>veiller à ce que l’appareil et l’ordinateur qui l’accompagne sont allumés. Aucun échauffement de temps n’est nécessaire.</li>
	<li>Ouvrez le logiciel d’instrumentation sur l’ordinateur. Sélectionnez d’abord le &#34; test &#34; onglet sur la droite de la fenêtre et &#34; nouvelle méthode de dosage &#34; sous le &#34; Menu fichier &#34; sur la gauche. Sélectionnez la taille, la grandeur (par exemple, 12-230 kDa) et cartouche type (par exemple, 25 capillaire) qui a été utilisée pour le dosage particulier. 
	Remarque : Un mai également entrée paramètres de dosage, dont la concentration en protéines, le type d’anticorps et dilution, si vous le souhaitez, mais ceux-ci ne sont pas tenus de commencer le test.</li>
	<li>Ouvrir la porte sur l’instrument en appuyant sur le bouton au dessus du panneau orange.</li>
	<li>Retirer soigneusement la cartouche capillaire de son emballage. Sans toucher les capillaires en verre, placez la cartouche dans le porte-cartouche. Vérifier les sièges de la cartouche en observant la lumière intérieure change de l’orange bleue à.</li>
	<li>Tenir la plaque fermement sur le banc et décollez délicatement le sceau de l’évaporation de la partie inférieure de la plaque. Éclater les bulles vus dans ces puits de matrice de séparation avec un smtous les embout ou une aiguille propre (par exemple, calibre 25 stérile &#34; haut rep &#34; aiguille).</li>
	<li>Placer la plaque de test sur le support de plaque, assurant que c’est bien en place et fermer la porte de l’instrument.</li>
	<li>Cliquez le &#34; Start &#34; bouton logiciel. 
	Remarque : Si aucun bouton de démarrage n’apparaît, la connexion avec l’appareil a été perdue. Choisissez l’Instrument dans le menu principal de gauche, puis vous connecter. Un pop-up devrait apparaitre avec le numéro de série d’instrument ; Sélectionnez cette option, puis cliquez sur se connecter. Le bouton de démarrage doit maintenant apparaître.</li>
	<li>Lorsque la série est terminée, jeter la plaque. Retirez la cartouche et le placer dans un conteneur pour objets tranchants pour l’élimination, ainsi que des aiguilles qui ont pu être utilisées à bulles pop. Laisser le pouvoir pour éviter des problèmes de connexion si l’instrument est utilisé régulièrement (par exemple, au moins une fois par semaine).</li>
</ol> 7. Expérimenter l’analyse <ol><li>avant l’analyse, s’assurer que les contrôles de qualité suivants sont effectués.
	<ol><li>Verify fluorescents standards en sélectionnant le &#34; normes montrent &#34; icône. Vérifier que les normes sont correctement identifiées dans les &#34; vue du graphique &#34; onglet. Si elles sont incorrectes, aller à la &#34; vue unique &#34; icône, faites un clic droit sur le pic correct, puis sélectionnez &#34; Force Standard &#34;, ou faites un clic droit sur le pic incorrect et sélectionnez &#34; pas une norme &#34;. Effectuer cette vérification pour chaque nouveau capillaire.</li>
		<li>Verify biotinylé échelle en cliquant sur le &#34; des échantillons &#34; et &#34; vue unique &#34; icônes. Sélectionnez l’échelle dans l’onglet de l’expérience. Si un pic n’est pas correctement identifié, faites un clic droit dessus dans &#34; graphe &#34; et sélectionnez &#34; Remove Peak &#34;. 
		NOTE : par exemple, l’échelle de biotinylé utilisée pour le 12-230 kDa kit devrait montrer 12, 40, 66, 116, 180 et 230 kDa pics de dimensionnement. Si cette étape n’est pas effectuée, le dimensionnement des pics échantillon sera mal calculé, produisant des résultats fallacieux.</li>
		<li>Voir et analyser les pics de l’échantillon. Dérivent des données de la table de pics, y compris les poids moléculaire, surface de pic, hauteur de pic et signal/bruit (S/B), selon les besoins pour les calculs expérimentaux.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bradley, H. L., Sabnis, H., Pritchett, D., Bunting, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hematopoietic stem cell protocols. 1185, (2014).</li><li>Guo, L., Eldridge, S., Furniss, M., Mussio, J., Davis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+(hiPSC-CMs)+to+Monitor+Compound+Effects+on+Cardiac+Myocyte+Signaling+Pathways.">Use of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes (hiPSC-CMs) to Monitor Compound Effects on Cardiac Myocyte Signaling Pathways.</a> Curr Protoc Chem Biol. 7 (3), 141-185 (2015).</li><li>Chen, J. 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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes. Ce manuscrit a été examiné par la National Health and Environmental Effects Research Laboratory et approuvé pour publication. Le contenu ne reflète pas nécessairement les vues de l’EPA, ni la mention de noms commerciaux ou de produits commerciaux constitue un endossement ou recommandation d’utilisation.

Pendant des décennies, il y a eu un intérêt soutenu dans le développement de méthodes d’immuno-essai axée sur électrophorèse capillaire en raison de la faible échantillon et réactif des dépenses, a diminué de traitement temps par rapport aux méthodes traditionnelles et de haute compatibilité avec automatiser la procédure4,15. Il y a un certain nombre de différents protocoles pour la séparation des protéines qui ont utilisé des capillaires, y compris les polymères électrophorétique, électrocinétique, tamisage et méthodes isoélectriques, qui isolent les protéines par des propriétés différentes (respectivement, charge électrostatique, équilibre de partition, tamisage des propriétés de la matrice de séparation et le pH)16. Nous décrivons ici une base d’anticorps (ou immunologique) méthode de l’électrophorèse capillaire, utilisant un polymère tamisage de séparation, qui a été automatisée et commercialement adopté3. Avantages de ce système sont la facilité d’utilisation et de fonctionnement, réactifs standardisés et disponibles dans le commerce et des mesures fiables et sensibles qui nécessitent moins réactifs et des échantillons par rapport à des tests de protéine traditionnels comme la tache occidentale, immuno-et autres formats de3,4,5. Il a été noté dans les évaluations précédentes de cette technologie que la gamme de taille de protéines pouvant être évalués ont été limitée par la séparation disponible matrice4, cependant ces dernières offres ont élargi la plage de mesure de 2 à 440 kDa17 . En outre, certains tampons lysats sont connus pour être incompatible avec le dosage18, donc sélection des réactifs expérimentales utilisé doit être considérée au préalable.
Un avantage majeur d’une procédure automatisée avec les composants disponibles dans le commerce est la cohérence des résultats par le biais de méthodes normalisées et réactifs. Cela minimise les chances d’échec de test grâce à l’automatisation des étapes cruciales dans la procédure. Cependant, il est important de noter que certaines pratiques doivent être respectées pendant le protocole afin de minimiser les problèmes avec l’immunodosage axée sur électrophorèse capillaire. Tout d’abord, il est essentiel que le mélange de luminol-S/peroxyde est préparé frais et immédiatement avant la plaque de chargement. Calendrier cohérent se traduira par luminescence conforme après que l’agent oxydant est ajouté, ce qui se traduira par des mesures cohérentes pour un dosage des anticorps après essai. En outre, il est important que les réactifs non expirés sont utilisés, qui touche principalement l’activité de l’agent oxydant. En outre, il est important que l’ordre de chargement des échantillons, des anticorps et autres réactifs être strictement respectées (voir Figure 1). Tout réactif éjectant hors de propos se traduira par l’échec de test et une course perdue.
En plus de ces étapes critiques, des émissions initiales rencontrées avec la technique peuvent généralement être surmontées grâce à l’optimisation. En effet, ces conditions sont spécifiques à chaque combinaison de système/anticorps modèle et devraient donc être déterminées empiriquement pour chaque nouvelle série de tests. Dans cet article, nous nous concentrons sur trois procédures d’optimisation communes : temps d’exposition et titrage lysat et l’affaiblissement de l’anticorps primaire. La capacité de générer des résultats mesurables dépend de l’analyse d’un temps d’exposition lorsque le substrat de luminol n'est pas être rapidement épuisé, comme substrat appauvrissement entraîne perte de signal. Titrage lysat détermine la plage dynamique linéaire de chaque série de tests, qui peut différer avec systèmes différents modèles, ainsi que des anticorps différents, même pour la même cible de protéine. Les dilutions d’anticorps choisies à ou près de concentrations saturantes assurer changements de signal ne seront pas affectés par une pénurie d’anticorps libres, mais seulement par une quantité différente de protéine disponibles cible épitope. Autres considérations au cours du processus d’optimisation peuvent inclure des temps d’incubation anticorps et empiler les temps de chargement/échantillon. Dans la plupart des cas, les paramètres par défaut pour l’instrument offrent le meilleur équilibre de la résolution et la sensibilité. Cependant, dans certains cas, faible résolution ou sensibilité peut être améliorée en ajustant ces paramètres.
Méthodes d’immuno-essai axée sur électrophorèse capillaire fournissent des mesures de protéine rapide, efficace et reproductible. Bien que ces méthodes ont été principalement utilisés dans les milieux de recherche et développement, la cohérence de ces technologies a utilité potentielle dans les applications cliniques et réglementaires. Par exemple, l’identification des sous-populations sensibles aux substances toxiques environnementales ou de patients avec progression de la maladie peut reposer sur les biomarqueurs protéiques mesurées dans des matrices accessibles, comme sang, urine et salive. Comme réactif et chute de coûts de fonctionnement et le nombre d’échantillons et des cibles qui peuvent être mises en recouvrement en même temps augmente, nous verrons probablement les méthodes immuno-essai axée sur électrophorèse capillaire utilisés pour ces types d’applications.

Les immunoessais électrophorèse capillaires mesurent l’expression de la protéine dans les lysats cellulaires à l’aide de systèmes de séparation de taille ou de la charge et offrent plusieurs avantages sur les immuno-essais traditionnels. Par exemple, par rapport à la tache occidentale, la procédure de base capillaire automatisée élimine le besoin pour les gels, les dispositifs de transfert, et manuel se lave. En outre, la quantité absolue de protéine nécessaire est environ 10 fois inférieure, rendant les systèmes axés sur le capillaire idéal pour être utilisé avec les types de cellules rares ou échantillon limité1,2. Résultats sont obtenus en moins de 3 h à l’aide de systèmes automatisés et précédemment se sont avérées plus quantitative et plus reproductible qu’occidentale conventionnelle blot procédures3,4,5. Le processus pour les analyses basées sur la taille consiste à charger des échantillons contenant de dodécyl sulfate de sodium (SDS), le dithiothréitol (DTT) et fluorescent étiqueté des marqueurs de poids moléculaire dans des colonnes capillaires contenant des matrices d’empilage et de séparation. La tension appliquée aux capillaires sépare les protéines dans les échantillons selon la taille, et lumière UV permet d’immobiliser les protéines séparées à la paroi capillaire. Le capillaire est ensuite immuno-sondés avec spécifique à la cible primaire anticorps et raifort peroxydase (HRP)-anticorps secondaire conjugué. Luminol et peroxyde catalysent chimiluminescente génération léger qui est mesurée par une caméra de dispositif couplé (DAC) frais et analyse pour doser les protéines.
Malgré la relative facilité et la vitesse d’une plate-forme de test immunologique électrophorétique axée sur le capillaire automatisée, optimisation des conditions de test comme la concentration de protéines, dilution de l’anticorps et durée d’exposition est importante pour l’obtention de précis et reproductibles résultats. En général, les procédures suivantes doivent être exécutées pour optimiser un test pour ces systèmes :
1) un écran doit être effectué pour évaluer et choisir des anticorps pour le signal et la spécificité de la cible de la protéine. Le cas échéant, protéine purifiée ou épitope de la cible peut être utilisé pour évaluer la spécificité ; Toutefois, il est toujours important d’évaluer le potentiel signal non spécifique en protéines totales provenant du système de modèle.
2) ensuite, la gamme dynamique du dosage doit être déterminé. Dans une situation idéale, signal doublement (mesurée à l’aide de la surface du PIC) est observé que la concentration de l’échantillon est doublée ; Cependant, en pratique, un changement proportionnel de signal à l’entrée d’une manière prévisible (par exemple, linéaire s’adapter) est suffisant pour la quantification des protéines. En outre, cette optimisation définira la concentration de protéines avec signal élevé mais toujours dans la gamme linéaire pour le modèle expérimental.
3) déterminer la concentration en anticorps optimale à l’aide de la concentration de protéine fixe choisie à l’étape d’optimisation 2. Comme la concentration en anticorps augmente, le signal augmente jusqu'à ce qu’il des plateaux à saturation. Une concentration d’anticorps près de ce niveau de saturation est requise pour la mesure précise de la concentration de protéines.
Le processus utilisé pour optimiser les concentrations de protéine, dilutions des anticorps et des temps d’exposition pour un dosage de taille de base capillaire automatisée6 est démontré en utilisant des extraits de cellules entières isolées de BEAS-2 b, un homme de SV-40 transformé bronchique lignée de cellules épithéliales. Isolement des protéines dans des extraits cellulaires ou tissulaires peut être effectuée à l’aide d’un certain nombre de protocoles publiés7,8,9 et n’est pas couverts ici. Résultats d’une expérience de première instance à l’aide des conditions optimisées sont également signalés pour total et phosphorylées p53 (sérine 15, sérine 20) dans les cultures exposées à la doxorubicine (un agent chimiothérapeutique commun qui induit l’apoptose de cellules10) à 1.2, 1.8, et 2,4 µg/mL de milieu de pendant 4 h avant la récolte. La surface des pics p53 sont normalisées à ɑ-tubuline, qui est utilisée comme un contrôle de chargement.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Wes instrument</td>
			<td>ProteinSimple (Santa Clara, CA)</td>
			<td>004-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P53 DO-1 primary antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td>
			<td>sc-126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphorylated p53 (ser 15) primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphorylated p53 (ser 20) primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha-tubulin primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3873</td>
			<td>used as a loading control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compass Software</td>
			<td>ProteinSimple (Santa Clara, CA)</td>
			<td></td>
			<td>provided with the Wes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-230 kDa Master kit</td>
			<td>ProteinSimple (Santa Clara, CA)&#160;</td>
			<td>PS MK02 (since replaced by a new kit #)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html</td>
			<td>INCLUDES PART NO: 
			Wash Buffer (60 mL) 042-202 
			10X Sample Buffer (440 &#956;L) 042-195 
			Pre-Filled Microplates (8) PS-PP01 
			Capillary Cartridges (8) PS-CC01 
			Antibody Diluent II (20 mL) 042-203 
			Luminol-S (1.5 mL) 042-233 
			Peroxide (1.5 mL) 042-234 
			Streptavidin-HRP (132 &#956;L) 042-414 
			Standard Pack (8): Biotinylated ladder, fluorescent 5X master mix, DTT, and empty 0.6 mL tube PS-ST01 
			Anti-Rabbit Secondary Antibody 042-206 
			or 
			Anti-Mouse Secondary Antibody 042-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name&#160;</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Cell culture, treatment, and harvest (using vendor recommended protocols; protocols not included in manuscript)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEAS-2B cells</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA)</td>
			<td>CRL-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>keratinocyte growth medium, KGM Gold</td>
			<td>Lonza Ltd (Basel, Switzerland)</td>
			<td>192152</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>keratinocyte basal medium, KBM Gold</td>
			<td>Lonza Ltd (Basel, Switzerland)</td>
			<td>192151</td>
			<td>serum free medium for chemical dosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>doxorubicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>D1515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Blue Bradford Assays</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td>
			<td>23200</td>
			<td>for protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Extract kit</td>
			<td>Active Motif (Carlsbad, CA)</td>
			<td>D1515</td>
			<td>used to prepare whole cell lysates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>INCLUDES:</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Lysis Buffer AM1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1M dithiothreitol (DTT)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10X PBS&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Phosphatase Inhibitors</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

procedure and key optimization strategies for an automated capillary electrophoretic-based immunoassay method

Nouvelles technologies qui utilisent immunologiques capillaire promettent évaluation plus rapide et plus quantitative des protéines par rapport aux traditionnels tests immunologiques. Cependant, semblable aux autres tests de protéine à base d’anticorps, optimisation des paramètres de base capillaire immunologique, comme la concentration de protéines, dilution de l’anticorps et durée d’exposition est une condition importante pour la génération de significatif et fiable données. Les mesures doivent entrer dans la gamme linéaire du dosage où les changements du signal sont directement proportionnelles aux variations de concentration de lysate. Le processus de choix des concentrations appropriées de lysats, dilutions d’anticorps et temps d’exposition à la ligne de cellules épithéliales bronchiques humaines, BEAS-2 b, est démontré ici. Linéarité de dosage est indiquée sur une plage de concentrations de protéines extrait de cellules entières avec les anticorps p53 et α-tubuline. Un exemple de burnout signal est observé aux concentrations maximales avec longs temps d’exposition, et une courbe de dilution des anticorps α-tubuline est montrée démontrant la saturation. En outre, les résultats expérimentaux exemple sont rapportés pour cellules traités à la doxorubicine en utilisant des paramètres optimisés.

Temps d’exposition - Burnout de signal de détermination
Burnout de signal peut se produire lorsque le substrat luminol et peroxyde est trop vite épuisé. Cela peut être déterminé en examinant les données au temps d’exposition différents chimiluminescence. Dans le logiciel d’analyse, allez dans « Edit – &#62; analyse – &#62; Images ». Les expositions varient de 5 à 480 s. L’axe des ordonnées électrophorégramme rapports signal/heure, donc les données de chaque exposition devraient avoir un coefficient de signal/temps similaire. Ce coefficient diminue avec expositions séquentiellement plus longues si le luminol s’épuise, comme on le voit avec l’anticorps de DO-1 de p53 (Figure 2). En raison de l’appauvrissement du substrat, ce test peut être considéré comme mesurable jusqu'à la concentration de 0,2 µg/µL uniquement à l’exposition de s 5-30. Par conséquent, dans cet exemple, 15 s était déterminé à être le temps d’exposition analyse données optimale pour p53.
Lysat titrage - Déterminer la gamme dynamique linéaire
Il est important que des mesures soient prises au sein de la gamme dynamique linéaire de chaque série de tests, où les changements du signal mesurée par l’aire des pics sont proportionnelles aux changements dans la quantité de protéines dans l’échantillon. En utilisant le temps d’une exposition optimale des 15 candidats choisis s dans la section précédente, test de linéarité est démontrée pour p53 et ɑ-tubuline sur supérieure à une gamme de 15 fois de concentration (Figure 3). Dans notre expérience, une valeur de2 R de &#62; 0,9 d’une régression linéaire s’adapter est jugée acceptable pour une gamme de dilution de protéine purifiée de quantité connue (si le test est une mesure quantitative absolue) ou échantillon de lysat de protéine cible inconnue (si test est une mesure quantitative relative).
Optimisation de la dilution de l’anticorps
En utilisant des anticorps à concentrations saturantes permet de garantir que toute modification du signal mesurée est dues uniquement à l’évolution de la quantité de protéines. Comme une manifestation, deux lignée de cellules BEAS-2 b, extraits de germes entiers (0,2 µg/µL protéine totale chargé dans le test) ont été hybridés avec des concentrations d’anticorps en série dilué ɑ-tubuline allant de 01:25 - 1:800 (Figure 4). Signal par chimiluminescence (ici, mesurée en surface du PIC) a été comploté contre la dilution de l’anticorps. Saturation a été observée près le 01:50 dilution où la courbe commence un plateau perceptible.
Essai expérimental - traitement de la doxorubicine dans les cellules BEAS-2 b
À l’aide de conditions de dosage optimisé, culture de cellules BEAS-2 b a été traitée avec trois concentrations différentes de la doxorubicine (1.2, 1,8 et 2,4 µg/mL) pendant 4 h (Figure 5, tableau 1). Activation de p53 par le biais de modifications post-traductionnelles intervient dans plusieurs réponses cellulaires, y compris l’arrêt du cycle cellulaire, sénescence et apoptose12. Plus précisément, la phosphorylation de la sérine 15 a été attribuée à l’activation transcriptionnelle de p53, ce qui entraîne l’apoptose après doxorubicine traitement13. Dans cette démonstration, ɑ-tubuline normalisé crête domaines sont présentés dans le pli du contrôle. Fait intéressant, de 3,5 à 4 x augmente la phosphorylation de la p53 à sérine augmentations 15 et 2 fois le niveau de la p53 phosphorylés à sérine 20 ont été observées après 4 h d’exposition à la doxorubicine. Ces résultats indiquent l’activation de p53 ; Cependant, aucune relation dose-effet n’est considérée pour les concentrations choisies (à l’inverse, la plus faible dose testée a provoqué la réponse plus haute). P53 total n’a pas démontré une réponse au traitement clair dans ce système de modèle. Nous avons précédemment observé activation de phosphorylation de p53 en l’absence d’augmentation du total p53 dans les mêmes conditions en zinc traités BEAS-2 b cellules14.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig2v3.jpg"> 
Figure 2 . Comparaison d’images de l’exposition pour détecter le signal burnout. Lane vues Voir la baisse des concentrations de protéines de lysats de BEAS-2 b hybridés avec p53-1 anticorps à une dilution de 1/500. Coefficients de signal de chimiluminescence, signalés comme les hauteurs des pics dans le logiciel de l’instrument, sont superposent. Contrairement aux hauteurs de pics, les intensités de bande visuelle sont automatiquement générées et ajustées par l’instrument pour faciliter la visualisation de la banderole et sont pas comparable d’un panneau à l’autre. Noter la baisse de signal de chimiluminescence avec l’augmentation de l’exposition de temps, avec le signal commence à disparaître (split max.) sur les deux expositions plus longues, indiquant l’appauvrissement du substrat. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig2v3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig3v3.jpg"> 
Figure 3 . Lysat titrage montrant les vues de la voie. Lysat titrage montrant la voie des vues (A) de BEAS-2 b lysat avec un 1/500 p53 ɑ-DO-1 ou 01:50-tubuline. Contrairement aux valeurs zone pic, les intensités de bande visuelle sont automatiquement générées et ajustées par l’instrument pour faciliter la visualisation de la banderole et sont pas comparable d’un panneau à l’autre. Analyse de régression linéaire (B) confirme que les dosages sont linéaires sur toute la gamme testée, de 0,01 à 0,20 µg/µL et 0.025 à 0,40 µg/µL, R2 valeurs 0,999 et 0,985, respectivement. Les concentrations de protéine totale dans le milieu de la gamme linéaire ont été choisies pour accueillir les éventuels variation de protéine cible dans les deux sens (par exemple, 0,2 µg/µL pour α-tubuline). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig3v3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig4.jpg"> 
Figure 4 . Dilution des anticorps α-tubuline courbes pour deux lysats de protéines distinctes pour BEAS-2 b avec et sans normalisation de base. Un service précisture de la linéarité est visible dans le 01:50 (0,02) dilution, indiquant la saturation. 01:50 a été donc choisie comme la dilution optimale pour cet anticorps. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig5.jpg"> 
Figure 5. Effet d’un traitement de doxorubicine (DXN) de 4 h sur le total et de la sérine phosphorylée expression de la protéine p53 de cellules BEAS-2 b. Des pics sont normalisées à le α-tubuline et tracées dans le giron de contrôle (CTL). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/55911/55911tbl1.jpg"> 
Tableau 1. Effet du traitement de doxorubicine (DXN) de 4 h sur le total et de la sérine phosphorylée expression de la protéine p53 de cellules BEAS-2 b. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911tbl1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette table.</a>

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Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method

Un test immunologique capillaire-basé utilisant une plate-forme commerciale pour mesurer les protéines cibles des préparations de protéines totales est démontré. En outre, les paramètres de dosage des temps d’exposition et la concentration de protéines et l’affaiblissement de l’anticorps sont optimisés pour un système de modèle de culture cellulaire.

Procédure et des stratégies d’optimisation clés pour un procédé de dosage immunologique axée sur électrophorèse capillaire automatisée

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. ...

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