Name: procedure and key optimization strategies for an automated capillary electrophoretic-based immunoassay method
Uploaded: 2017-09-10T14:00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method at JoVE.com

Forfatterne vil gjerne takke Keith Tarpley av US EPA Office for forskning og utvikling-Research Triangle Park (ORD-RTP) grafikk og medier team for utvikling, taping og redigering av instruksjons-video. Vi vil også takke Deborah Pritchett fra ProteinSimple for nyttig samtaler om optimalisering av våre data. JM Guynn ble støttet av Oak Ridge Institutt for vitenskap og forskning/deltagelse utdanningsprogram på det oss Environmental Protection Agency.

Merk: sikre at alle reagenser og prøver er forberedt ifølge produsenten &#39; s-protokollen, som beskrevet nedenfor. Vennligst bære riktig personlig verneutstyr under denne prosedyren, som inkluderer nitrilhansker, laboratoriefrakk, lukket-toed sko og vernebriller. Spesifikke materialer, reagenser og utstyr som kreves er gitt separat. Totalt protein konsentrasjon av prøvene skal bestemmes på forhånd bruker etablerte metoder som er kompatible med lysate bufferen, som Bradford analysen 11.
 1. forberedelse av prøver og reagenser fra standard pakke som leveres av produsenten <ol><li>å forberede 400 mM arbeidsoppløsning av dithiothreitol (DTT), legge til 40 µL vaskebuffer vannet klart rør som inneholder den levert lager fra produsenten. Det er viktig å unngå å innføre bobler til løsning ved å blande løsningen med sakte og forsiktig pipettering.</li>
	<li>Legge til 20 µL 10 X prøve buffer og 20 µL av forberedt 400 mM DTT løsningen rosa røret med fluorescerende 5 X master mix (se Tabell av materialer). 
	Merk: Master Mix (MM) er forseglet av produsenten med en folie cover og må være gjennomboret av en pipette tips. Bland forsiktig av langsom pipettering å unngå plaske DTT i pipette.</li>
	<li>Deretter legge 16 µL vaskebuffer vann, 2 µL av leveres 10 X prøve buffer og 2 µL av forberedt 400 mM DTT løsningen hvit biotinylated stigen røret leveres av produsenten. Bland forsiktig og overføre til en 0,6 mL tube for denaturing.</li>
	<li>Forberede 0,1 x prøve buffer fortynne de medfølgende 10 X løsning 1: 100 med vann. Forberede nok 0,1 x prøve buffer til å fortynne alle prøvene.</li>
	<li>Beregne mengden 0,1 x prøve buffer som legges til en utvalget, avhenger den endelige ønskede konsentrasjonen av totale protein. Mix 1 del 5 x fluorescerende MM med 4 deler utvannet å oppnå ønsket endelige protein konsentrasjonen.
	<ol><li>Beregn volumer som følger: (i) volum 5 x fluorescerende MM = (ønsket endelige protein konsentrasjon) / 5; (ii) volumet av protein lager = (ønsket endelige protein konsentrasjon x totalvolum nødvendig) / Protein lager konsentrasjon. (iii) volum 0,1 x prøve buffer = totalt volum - 5 x MM volum - Protein lager volum.</li>
	</ol></li></ol> 2. Denaturering av prøver og stigen <ol><li>plass beredt prøver og biotinylated stigen i en 95 ° C varme blokk for 5 min. Vortex rør umiddelbart etter inkubasjon utfører en spinn for ~ 5 s i en tabletop sentrifuge, og sted på ice. 
	Merk: Noen proteiner krever mildere denaturing betingelser (f.eks, 70 o C i 10 min) å hindre protein aggregering og bedre overføring i kapillær matrix. Vurdere dette alternativet hvis det er tung smøre på høyere molekylvekt (se video for eksempel).</li>
</ol> 3. Utarbeidelse av antistoffer <ol><li>som bestemmes av optimalisering (se Representant resultater og video), forberede den ønskede dilution(s) primære antistoff (f.eks 1:50, 1: 100) på det angitte antistoffet Fortynningsmiddel 2. 
	Merk: Antistoffer er vanligvis brukt i høyere konsentrasjoner for kapillær-baserte immunanalyse enn for tradisjonelle vestlige blotting. Medfølgende sekundære antistoffer er klar til bruk uten fortynning.</li>
</ol> 4. Utarbeidelse av Luminol-S og Peroxide <ol><li>forberede en 1:1 blanding av luminol-S og peroxide.</li>
	<li>Vortex å blande og lagre på ice. 
	Merk: Det er viktig at denne blandingen er forberedt fersk hver eksperimentelle analysen. 250ul totale blanding er nødvendig for å kjøre en full plate.</li>
</ol> 5. Forberedelse av analysen plate <ol><li>som vist i figur 1, laste prøver og reagenser utarbeidet over inn i analysen plate. Se detaljerte instruksjoner nedenfor for hver rad. For å minimere fordampning fra brønnene, sikre at platen lokket erstattes mellom reagens tillegg.</li>
	<li>i raden A, Pipetter 5 µL av Biotinylated stige til godt A1. For raden gjenværende Pipetter utarbeidet prøver (5 µL hver) i brønner A2-A25. 
	Merk: Det er viktig at A1 inneholder også alltid stigen, som den første kapillær i kassetten er optimalisert for kjøring av denne standarden.</li>
	<li>i raden B Pipetter 10 µL av antistoff fortynningsmiddel 2 i hver brønn (B1-B25).</li>
	<li>i rad C, Pipetter 10 µL av antistoff fortynningsmiddel 2 i godt C1. I raden gjenværende C brønner, Pipetter 10 µL primære antistoff (wells C2-C25).</li>
	<li>i p D, Pipetter 10 µL av Streptavidin-HRP godt D1. I raden gjenværende D brønner, Pipetter 10 µL sekundære antistoff (wells D2-D25).</li>
	<li>i raden E, Pipetter 10 µL av ferskt tilberedte luminol-peroxide blandingen i hver brønn (E1-E25).</li>
	<li>Til slutt legger 500 µL vaskebuffer hver avdeling hver topp 3 radene av bufferen. 
	Merk: Det er viktig å minimere boble dannelsen av pipettering forsiktig og ikke utviste det siste bindet fra spissen som bobler kan forstyrre av kapillær laste og kjøre.</li>
	<li>Når alle brønnene er lastet, sentrifuge plate ~ 1000 x g i 5 minutter ved romtemperatur Fjern bobler og sikre væsken i bunnen av brønnene. Pop synlig bobler med en liten pipette tips eller ren nål (f.eks, 25 gauge sterilt &#34; rep toppen &#34; p).</li>
</ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig1.jpg" /> figur 1 . Pipettering mal for analysen plate. Fargekoding representerer riktig reagenser og prøver (opptil 24 totalt) lagt til analysen plate. Legg biotinylated stige til godt A1 (oransje), utarbeidet prøver fra brønner A2 til A25 (lys blå), antistoff fortynningsmiddel 2 brønner B1-B25 og C1 (lys grønn), primære antistoff brønner C2 til C25 (blå), streptavidin-HRP til godt D1 (mørk rosa), sekundær antistoff brønnene D2 til D25 (mørk grønn), og luminol-peroxide blanding brønner E1 til E25 (lilla). Vaskebuffer legges til de tre første radene av større midten av tallerkenen brønner (mørk blå). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig1large.jpg" target="_blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
 6. starte kapillær immunanalyse instrumentet <ol><li>Kontroller at instrumentet og tilhørende datamaskinen er slått på. Ingen varme opp tid kreves.</li>
	<li>Åpne instrumentation-programvaren på datamaskinen. Velg først den &#34; analysen &#34; fanen til høyre i vinduet og &#34; nye analysen &#34; under den &#34; filmenyen &#34; til venstre. Velg størrelse, størrelse utvalg (f.eks, 12-230 kDa) og patron type (f.eks, 25 kapillær) som ble brukt for bestemt analysen. 
	Merk: En mai også inngang analysen parametere, inkludert protein konsentrasjon og antistoff type fortynning, hvis ønskelig, men dette er ikke nødvendig å starte analysen.</li>
	<li>Åpne døren til apparatet ved å trykke på knappen på toppen av oransje panelet.</li>
	<li>Forsiktig fjerne kapillær kassetten ut av emballasjen. Uten å berøre glass kapillærene plasser, kassetten i patronholderen. Kontroller blekkpatronen sitteplasser ved å observere interiør lyset endres fra oransje til blå.</li>
	<li>Hold platen på benken og skrelle nøye av fordampning segl fra nedre del av platen. Pop noen bobler i disse separasjon matrix brønner med en smalle Pipetter tips eller ren nål (f.eks, 25 gauge sterilt &#34; rep toppen &#34; p).</li>
	<li>Plasser analysen platen på plate innehaveren, sikrer den sitter, og stenge instrumentet.</li>
	<li>Klikk på &#34; Start &#34;-knappen i programvaren. 
	Merk: Hvis ingen Start-knappen, tilkoblingen med maskinen er gått tapt. Velg Instrument fra venstre menyen øverst, deretter koble. Et popup-vindu vises med med maskinens serienummer; Velg dette alternativet og deretter koble. Startknappen skal nå vises.</li>
	<li>Når fullført, kast platen. Fjern kassetten og plasser i en beholder for deponering, sammen med noen pinne som kan ha blitt brukt til pop bobler. La strømmen på å unngå tilkoblingsproblemer Hvis apparatet brukes regelmessig (f.eks minst ukentlig).</li>
</ol> 7. Eksperimentere analyse <ol><li>før analyse, må du kontrollere følgende kvalitetskontroller utføres.
	<ol><li>Bekreft fluorescerende standarder ved å velge den &#34; Vis standarder &#34; ikonet. Kontroller at standarder er riktig angitt i den &#34; Ressursdiagram &#34; kategorien. Hvis de er feil, gå til det &#34; enkeltvisning &#34; ikon, høyreklikk på riktig toppen, og velg &#34; Force Standard &#34;, eller høyreklikk på feil toppen og velg &#34; ikke en Standard &#34;. Kontrollere dette for hver nye kapillær.</li>
		<li>Kontroller biotinylated stigen ved å klikke på den &#34; prøver &#34; og &#34; enkeltvisning &#34; ikoner. Velg stigen i kategorien eksperiment. Hvis en topp er feil identifisert, høyreklikk på den i &#34; Ressursdiagram &#34; og velg &#34; fjerne topp &#34;. 
		Merk: For eksempel biotinylated stigen brukes for 12-230 kDa kit bør vise 12, 40, 66, 116, 180 og 230 kDa størrelse topper. Hvis dette trinnet ikke er utført, dimensjonering av prøven toppene skal beregnes feil, falske resultater.</li>
		<li>Visning og analysere eksempel topper. Henter dataene fra tabellen topper, inkludert molekylvekt, peak området, topp høyde og signal til støy (S/N), behov for eksperimentell beregninger.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bradley, H. L., Sabnis, H., Pritchett, D., Bunting, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hematopoietic stem cell protocols. 1185, (2014).</li><li>Guo, L., Eldridge, S., Furniss, M., Mussio, J., Davis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+(hiPSC-CMs)+to+Monitor+Compound+Effects+on+Cardiac+Myocyte+Signaling+Pathways.">Use of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes (hiPSC-CMs) to Monitor Compound Effects on Cardiac Myocyte Signaling Pathways.</a> Curr Protoc Chem Biol. 7 (3), 141-185 (2015).</li><li>Chen, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantitation+of+endogenous+proteins+with+precision+and+accuracy+using+a+capillary+Western+system.">Absolute quantitation of endogenous proteins with precision and accuracy using a capillary Western system.</a> Anal Biochem. 442 (1), 97-103 (2013).</li><li>Chen, J. Q., Wakefield, L. M., Goldstein, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+nano-immunoassays:+advancing+quantitative+proteomics+analysis,+biomarker+assessment,+and+molecular+diagnostics.">Capillary nano-immunoassays: advancing quantitative proteomics analysis, biomarker assessment, and molecular diagnostics.</a> J Transl Med. 13, 182 (2015).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Application+of+a+Novel+Nanovolume+Capillary+Electrophoresis-+Based+Protein+Analysis+System+in+Personalized+&amp;+Translational+Medicine+Research.">The Application of a Novel Nanovolume Capillary Electrophoresis- Based Protein Analysis System in Personalized &amp; Translational Medicine Research.</a> J Bioanal Biomed. S3 (004), (2013).</li><li>ProteinSimple Western. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Size Assay Development Guide, Revision 1. , (2014).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+modern+quantitative+fluorescent+western+blotting+with+troubleshooting+strategies.">A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies.</a> J Vis Exp. (93), (2014).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western++blotting:+sample+preparation+to+detection.">Western blotting: sample preparation to detection.</a> J Vis Exp. (44), (2010).</li><li>Silva, J. M., McMahon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fastest+Western+in+town:+a+contemporary+twist+on+the+classic+Western+blot+analysis.">The fastest Western in town: a contemporary twist on the classic Western blot analysis.</a> J Vis Exp. (84), e51149 (2014).</li><li>Thorn, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin+pathways:+pharmacodynamics+and+adverse+effects.">Doxorubicin pathways: pharmacodynamics and adverse effects.</a> Pharmacogenet Genomics. 21 (7), 440-446 (2011).</li><li>Ernst, O., Zor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linearization+of+the+bradford+protein+assay.">Linearization of the bradford protein assay.</a> J Vis Exp. (38), (2010).</li><li>Taira, N., Yoshida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+of+p53+tumor+suppressor:+determinants+of+its+functional+targets.">Post-translational modifications of p53 tumor suppressor: determinants of its functional targets.</a> Histol Histopathol. 27 (4), 437-443 (2012).</li><li>Thompson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+p53+on+key+serines+is+dispensable+for+transcriptional+activation+and+apoptosis.">Phosphorylation of p53 on key serines is dispensable for transcriptional activation and apoptosis.</a> J Biol Chem. 279 (51), 53015-53022 (2004).</li><li>Currier, J. M., Cheng, W. Y., Menendez, D., Conolly, R., Chorley, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+Gene+Biomarker+at+the+Tipping+Point+of+Adaptive+and+Adverse+Responses+in+Human+Bronchial+Epithelial+Cells.">Developing a Gene Biomarker at the Tipping Point of Adaptive and Adverse Responses in Human Bronchial Epithelial Cells.</a> PLoS One. 11 (5), e0155875 (2016).</li><li>Moser, A. C., Hage, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+electrophoresis-based+immunoassays:+principles+and+quantitative+applications.">Capillary electrophoresis-based immunoassays: principles and quantitative applications.</a> Electrophoresis. 29 (16), 3279-3295 (2008).</li><li>Shintani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Capillary Electrophoresis Applications. , (1997).</li><li>. Wes reagents and consumables :: ProteinSimple Available from: <a target="_blank" href="https://www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html">https://www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html</a> (2017)</li></ol>

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser. Dette manuskriptet er gjennomgått av nasjonale helse- og miljømessige effekter Research Laboratory og godkjent for publisering. Innholdet gjenspeiler ikke nødvendigvis synspunktene til de amerikanske EPA heller utgjør omtale av varemerker eller kommersielle produkter godkjennelse eller anbefaling for bruk.

I flere tiår, det har vært vedvarende interesse for utvikling av kapillær electrophoretic-baserte immunanalyse metoder på grunn av lav prøven og reagens utgifter, redusert behandling tid sammenlignet med tradisjonelle metoder, og høy kompatibilitet for automatisere prosedyre4,15. Det finnes en rekke forskjellige protokoller for separasjon av proteiner som har benyttet kapillærene, inkludert electrophoretic, electrokinetic, polymer sikting og isoelectric metoder, som isolerer proteiner av forskjellige egenskaper (henholdsvis, elektrostatisk belastning, partisjon likevekt, sikting egenskaper skiller matrise og pH)16. Her beskriver vi et antistoff-basert (eller immunanalyse) kapillært elektroforesemetode, ved hjelp av en polymer sikting separasjon, som er blitt automatisert og kommersielt vedtatt3. Fordelene med dette systemet inkluderer brukervennlighet og drift, standardisert og kommersielt tilgjengelig reagenser, og pålitelig, følsom målinger som krever mindre reagens og prøver i forhold til tradisjonelle protein analyser som western blot, enzym knyttet immunanalyse og andre formater3,4,5. Det har vært nevnt i forrige vurderinger av denne teknologien at størrelsen dataområdet protein som kan vurderes har vært begrenset av tilgjengelig separasjon matrix4, men siste offer har utvidet den målbare varierer fra 2 til 440 kDa17 . Dessuten, må noen lysate buffere er kjent for å være kompatibel med analysen18, derfor utvalg av eksperimentelle reagensene brukes vurderes på forhånd.
En stor fordel med en automatisert prosedyre med kommersielt tilgjengelige komponentene er konsistensen av resultater gjennom standardiserte metoder og reagenser. Dette minimerer sjansen for analysen feil ved å automatisere kritiske trinn i prosedyren. Det er imidlertid viktig å merke seg at enkelte praksis må følges under protokollen for å minimere problemer med kapillær electrophoretic-baserte immunanalyse. Først er det avgjørende at luminol-S/peroxide blandingen er forberedt friskt og umiddelbart før platen lasting. Konsekvent timing fører konsistent luminescence når den oksiderende agenten er lagt til, som vil resultere i konsekvent mål for en bestemt antistoff analysen etter analysen. Videre er det viktig at ikke utløpt reagenser blir brukt, som hovedsakelig påvirker styrken av oksiderende agent. I tillegg er det viktig at lasting rekkefølgen av prøver, antistoffer og andre følges strengt (se figur 1). Eventuelle reagens pipetted malplassert vil føre analysen feil og bortkastet kjøre.
Foruten fremgangsmåten kritiske kan primære problemer med teknikken generelt bli overvunnet gjennom optimalisering. Faktisk disse betingelsene gjelder for hver modell system/antistoff kombinasjon, og derfor bør fastsettes empirisk for hver nye analysen. I denne artikkelen vi fokusere på tre vanlige optimering prosedyrer: eksponeringstid, lysate titrering og primære antistoff fortynning. Muligheten til å generere målbare resultater, avhengig av analyse av en eksponeringstid når luminol underlaget ikke raskt tømmes, som substrat uttømming resulterer i tap av signal. Lysate titrering bestemmer lineær dynamiske område hver analysen, som kan variere med ulike modellsystemer, samt ulike antistoffer, selv for samme protein målet. Antistoff fortynninger valgt på eller nær mette konsentrasjoner Kontroller endringer i signal ikke påvirkes av mangel på gratis antistoff, men bare av ulik mengde tilgjengelig protein målet epitope. Andre hensyn under optimaliseringsprosessen kan være antistoff inkubasjon tid og stabling/sample lastetiden. I de fleste tilfeller tilbyr standardinnstillingene for instrumentet den beste balansen mellom oppløsning og følsomhet. Men i noen tilfeller kan dårlig oppløsning eller følsomhet forbedres ved å justere disse parameterne.
Kapillær electrophoretic-baserte immunanalyse metoder gir rask, effektiv og reproduserbar protein målinger. Mens disse metodene har hovedsakelig blitt benyttet i forskning og utvikling, har konsistensen av disse teknologiene potensielle verktøy i regulatoriske og kliniske applikasjoner. Identifikasjonen av utsatt subpopulasjoner miljømessige giftstoffer eller pasienter med progresjon av sykdommen kan for eksempel være basert på protein biomarkers målt i tilgjengelig matriser, som blod, urin og spytt. Reagens og operasjonen kostnader slippe og antall prøver og mål som kan samtidig vurdert øker, vil vi trolig se kapillær electrophoretic-baserte immunanalyse metodene som brukes for disse typer programmer.

Kapillær electrophoretic immunanalyser måle protein uttrykk i cellen lysates bruker størrelse eller belaste separasjonssystemer og gir flere fordeler sammenlignet med tradisjonelle immunanalyser. For eksempel sammenlignet med western blot, automatisert kapillær-baserte prosedyren eliminerer behovet for geleer, overføring enheter, og manuell vasker. I tillegg, er den absolutte mengden protein kreves ca 10 ganger mindre, gjør kapillær-baserte ideell for bruk med sjeldne celletyper eller begrenset utvalg1,2. Resultater er oppnådd i så lite som 3 h bruker automatiserte systemer og har tidligere vist seg for å være mer kvantitative og reproduserbar enn konvensjonelle western blot prosedyrer3,4,5. Prosessen for størrelse-baserte analyser består av lasting prøver som inneholder natrium dodecyl sulfate (SDS), dithiothreitol (DTT), og fluorescently merket molekylvekt markører i kapillær kolonner som inneholder stabling og separasjon matriser. Spenning på kapillærene skiller proteinene i prøvene etter størrelse, og UV lys immobilizes atskilt proteiner til kapillær veggen. Av kapillær er da immuno-analysert med mål-spesifikke primære antistoff og pepperrot peroxidase (HRP)-konjugert sekundære antistoff. Luminol og peroxide katalysere chemiluminescent lys generasjon som er målt ved en kostnad kombinert enhet (CCD) kamera og analysert for å quantitate protein.
Til tross for den relative lette og hastigheten på en automatisert kapillær-baserte electrophoretic immunanalyse plattform er optimalisering av analysen forhold som protein konsentrasjon og antistoff fortynning eksponeringstid viktig for å oppnå nøyaktig, reproduserbare resultater. Generelt bør følgende fremgangsmåter utføres for å optimalisere en analyse for disse systemene:
1) en skjerm skal utføres for å evaluere og velge antistoffer for signal og spesifisitet protein målet. Hvis tilgjengelig, kan renset protein eller målet epitope brukes til å vurdere spesifisitet; Det er imidlertid fortsatt viktig å vurdere potensielle uspesifisert signal i totale protein fra modellen systemet.
2) deretter skal dynamikkområdet til analysen bestemmes. I en ideell situasjon, er signalet dobling (målt ved hjelp av peak området) observert som eksempel konsentrasjon er doblet; men i praksis er en proporsjonal endring i signal å input på en forutsigbar måte (f.ekslineær passer) tilstrekkelig for protein kvantifisering. I tillegg definerer optimeringen protein konsentrasjon med høy signal, men fortsatt innenfor lineær område for eksperimentell modell.
3) bestemme den optimale antistoff konsentrasjonen med fast protein konsentrasjonen valgt i optimalisering trinn 2. Som antistoff konsentrasjonen øker, øker signalet til det flyer på metning. Et antistoff konsentrasjon nær denne fargemetning kreves for nøyaktig måling av protein konsentrasjon.
Prosessen som brukes til å optimalisere protein konsentrasjoner og antistoff fortynninger eksponeringstider for en automatisert kapillær-baserte størrelse analysen6 demonstreres bruke hele cellen utdrag isolert fra BEAS-2B, et SV-40 forvandlet menneske bronkial tarmepitelet linje. Protein isolert fra cellen eller vev utdrag utføres med en rekke publiserte protokoller7,8,9 og vil ikke bli dekket her. Resultatene av en prøve eksperimentere med optimalisert forholdene også rapportert totalt og fosforylert (serine 15, serine 20) p53 i kulturer utsatt for doksorubicin (en felles chemotherapeutic agent som induserer celle apoptose10) i 1.2, 1.8, og 2.4 µg/mL medier for 4 h før innhøsting. P53 toppen områdene blir normalisert til ɑ-tubulin, som brukes som en lasting.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Wes instrument</td>
			<td>ProteinSimple (Santa Clara, CA)</td>
			<td>004-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P53 DO-1 primary antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td>
			<td>sc-126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphorylated p53 (ser 15) primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphorylated p53 (ser 20) primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha-tubulin primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3873</td>
			<td>used as a loading control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compass Software</td>
			<td>ProteinSimple (Santa Clara, CA)</td>
			<td></td>
			<td>provided with the Wes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-230 kDa Master kit</td>
			<td>ProteinSimple (Santa Clara, CA)&#160;</td>
			<td>PS MK02 (since replaced by a new kit #)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html</td>
			<td>INCLUDES PART NO: 
			Wash Buffer (60 mL) 042-202 
			10X Sample Buffer (440 &#956;L) 042-195 
			Pre-Filled Microplates (8) PS-PP01 
			Capillary Cartridges (8) PS-CC01 
			Antibody Diluent II (20 mL) 042-203 
			Luminol-S (1.5 mL) 042-233 
			Peroxide (1.5 mL) 042-234 
			Streptavidin-HRP (132 &#956;L) 042-414 
			Standard Pack (8): Biotinylated ladder, fluorescent 5X master mix, DTT, and empty 0.6 mL tube PS-ST01 
			Anti-Rabbit Secondary Antibody 042-206 
			or 
			Anti-Mouse Secondary Antibody 042-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name&#160;</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Cell culture, treatment, and harvest (using vendor recommended protocols; protocols not included in manuscript)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEAS-2B cells</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA)</td>
			<td>CRL-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>keratinocyte growth medium, KGM Gold</td>
			<td>Lonza Ltd (Basel, Switzerland)</td>
			<td>192152</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>keratinocyte basal medium, KBM Gold</td>
			<td>Lonza Ltd (Basel, Switzerland)</td>
			<td>192151</td>
			<td>serum free medium for chemical dosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>doxorubicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>D1515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Blue Bradford Assays</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td>
			<td>23200</td>
			<td>for protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Extract kit</td>
			<td>Active Motif (Carlsbad, CA)</td>
			<td>D1515</td>
			<td>used to prepare whole cell lysates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>INCLUDES:</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Lysis Buffer AM1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1M dithiothreitol (DTT)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10X PBS&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Phosphatase Inhibitors</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

procedure and key optimization strategies for an automated capillary electrophoretic-based immunoassay method

Ny teknologi som utnytter kapillær-baserte immunanalyser lover raskere og mer kvantitativ protein vurdering sammenlignet med tradisjonelle immunanalyser. Imidlertid ligner andre antistoff-basert protein analyser, optimalisering av kapillær-baserte immunanalyse parametere, for eksempel protein konsentrasjon og antistoff fortynning eksponeringstid er en viktig forutsetning for generering av meningsfull og pålitelig data. Mål må falle innenfor den lineære analysen der endringer i signalet er direkte proporsjonal med endringer i lysate konsentrasjon. Prosessen med å velge riktig lysate konsentrasjoner og antistoff fortynninger eksponeringstider i human bronkial epithelial celle linjen BEAS-2B er vist her. Analysen linearitet vises over en rekke hele cellen ekstra protein konsentrasjoner med p53 og α-tubulin antistoffer. Et eksempel på signalet burnout er sett på de høyeste konsentrasjonene med lange eksponeringstider, og en α-tubulin antistoff fortynning kurve vises demonstrere metning. I tillegg rapporteres eksempel eksperimentelle resultatene for doksorubicin-behandlet celler med optimalisert parameterne.

Eksponeringstid - Determining signal utbrenthet
Signalet burnout kan oppstå når luminol og peroxide underlaget er oppbrukt for fort. Dette kan bestemmes ved å undersøke dataene på forskjellige chemiluminescence eksponeringstider. I analyseprogramvare, gå til "Rediger - &#62; analyse - &#62; bilder". Eksponeringer varierer fra 5 til 480 s. Y-aksen i et electropherogram rapporter signal/tid, så dataene fra hver eksponering bør ha en lignende signal/klokkeslett koeffisient. Denne koeffisienten avtar med sekvensielt han hvis luminol blir tømt, som sett med p53-1 antistoffer (figur 2). På grunn av underlaget utarming, kan denne analysen betraktes målbare opp 0,2 µg/µL konsentrasjonen bare for de 5-30 s eksponeringene. Derfor, i dette eksemplet 15 s ble identifisert som optimale data analyse eksponeringstid for p53.
Lysate titrering - Bestemme lineær dynamikkområdet
Det er viktig at målinger tas innen lineær dynamiske hver analysen, der endringer i signal målt ved peak området er proporsjonal med endringer i protein i utvalget. Med optimal eksponeringstid av 15 s valgte i den forrige delen, analysen linearitet er vist for både p53 og ɑ-tubulin over større enn en 15-fold rekke konsentrasjon (Figur 3). I vår erfaring,2 verdien R &#62; 0.9 av en lineær regresjon passer anses akseptabelt for en fortynning rekke renset protein kjent antall (hvis analysen er en absolutt kvantitativ måling) eller prøve lysate ukjent målet protein (hvis analysen er en relativ kvantitativ måling).
Optimalisering av antistoff fortynning
Bruker antistoffer mette konsentrasjoner bidrar til å sikre at signalet endringer målt er bare på grunn av endringer i protein beløpet. Som en demonstrasjon, to BEAS-2B celle linje hele cellen ekstrakter (0,2 µg/µL totale protein inn i analysen) ble undersøkt med serielt utvannet ɑ-tubulin antistoff konsentrasjonene varierer fra 1:25 - 1:800 (Figur 4). Chemiluminescent signalet (her, målt som peak området) var plottet mot antistoff fortynning. Metning ble observert i 1:50 fortynning der kurven begynner en merkbar platå.
Eksperimentell prøve - doksorubicin behandling i BEAS-2B celler
Bruker optimalisert analysen forhold, BEAS-2B cellekultur ble behandlet med tre ulike konsentrasjoner av doksorubicin (1.2, 1,8 og 2,4 µg/mL) 4 h (figur 5, tabell 1). Aktivering av p53 post-translasjonell Brisco formidler flere mobilnettet tiltak, inkludert celle syklus arrestasjon, senescence og apoptose12. Spesielt er fosforylering av serine 15 blitt tilskrevet transcriptional aktivering av p53, noe som resulterer i apoptose etter doksorubicin behandling13. I denne demonstrasjonen, ɑ-tubulin normalisert peak områder presenteres som fold av kontroll. Interessant, 3,5 til 4-fold øker i p53 fosforylering på serine 15 og 2-fold økning i nivået av p53 fosforylert på serine 20 ble observert etter 4t eksponering for doksorubicin. Disse resultatene indikerer aktivering av p53; men ingen dose-respons er sett for konsentrasjonen valgt (omvendt, den laveste dosen testet elicited høyeste svaret). Totalt p53 vise ikke en klar behandlingsrespons i modellsystem. Vi har tidligere observert aktivering av p53 fosforylering i fravær av økte nivåer av totalt p53 under samme forhold i sink-behandlet BEAS-2B celler14.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig2v3.jpg"> 
Figur 2 . Eksponering bilde sammenligning å oppdage signal utbrenthet. Lane visninger Vis redusere protein konsentrasjoner for BEAS-2B lysates analysert med p53-1 antistoff på en 1:500 fortynning. Chemiluminescence signalet koeffisienter, som topp høyder i instrument-programmet er lagt. I motsetning til toppen høydene, visuell bandet intensiteten automatisk generert og justert av instrumentet å hjelpe visning av band og er ikke sammenlignbare fra ett panel til et annet. Merk nedgangen i chemiluminescence signalet som eksponering tid øker, med signalet begynner å forsvinne (delt peak) på de to lengste eksponeringene, indikerer substrat uttømming. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig2v3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig3v3.jpg"> 
Figur 3 . Lysate titrering viser visningene lane. Lysate titrering viser kjørefelt visninger (A) av BEAS-2B lysate da analysert med 1:500 p53 og tubulin-1 eller 1:50 ɑ. I motsetning til peak området verdier visuelle bandet intensiteten automatisk generert og justert av instrumentet å hjelpe visning av band og er ikke sammenlignbare fra ett panel til et annet. Lineær regresjonsanalyse (B) bekrefter analyser er lineær over hele området testet, 0,01 0,20 µg/µL og 0.025 til 0.40 µg/µL, med R2 verdiene 0.999 og 0.985, henholdsvis. Totalt protein konsentrasjoner midt i lineær området ble valgt til potensielle mål protein variasjon i begge retninger (f.eks, 0,2 µg/µL for α-tubulin). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig3v3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig4.jpg"> 
Figur 4 . Α-tubulin antistoff fortynning kurver for to separate BEAS-2B protein lysates med og uten baseline normalisering. En bestemt deparTure fra linearitet er sett på 1:50 (0,02) fortynning, indikerer metning. 1:50 ble derfor valgt som den optimale fortynning for denne antistoff. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig5.jpg"> 
Figur 5. Effekten av 4 h doksorubicin (DXN) behandling på totalt og serine fosforylert p53 protein uttrykk celleområde BEAS-2B. Topp områder er normalisert til α-tubulin og plottet som fold kontroll (CTL). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/55911/55911tbl1.jpg"> 
Tabell 1. Effekten av 4 h doksorubicin (DXN) behandling på totalt og serine fosforylert p53 protein uttrykk celleområde BEAS-2B. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911tbl1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method at JoVE.com

Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method

En kapillær-baserte immunanalyse med en kommersiell plattform for å måle mål proteiner fra total protein forberedelser er demonstrert. I tillegg er analysen parametere eksponeringstid, protein konsentrasjon og antistoff fortynning optimalisert for en celle kultur modell-systemet.

Prosedyre og viktige optimalisering strategier for en automatisert kapillær Electrophoretic-baserte immunanalyse metode

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Optimization of the Ugi Reaction Using Parallel Synthesis and Automated Liquid Handling

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described.  Triplicate runs ...

Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay Testing Methodology and Troubleshooting

To ensure the quality of animal models used in biomedical research we have developed a number of diagnostic testing strategies and methods to determine if ...

Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies

In the biological sciences there have been technological advances that catapult the discipline into golden ages of discovery. For example, the field of ...

Spatial Multiobjective Optimization of Agricultural Conservation Practices using a SWAT Model and an Evolutionary Algorithm

Spatial Multiobjective Optimalisering av Agricultural Conservation Practices ved hjelp av en SWAT Modell og en evolusjonær algoritme

Finding the cost-efficient (i.e., lowest-cost) ways of targeting conservation practice investments for the achievement of specific water quality goals ...

LeafJ: An ImageJ Plugin for Semi-automated Leaf Shape Measurement

LeafJ: En ImageJ Plugin for Semi-automatisk Leaf Shape Måling

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the ...

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

En innovativ metode for Exosome Kvantifisering og størrelse måling

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...