Name: procedure and key optimization strategies for an automated capillary electrophoretic-based immunoassay method
Uploaded: 2017-09-10T14:00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method at JoVE.com

Os autores gostaria de agradecer Keith Tarpley nos EPA escritório da equipe de pesquisa e desenvolvimento-Research Triangle Park (ORD-RTP) gráfico e mídia para o desenvolvimento, gravação e edição de vídeo instrucional. Também gostaríamos de agradecer a Deborah Pritchett de ProteinSimple útil conversas sobre otimização de nossos dados,. JM Guynn foi apoiado pelo Instituto de Oak Ridge para ciência e educação programa de pesquisa/participação nos Environmental Protection Agency.

Nota: Certifique-se de que todos os reagentes e amostras são preparadas de acordo com o fabricante &#39; protocolo de s, descrito abaixo. Por favor, use equipamento de proteção pessoal adequada durante este procedimento, que inclui luvas de nitrilo, jaleco, sapatos fechados e óculos de segurança. Uma tabela de materiais específicos, reagentes e equipamentos necessários é fornecida separadamente. Concentração de proteínas totais das amostras deve ser determinada previamente usando metodologias estabelecidas que são compatíveis com o lisado buffer usado, tais como o ensaio de Bradford 11.
 1. preparação de amostras e reagentes o pacote padrão, como fornecido pelo fabricante <ol><li>para preparar a solução de trabalho de 400 milímetros de ditiotreitol (DTT), adicionar 40 µ l de água deionizada água para o tubo transparente que contém o fornecido pelo estoque do fabricante. É importante evitar a introdução de bolhas para a solução, misturando a solução com lenta e suave pipetagem.</li>
	Amortecedor da amostra <li>Adicionar 20 µ. L 10x e 20 µ l da solução preparada 400 mM DTT ao tubo rosa contendo fluorescente 5 X master mix (veja a Tabela de materiais). 
	Nota: O Master Mix (MM) é selada pelo fabricante com uma tampa de folha e deve ser perfurado por uma ponta da pipeta. Misture suavemente pipetando lento para evitar salpicos TDT na pipeta.</li>
	<li>, Em seguida, adicione 16 água µ l de água deionizada, 2 µ l de fornecido 10 X amortecedor da amostra e 2 µ l da solução preparada 400 mM DTT ao biotinylated branco escada tubo fornecido pelo fabricante. Misture delicadamente e transfira para um tubo de 0,6 mL de desnaturação.</li>
	<li>Preparar 0,1 x amortecedor da amostra diluindo o fornecido 10 X solução 1: 100 com água. Preparar o suficiente 0.1 x amortecedor da amostra para diluir as amostras.</li>
	<li>Calcular a quantidade de tampão de amostra x 0.1 é adicionado a uma amostra, o que dependerá da concentração final desejada da proteína total. Misturar 1 parte 5 x fluorescente MM com 4 peças diluído amostra para obter a concentração de proteína final desejada.
	<ol><li>Calcular volumes da seguinte forma: (i) Volume 5 x fluorescente MM = (concentração de proteína final desejado) / 5; (ii) volume de estoque de proteína = (concentração de proteína final desejado x volume Total necessário) / proteína estoque concentração; (iii) volume 0,1 x amortecedor da amostra = volume Total - 5 x volume de MM - proteína estoque volume.</li>
	</ol></li></ol> 2. Desnaturação de amostras e escada <ol><li>lugar preparado amostras e biotinilado escada em um bloco de calor de 95 ° C para os tubos de vórtice de 5 min. imediatamente após a incubação, executar um giro por ~ 5 s em uma centrífuga de mesa e um lugar na Ice. 
	Nota: Algumas proteínas podem exigir condições de desnaturação mais suaves (por exemplo, 70 o C por 10 min) para prevenir a agregação da proteína e melhorar a migração na matriz capilar. Considere essa opção se houver manchas pesadas no mais alto peso molecular (Veja o vídeo por exemplo).</li>
</ol> 3. Preparação de anticorpos <ol><li>, conforme determinado pela otimização (ver Resultados de representante e vídeo), preparar o dilution(s) desejado do anticorpo primário (por exemplo, 01:50, 1: 100) no anticorpo fornecido 2 diluente. 
	Nota: Os anticorpos são geralmente utilizados em altas concentrações para imunoensaio capilar-baseado do que para a mancha ocidental tradicional. O anticorpo secundário fornecido está pronto para usar sem diluição.</li>
</ol> 4. Preparação de S de Luminol e peróxido de <ol><li>preparar uma mistura 1:1 de S de luminol e peróxido de.</li>
	<li>Vortex para misturar e armazenar na Ice. 
	Nota: É importante que esta mistura está preparada fresco para cada ensaio experimental. 250ul mistura total é necessária para executar um prato cheio.</li>
</ol> 5. Preparação da placa de ensaio <ol><li>, como mostrado na Figura 1, carregar as amostras e reagentes preparados acima na placa de ensaio. Consulte as instruções detalhadas abaixo para cada linha. Para minimizar a evaporação dos poços, certifique-se de que a tampa da placa é substituída entre adições reagente.</li>
	<li>Na linha A, pipetar 5 µ l de Biotinylated escada no poço A1. Para a linha restante, pipetar preparou amostras (5 µ l cada) em poços A2-A25. 
	Nota: É imperativo que o A1 contém bem sempre a escada, como o primeiro capilar no cartucho é otimizado para a execução desta norma.</li>
	<li>Na linha B, pipeta de 10 µ l de diluente 2 anticorpo em cada poço (B1-B25).</li>
	<li>Na linha C, pipetar 10 µ l de diluente 2 anticorpo em C1 bem. Na linha restante C poços, pipetar 10 µ l de anticorpo primário (poços C2-C25).</li>
	<li>Na linha D, pipetar 10 µ l de Streptavidin HRP em D1 bem. Na linha restante poços D, pipetar 10 µ l de anticorpo secundário (poços D2-D25).</li>
	<li>Em linha E, pipetar 10 µ l da mistura preparada na hora luminol-peróxido em cada poço (E1-E25).</li>
	<li>Finalmente, adicionar o tampão de lavagem 500 µ l por compartimento para cada uma das 3 principais linhas dos poços reserva. 
	Nota: É importante minimizar a formação de bolhas por pipetagem suavemente e não expulsando o volume final da ponta como bolhas podem interferir com o capilar de carregar e executar.</li>
	<li>, Uma vez que todos os poços são carregados, centrifugar a placa a ~ 1000 x g por 5 min à temperatura ambiente para remover bolhas e garantir que o líquido é no fundo dos poços. Pop qualquer visíveis bolhas com uma agulha limpa ou ponta da pipeta pequena (por exemplo, calibre 25 estéril &#34; top rep &#34; agulha).</li>
</ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig1.jpg" /> Figura 1 . Modelo para a placa de ensaio de pipetagem. A codificação de cores representa adequados reagentes e amostras (total até 24) adicionadas à placa de ensaio. Adicionar biotinilado escada para poço A1 (laranja), preparou amostras de poços A2 até A25 (azul claro), anticorpo diluente 2 poços B25-B1 e C1 (verde claro), anticorpo primário para poços C2 até C25 (azul), streptavidin-HRP para bem D1 (rosa escuro), anticorpo secundário para poços de D2 até D25 (verde escuro) e mistura de luminol-peróxido de poços E1 até E25 (roxo). Tampão de lavagem é adicionado para as três primeiras fileiras da placa mid maior poços (azul escuro). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig1large.jpg" target="_blank"> clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
 6. começando o instrumento capilar imunoensaio <ol><li>certifique-se de que o instrumento e o computador que acompanha são ativados. Não aquecer o tempo é necessário.</li>
	<li>Abra o software de instrumentação no computador. Primeiro, selecione o &#34; ensaio &#34; guia no canto direito da janela e &#34; novo ensaio &#34; sob o &#34; Menu arquivo &#34; à esquerda. Selecione o tamanho e escala do tamanho (por exemplo, 12-230 kDa) cartucho tipo (por exemplo, 25 capilar) que foi usado para o ensaio especial. 
	Nota: Um maio também entrado parâmetros de ensaio, incluindo a concentração de proteína, tipo de anticorpo e diluição, se desejado, mas estes não são necessários para iniciar o ensaio.</li>
	<li>Abrir a porta no instrumento pressionando o botão na parte superior do painel laranja.</li>
	<li>Cuidadosamente remova o refil capilar da embalagem. Sem tocar os capilares de vidro, coloque o cartucho no suporte do cartucho. Verifique se o assento do cartucho, observando a luz interior muda de laranja para azul.</li>
	<li>Segure a placa no banco e cuidadosamente Retire o selo de evaporação da parte inferior da placa. Pop bolhas de qualquer vistas estes poços de matriz de separação com um smtodos a ponta da pipeta ou agulha limpa (por exemplo, calibre 25 estéril &#34; top rep &#34; agulha).</li>
	<li>Coloque a placa de ensaio sobre o suporte da placa, garantindo que é totalmente encaixado e feche a porta do instrumento.</li>
	<li>Clique o &#34; iniciar &#34; botão no software. 
	Nota: Se nenhum botão iniciar aparece, a conexão com o instrumento foi perdido. Escolha o instrumento no menu superior esquerdo e, em seguida, conectar-se. Um pop-up aparecerá com o número de série do instrumento; Selecione essa opção e, em seguida, clique em conectar. Botão iniciar deverá aparecer agora.</li>
	<li>Quando a execução é concluída, descartar a placa. Remova o cartucho e coloque em um recipiente de objectos cortantes para descarte, junto com agulhas que pode ter sido usado para pop bolhas. Deixe o poder ligada para evitar problemas de conexão, se o instrumento estiver sendo usado regularmente (por exemplo, pelo menos semanalmente).</li>
</ol> 7. Experimento de análise <ol><li>antes da análise, assegurar que são realizadas as seguintes verificações de qualidade.
	<ol><li>Verificar padrões fluorescentes, selecionando o &#34; mostrar padrões &#34; ícone. Verifique se os padrões são corretamente identificados no &#34; gráfico de &#34; guia. Se eles estiverem incorretos, vá para o &#34; única exibição &#34; ícone, clique com o botão direito no pico correto e selecione &#34; força padrão &#34;, ou clique com o botão direito no pico incorreto e selecione &#34; não é um padrão &#34;. Executar esta verificação para cada capilar novo.</li>
		<li>Verify biotinilado escada clicando sobre o &#34; amostras &#34; e &#34; única exibição &#34; ícones. Selecione a escada na guia experiência. Se um pico é identificado incorretamente, clique direito em &#34; gráfico de &#34; e selecione &#34; pico de remover &#34;. 
		Nota: por exemplo, a escada biotinilado usada para o kit de kDa 12-230 deve mostrar 12, 40, 66, 116, 180 e 230 kDa picos de dimensionamento. Se esta etapa não é executada, o dimensionamento dos picos da amostra será calculado incorretamente, produzindo resultados espúrios.</li>
		<li>Vista e analisar picos de amostra. Derivar os dados da tabela de picos, incluindo peso molecular, a área do pico, altura do pico e sinal de ruído (S/N), conforme necessário para cálculos experimentais.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bradley, H. L., Sabnis, H., Pritchett, D., Bunting, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hematopoietic stem cell protocols. 1185, (2014).</li><li>Guo, L., Eldridge, S., Furniss, M., Mussio, J., Davis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+(hiPSC-CMs)+to+Monitor+Compound+Effects+on+Cardiac+Myocyte+Signaling+Pathways.">Use of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes (hiPSC-CMs) to Monitor Compound Effects on Cardiac Myocyte Signaling Pathways.</a> Curr Protoc Chem Biol. 7 (3), 141-185 (2015).</li><li>Chen, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantitation+of+endogenous+proteins+with+precision+and+accuracy+using+a+capillary+Western+system.">Absolute quantitation of endogenous proteins with precision and accuracy using a capillary Western system.</a> Anal Biochem. 442 (1), 97-103 (2013).</li><li>Chen, J. Q., Wakefield, L. M., Goldstein, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+nano-immunoassays:+advancing+quantitative+proteomics+analysis,+biomarker+assessment,+and+molecular+diagnostics.">Capillary nano-immunoassays: advancing quantitative proteomics analysis, biomarker assessment, and molecular diagnostics.</a> J Transl Med. 13, 182 (2015).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Application+of+a+Novel+Nanovolume+Capillary+Electrophoresis-+Based+Protein+Analysis+System+in+Personalized+&amp;+Translational+Medicine+Research.">The Application of a Novel Nanovolume Capillary Electrophoresis- Based Protein Analysis System in Personalized &amp; Translational Medicine Research.</a> J Bioanal Biomed. S3 (004), (2013).</li><li>ProteinSimple Western. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Size Assay Development Guide, Revision 1. , (2014).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+modern+quantitative+fluorescent+western+blotting+with+troubleshooting+strategies.">A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies.</a> J Vis Exp. (93), (2014).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western++blotting:+sample+preparation+to+detection.">Western blotting: sample preparation to detection.</a> J Vis Exp. (44), (2010).</li><li>Silva, J. M., McMahon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fastest+Western+in+town:+a+contemporary+twist+on+the+classic+Western+blot+analysis.">The fastest Western in town: a contemporary twist on the classic Western blot analysis.</a> J Vis Exp. (84), e51149 (2014).</li><li>Thorn, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin+pathways:+pharmacodynamics+and+adverse+effects.">Doxorubicin pathways: pharmacodynamics and adverse effects.</a> Pharmacogenet Genomics. 21 (7), 440-446 (2011).</li><li>Ernst, O., Zor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linearization+of+the+bradford+protein+assay.">Linearization of the bradford protein assay.</a> J Vis Exp. (38), (2010).</li><li>Taira, N., Yoshida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+of+p53+tumor+suppressor:+determinants+of+its+functional+targets.">Post-translational modifications of p53 tumor suppressor: determinants of its functional targets.</a> Histol Histopathol. 27 (4), 437-443 (2012).</li><li>Thompson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+p53+on+key+serines+is+dispensable+for+transcriptional+activation+and+apoptosis.">Phosphorylation of p53 on key serines is dispensable for transcriptional activation and apoptosis.</a> J Biol Chem. 279 (51), 53015-53022 (2004).</li><li>Currier, J. M., Cheng, W. Y., Menendez, D., Conolly, R., Chorley, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+Gene+Biomarker+at+the+Tipping+Point+of+Adaptive+and+Adverse+Responses+in+Human+Bronchial+Epithelial+Cells.">Developing a Gene Biomarker at the Tipping Point of Adaptive and Adverse Responses in Human Bronchial Epithelial Cells.</a> PLoS One. 11 (5), e0155875 (2016).</li><li>Moser, A. C., Hage, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+electrophoresis-based+immunoassays:+principles+and+quantitative+applications.">Capillary electrophoresis-based immunoassays: principles and quantitative applications.</a> Electrophoresis. 29 (16), 3279-3295 (2008).</li><li>Shintani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Capillary Electrophoresis Applications. , (1997).</li><li>. Wes reagents and consumables :: ProteinSimple Available from: <a target="_blank" href="https://www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html">https://www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html</a> (2017)</li></ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente. Este manuscrito foi revisado pelo nacional de saúde e laboratório de pesquisa de efeitos ambientais e aprovado para publicação. O conteúdo não reflete necessariamente as opiniões do US EPA nem faz menção de nomes comerciais ou produtos comerciais constituem endosso ou recomendação para o uso.

Por décadas, tem havido interesse sustentado no desenvolvimento de métodos de imunoensaio baseado em eletroforética capilar por causa da baixa amostra e reagente despesas, diminuída de processamento tempo quando comparado aos métodos tradicionais e alta compatibilidade para Automatize o procedimento4,15. Há um número de diferentes protocolos para a separação de proteínas que utilizaram capilares, incluindo polímero eletroforético, electrokinetic, peneirar e métodos isoelétrico que isolar proteínas pelas propriedades diferentes (respectivamente, carga eletrostática, equilíbrio de partição, peneirando Propriedades da matriz da separação e pH)16. Aqui, descrevemos um método de eletroforese capilar baseado em anticorpos (ou imunoensaio), usando um polímero peneirando a separação, que foi automatizada e comercialmente adotado3. As vantagens deste sistema incluem facilidade de uso e operação, padronizados e comercialmente disponíveis reagentes e medições confiáveis, sensíveis que exigem menos reagentes e amostras em comparação com ensaios de proteína tradicionais tais como borrão ocidental, ligado à enzima imunoensaio e outros formatos de4,3,5. Tem-se observado nas avaliações anteriores desta tecnologia que a escala do tamanho da proteína que pode ser avaliada tem sido limitada pela separação disponível matriz4, ofertas no entanto recentes têm expandido o mensurável variam de 2 a 440 kDa17 . Além disso, alguns buffers lisados são conhecidos por serem incompatíveis com o ensaio18, portanto seleção dos reagentes experimentais utilizado deve ser considerada antecipadamente.
Uma grande vantagem de um procedimento automatizado com componentes disponíveis comercialmente é a consistência dos resultados através de métodos padronizados e reagentes. Isso minimiza as chances de fracasso de ensaio, automatizando etapas críticas dentro do procedimento. No entanto, é importante notar que certas práticas devem ser respeitadas durante o protocolo para minimizar problemas com o imunoensaio baseado em eletroforética capilar. Em primeiro lugar, é fundamental que a mistura de luminol-S/peróxido é preparada fresco e imediatamente antes placa de carregamento. Sincronismo consistente irá resultar em luminescência consistente após o agente oxidante é adicionado, o que resultará em medições consistentes para um ensaio de anticorpo específico depois do ensaio. Além disso, é importante que os reagentes não-expirado são usados, que afeta principalmente a potência do agente oxidante. Além disso, é importante que a ordem de carregamento de amostras, anticorpos e outros reagentes ser rigorosamente seguidas (ver Figura 1). Qualquer reagente pipetado fora do lugar irá resultar em falha de ensaio e executar um desperdício.
Além desses passos críticos, principais questões experimentados com a técnica geralmente podem ser superados através de otimização. Com efeito, estas condições são específicas para cada combinação de sistema/anticorpo de modelo e, portanto, devem ser determinadas empiricamente para cada novo ensaio. Neste artigo, enfocamos três procedimentos comuns de otimização: tempo de exposição, titulação lisada e diluição do anticorpo primário. A capacidade de gerar resultados mensuráveis depende da análise de um tempo de exposição quando o substrato de luminol não é ser rapidamente esgotado, como resultado de depleção de substrato em perda de sinal. Lisado titulação determina a gama dinâmica linear de cada ensaio, que pode diferir com sistemas de modelo diferente, bem como anticorpos diferentes, mesmo para o mesmo destino de proteína. Diluições de anticorpo escolhidas em ou perto de saturar as concentrações garantir mudanças no sinal não serão afetadas por uma escassez de anticorpo livre, mas apenas por diferente quantidade de proteína disponível alvo epítopo. Outras considerações durante o processo de otimização podem incluir o tempo de incubação do anticorpo e empilhamento/amostra tempo de carregamento. Na maioria dos casos, as configurações padrão para o instrumento oferecem o melhor equilíbrio de resolução e sensibilidade. No entanto, em alguns casos, pobre resolução ou sensibilidade pode ser melhorada por ajustar esses parâmetros.
Capilar de imunoensaio eletroforética com base em métodos fornecem medições de proteína rápida, eficiente e reprodutível. Enquanto esses métodos têm sido utilizados principalmente em configurações de pesquisa e desenvolvimento, a coerência destas tecnologias tem potencial utilidade em aplicações clínicas e regulamentares. Por exemplo, a identificação de subpopulações sensíveis a tóxicos ambientais ou pacientes com progressão da doença pode basear-se nos biomarcadores de proteína medidos em matrizes acessíveis, como sangue, urina e saliva. Como reagente e queda de custos de operação e o número de amostras e alvos que podem ser avaliadas simultaneamente aumenta, provavelmente veremos métodos de imunoensaio baseado em eletroforética capilar usados para esses tipos de aplicativos.

Os imunoensaios electroforese capilares medem a expressão da proteína em lisados celulares usando sistemas de separação de tamanho ou carga e oferecem várias vantagens sobre os tradicionais imunoensaios. Por exemplo, quando comparado ao borrão ocidental, o procedimento automatizado baseado em capilar Elimina a necessidade de géis, dispositivos de transferência, e manual de lava. Além disso, a quantidade absoluta de proteína necessária é aproximadamente 10 vezes menor, tornando a sistemas baseados em capilar ideal para uso com tipos de células raras ou amostra limitada1,2. Os resultados são obtidos em menos de 3 h, usando sistemas automatizados e anteriormente tenha sido demonstrados mais quantitativa e reprodutível do que ocidental convencional borre procedimentos3,4,5. O processo para ensaios baseados em tamanho consiste em carregar amostras contendo sulfato dodecyl de sódio (SDS), ditiotreitol (DTT) e fluorescente etiquetado marcadores de peso molecular em colunas capilares contendo matrizes de empilhamento e separação. Tensão aplicada aos capilares separa as proteínas nas amostras de acordo com o tamanho, e a luz UV imobiliza as proteínas separadas na parede capilar. O capilar é então imuno-sondado com alvos primário anticorpo e horseradish peroxidase (HRP)-anticorpo secundário conjugado. Luminol e peróxido de catalisam a geração de luz quimioluminescente que é medida por uma câmera do dispositivo acoplado (CCD) de carga e analisada para dosar proteínas.
Apesar da relativa facilidade e velocidade de uma plataforma automatizada baseada em capilar eletroforética imunoensaio, otimização das condições de ensaio, tais como a concentração de proteína, anticorpo diluição e tempo de exposição é importante para a obtenção de precisas, reprodutíveis resultados. Em geral, os procedimentos a seguir devem ser executados para otimizar um ensaio para estes sistemas:
1) uma tela deve ser realizada para avaliar e escolher os anticorpos para o sinal e especificidade para o destino de proteína. Se disponível, a proteína purificada ou epítopo alvo pode ser usado para avaliar a especificidade; no entanto, ainda é importante avaliar o potencial sinal específico em proteínas totais provenientes do sistema de modelo.
2) em seguida, a gama dinâmica do ensaio precisa ser determinado. Em uma situação ideal, duplicação de sinal (medido usando a área do pico) é observada como a concentração da amostra é duplicada; no entanto, na prática, uma mudança proporcional no sinal de entrada de forma previsível (por exemplo, linear caber) é suficiente para quantificação de proteína. Além disso, essa otimização irá definir a concentração de proteína com sinal elevado, mas ainda dentro da escala linear para o modelo experimental.
3) determine a concentração de anticorpo usando a concentração de proteína fixo escolhida na etapa de otimização 2. À medida que aumenta a concentração de anticorpos, o sinal aumenta até que platôs na saturação. Uma concentração de anticorpo perto deste nível de saturação é necessária para a medição da concentração da proteína.
O processo usado para otimizar as concentrações de proteína, diluições de anticorpo e tempos de exposição para um ensaio de automatizado baseado em capilar tamanho6 é demonstrado utilizando extratos de células inteiras isolados de BEAS-2B, um humano transformado SV-40 brônquico linhagem de células epiteliais. Isolamento da proteína de extratos de células ou tecidos pode ser realizado usando um número de protocolos publicados7,8,9 e não será coberto aqui. Resultados de um experimento experimental usando as condições otimizadas são também relatados para total e fosforilados (serina 15, serina 20) p53 em culturas expostos a doxorrubicina (um comum agente quimioterapêutico que induz a apoptose de células10) em 1.2, 1.8, e mídia de 2,4 µ g/mL para 4 h antes da colheita. As áreas de pico de p53 são normalizadas para ɑ-tubulina, que é usado como um controle de carregamento.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Wes instrument</td>
			<td>ProteinSimple (Santa Clara, CA)</td>
			<td>004-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P53 DO-1 primary antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td>
			<td>sc-126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphorylated p53 (ser 15) primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphorylated p53 (ser 20) primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha-tubulin primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3873</td>
			<td>used as a loading control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compass Software</td>
			<td>ProteinSimple (Santa Clara, CA)</td>
			<td></td>
			<td>provided with the Wes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-230 kDa Master kit</td>
			<td>ProteinSimple (Santa Clara, CA)&#160;</td>
			<td>PS MK02 (since replaced by a new kit #)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html</td>
			<td>INCLUDES PART NO: 
			Wash Buffer (60 mL) 042-202 
			10X Sample Buffer (440 &#956;L) 042-195 
			Pre-Filled Microplates (8) PS-PP01 
			Capillary Cartridges (8) PS-CC01 
			Antibody Diluent II (20 mL) 042-203 
			Luminol-S (1.5 mL) 042-233 
			Peroxide (1.5 mL) 042-234 
			Streptavidin-HRP (132 &#956;L) 042-414 
			Standard Pack (8): Biotinylated ladder, fluorescent 5X master mix, DTT, and empty 0.6 mL tube PS-ST01 
			Anti-Rabbit Secondary Antibody 042-206 
			or 
			Anti-Mouse Secondary Antibody 042-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name&#160;</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Cell culture, treatment, and harvest (using vendor recommended protocols; protocols not included in manuscript)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEAS-2B cells</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA)</td>
			<td>CRL-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>keratinocyte growth medium, KGM Gold</td>
			<td>Lonza Ltd (Basel, Switzerland)</td>
			<td>192152</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>keratinocyte basal medium, KBM Gold</td>
			<td>Lonza Ltd (Basel, Switzerland)</td>
			<td>192151</td>
			<td>serum free medium for chemical dosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>doxorubicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>D1515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Blue Bradford Assays</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td>
			<td>23200</td>
			<td>for protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Extract kit</td>
			<td>Active Motif (Carlsbad, CA)</td>
			<td>D1515</td>
			<td>used to prepare whole cell lysates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>INCLUDES:</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Lysis Buffer AM1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1M dithiothreitol (DTT)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10X PBS&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Phosphatase Inhibitors</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

procedure and key optimization strategies for an automated capillary electrophoretic-based immunoassay method

Novas tecnologias que utilizam os imunoensaios baseados em capilar prometem avaliação mais rápida e mais quantitativa de proteínas em comparação com os imunoensaios tradicionais. No entanto, semelhante a outros ensaios de proteína baseada em anticorpos, otimização dos parâmetros de imunoensaio baseado no capilar, tais como a concentração de proteína, anticorpo diluição e tempo de exposição é um requisito importante para a geração de significativos e confiáveis dados. Medições devem cair dentro da escala linear do ensaio onde as alterações no sinal são diretamente proporcionais às mudanças na concentração de lisado. O processo de escolha de concentrações adequadas de lisado, diluições de anticorpo e tempos de exposição na linha de células epiteliais brônquicas humanas, BEAS-2B, é demonstrado aqui. Ensaio de linearidade é mostrada em um intervalo de concentrações de proteína de extrato celular com anticorpos p53 e α-tubulina. Um exemplo de burnout sinal é visto as concentrações mais elevadas com longos tempos de exposição, e uma curva de diluição do anticorpo de α-tubulina é mostrada demonstrando a saturação. Além disso, resultados experimentais de exemplo são relatados para células tratados com doxorrubicina usando parâmetros otimizados.

Tempo de exposição - Neutralização de sinal de determinação
Neutralização de sinal pode ocorrer quando o substrato de luminol e peróxido é esgotado muito rapidamente. Isto pode ser determinado examinando-se os dados em tempos de exposição diferentes de quimioluminescência. O software de análise, vá para "Editar – &#62; análise – &#62; imagens". As exposições variam de 5 a 480 s. O eixo y em um electroferograma relata sinal/hora, assim que os dados de cada exposição devem ter um coeficiente de sinal/hora semelhante. Este coeficiente diminui com exposições sequencialmente mais longas se luminol torna-se empobrecido, como pode ser visto com o anticorpo DO-1 de p53 (Figura 2). Por causa da depleção de substrato, este ensaio pode ser considerado mensurável até a 0,2 µ g / µ l concentração somente em exposições de s o 5-30. Portanto, no presente exemplo, 15 s estava determinado a ser o tempo de exposição de análise de dados ideal para p53.
Lisado titulação - Determinar a gama dinâmica linear
É importante que medidas sejam tomadas dentro do intervalo dinâmico linear de cada ensaio, onde as alterações no sinal medido pela área do pico são proporcionais às mudanças na quantidade de proteína na amostra. Usando o tempo de exposição ideal dos 15 escolhidos s na seção anterior, o ensaio de linearidade é demonstrada para p53 e ɑ-tubulina sobre maior do que um 15-fold intervalo de concentração (Figura 3). Em nossa experiência, um valor de2 R de &#62; 0.9 de uma regressão linear caber é considerado de aceitável para uma escala de diluição da proteína purificada de uma quantidade conhecida (se o ensaio é uma medida quantitativa absoluta) ou amostra a lisado de proteína alvo desconhecido (se ensaio é uma medida quantitativa relativa).
Otimização de diluição de anticorpo
Usando anticorpos em concentrações de impregnação ajuda a garantir que quaisquer alterações de sinal medidas são devidas somente às mudanças na quantidade de proteína. Como demonstração, duas linha de celular BEAS-2B toda célula extrai (0,2 µ g / µ l da proteína total carregado no ensaio) foram analisados com concentrações de anticorpos ɑ-tubulina serialmente diluída que variam de 01:25 - 1:800 (Figura 4). Sinal quimioluminescente (aqui, medida como a área do pico) foi plotada contra a diluição do anticorpo. Observou-se a saturação perto as 01:50 diluição onde a curva começa um platô perceptível.
Julgamento experimental - tratamento de doxorrubicina em células de BEAS-2B
Usando as condições de ensaio otimizado, cultura de células de BEAS-2B foi tratada com três diferentes concentrações de doxorrubicina (1.2, 1.8 e 2.4 µ g/mL) para 4h (Figura 5, tabela 1). Ativação de p53 através de modificações borne-translational Medeia diversas respostas celulares, incluindo a detenção do ciclo celular, senescência e apoptose12. Especificamente, a fosforilação da serina 15 tem sido atribuída a ativação transcricional de p53, resultando na apoptose depois de doxorrubicina tratamento13. Nesta demonstração, ɑ-tubulina normalizado pico áreas são apresentadas como dobra de controle. Curiosamente, 3.5 a 4-fold um aumento da fosforilação de p53 em serina aumentos de 15 e 2 vezes no nível de p53 phosphorylated em serina 20 foram observados após exposição de 4h a doxorrubicina. Estes resultados indicam que a ativação do p53; no entanto, nenhuma dose-resposta é visto para as concentrações escolhidas (por outro lado, a menor dose testada suscitou a resposta mais alta). P53 total não demonstrou uma resposta clara de tratamento neste sistema de modelo. Observamos anteriormente ativação da fosforilação de p53 na ausência de aumento dos níveis de p53 total em condições similares em zinco-Tratado de células 2B BEAS14.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig2v3.jpg"> 
Figura 2 . Comparação de imagens de exposição para detectar o sinal de estresse. Lane exibições mostrar diminuindo as concentrações de proteína para BEAS-2B lysates sondado com p53 DO-1 anticorpo a uma diluição de 1: 500. Coeficientes de sinal de quimioluminescência, relatados como alturas ou no software do instrumento, são sobrepostos. Ao contrário as alturas, as intensidades de banda visual automaticamente são geradas e ajustadas pelo instrumento para auxiliar a visualização das bandas e são não comparável de um painel para outro. Note a diminuição do sinal de quimioluminescência aumentos de tempo de exposição, com o sinal começa a desaparecer (divisão pico) para as duas exposições mais longas, indicando depleção de substrato. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig2v3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig3v3.jpg"> 
Figura 3 . Lisada titulação mostrando os pontos de vista da pista. Lisado titulação mostrando a lane exibições (A) do lisado quando analisados com 1: 500 p53 DO-1 ou 01:50 ɑ-tubulina BEAS-2B. Ao contrário os valores de área do pico, as intensidades de banda visual são automaticamente geradas e ajustadas pelo instrumento para auxiliar a visualização das bandas e são não comparável de um painel para outro. Análise de regressão linear (B) confirma que os ensaios são lineares ao longo de toda a gama testada, de 0,01 a 0,20 µ g / µ l e 0,025 para 0,40 µ g / µ l, com valores de R2 de 0.999 e 0.985, respectivamente. As concentrações de proteína total no meio do intervalo linear foram escolhidas para acomodar variação de proteína alvo potencial em qualquer direção (por exemplo, 0,2 µ g / µ l para α-tubulina). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig3v3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig4.jpg"> 
Figura 4 . Diluição de anticorpo α-tubulina curvas para dois separados BEAS-2B proteína lysates com e sem normalização da linha de base. Um definitivo Departture de linearidade é visto a 01:50 (0,02) diluição, indicando a saturação. 01:50, portanto, foi escolhida como a diluição ideal para este anticorpo. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig5.jpg"> 
Figura 5. Efeito do tratamento com doxorrubicina (Glauce) 4h no total e serina fosforilado expressão de proteína p53 de células BEAS-2B. Áreas de pico são normalizadas para α-tubulina e plotadas como dobra de controle (CTL). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/55911/55911tbl1.jpg"> 
Tabela 1. Efeito do tratamento com doxorrubicina (Glauce) 4h no total e serina fosforilado expressão de proteína p53 de células BEAS-2B. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911tbl1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.</a>

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Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method

Um imunoensaio baseado no capilar, usando uma plataforma comercial para medir as proteínas alvo de preparações de proteína total é demonstrado. Além disso, o ensaio parâmetros de tempo de exposição, concentração de proteína e diluição de anticorpo são otimizados para um sistema de modelo de cultura de células.

Procedimento e estratégias de otimização de chave para um método automatizado capilar imunoensaio eletroforética com base em

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