Name: procedure and key optimization strategies for an automated capillary electrophoretic-based immunoassay method
Uploaded: 2017-09-10T14:00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method at JoVE.com

Författarna vill tacka Keith Tarpley av US EPA Office i forskning och utveckling-Research Triangle Park (ORD-RTP) grafik och Media team för utveckling, tejpning och redigering av instruktions video. Vi vill också tacka Deborah Pritchett från ProteinSimple för bra konversationer om optimering av våra data. JM Guynn stöddes av Oak Ridge Institutet för vetenskap och utbildning forskning/deltagande Program på US Environmental Protection Agency.

Obs: se till att alla reagenser och prover är beredda enligt tillverkaren &#39; s-protokollet, som beskrivs nedan. Vänligen bära lämplig personlig skyddsutrustning under detta förfarande, vilket inkluderar nitrilhandskar, labbrock, stängd-toed skor och skyddsglasögon. En tabell av specifika material, reagens och utrustning krävs tillhandahålls separat. Totalprotein koncentration av prover bör bestämmas i förväg med hjälp av etablerade metoder som är kompatibla med lysate bufferten används, såsom Bradford assay 11.
 1. beredning av prover och reagenser från standard pack som levereras av tillverkaren <ol><li>att förbereda 400 mM arbetslösning av Ditiotreitol (DTT), tillsätt 40 µL avjoniserat vatten till tydlig röret som innehåller den medföljande lager från tillverkaren. Det är viktigt att undvika att införa bubblor till lösningen genom att blanda lösningen med långsam och skonsam pipettering.</li>
	<li>Lägga till 20 µL 10 X provet buffert och 20 µL av beredda 400 mM DTT lösningen till rosa röret innehållande fluorescerande 5 X master mix (se Tabell för material). 
	Obs: De Master Mix (MM) är förseglade av tillverkaren med folie omslag och måste genomborras av en pipettspetsen. Blanda försiktigt genom långsam pipettering att undvika stänk DTT i pipetten.</li>
	<li>Och Lägg sedan till 16 µL avjoniserat vatten, 2 µL levereras 10 X provet buffert och 2 µL av beredda 400 mM DTT lösningen till vita biotinylerade stege röret levereras av tillverkaren. Blanda försiktigt och överför till en 0,6 mL tub för denatureringen.</li>
	<li>Förbered 0,1 x provet buffert genom att späda ut de medföljande 10 X lösning 1: 100 med vatten. Förbereda tillräckligt 0,1 x provet buffert att späda ut alla prover.</li>
	<li>Beräkna mängden 0,1 x provet buffert som läggs till ett prov, som beror på det totala proteinet slutliga önskad koncentration. Blanda 1 del 5 x fluorescerande MM med 4 delar utspädda provet att uppnå den önskade slutliga proteinkoncentration.
	<ol><li>Beräkna volymer enligt följande: (i) volym 5 x fluorescerande MM = (önskad slutliga proteinkoncentration) / 5; (ii) volymen av protein lager = (önskad slutliga proteinkoncentration x totala volym behövs) / Protein aktiemarknaden koncentration; (iii) volym 0,1 x provet buffert = totala volym - 5 x MM volym - Protein lager volym.</li>
	</ol></li></ol> 2. Denaturering av prover och stege <ol><li>plats beredd prover och biotinylerade stege i ett 95 ° C värme block för 5 min. cyklontuber omedelbart efter inkubation, köra en spin för ~ 5 s i en bordsskiva centrifug och plats på ice. 
	Obs: Vissa proteiner kan kräva skonsammare denatureringen förhållanden (t.ex., 70 o C i 10 min) att förebygga protein aggregering och förbättra migration i kapillär matrisen. Överväga det här alternativet om det finns tunga smetar på de högre molekylvikt (se video exempelvis).</li>
</ol> 3. Beredning av antikroppar <ol><li>som bestämts av optimering (se Representativa resultat och video), förbereda den önskade dilution(s) för primär antikropp (t.ex., 1:50, 1: 100) i den medföljande antikroppen Spädningsvätska 2. 
	Obs: Antikroppar används oftast vid högre koncentrationer för kapillär-baserad immunoassay än för traditionella western blotting. Den medföljande sekundär antikroppen är redo att användas utan spädning.</li>
</ol> 4. Beredning av urin-S och peroxider <ol><li>förbereda en 1:1 blandning av urin-S och peroxider.</li>
	<li>Vortex att blanda och lagra på ice. 
	Obs: Det är viktigt att denna blandning är beredda färska för varje experimentell analys. 250ul totala mix som behövs för att köra en full tallrik.</li>
</ol> 5. Beredning av assay plattan <ol><li>som visas i figur 1, belastning de prover och reagenser som förberetts enligt ovan i assay plattan. Läs anvisningarna nedan för varje rad. För att minimera avdunstning från brunnarna, se till att plattan locket byts mellan reagens tillägg.</li>
	<li>i rad A, Pipettera 5 µL av biotinylerade stege till väl A1. För den återstående raden, förberett Pipettera prover (5 µL varje) i brunnar A2-A25. 
	Obs: Det är absolut nödvändigt att A1 innehåller väl alltid stege, som första kapillären i patronen är optimerad för att köra denna standard.</li>
	<li>i rad B, Pipettera 10 µL av antikropp spädningsvätska 2 i varje brunn (B1-B25).</li>
	<li>På rad C, Pipettera 10 µL av antikropp spädningsvätska 2 in väl C1. I den återstående raden C brunnar, Pipettera 10 µL av primär antikropp (brunnar C2-C25).</li>
	<li>i rad D, Pipettera 10 µL av streptividin-HRP in väl D1. I den återstående raden D brunnar, Pipettera 10 µL av sekundär antikropp (brunnar D2-D25).</li>
	<li>i raden E, Pipettera 10 µL av nylagade urin-peroxid blandningen i varje brunn (E1-E25).</li>
	<li>Slutligen lägga till 500 μl tvättbuffert per fack vardera till topp 3 rader av buffert brunnar. 
	Obs: Det är viktigt att minimera bubbla bildandet av pipettering försiktigt och inte utvisa den slutliga volymen från spetsen som bubblor kan störa kapillären lastning och köra.</li>
	<li>När alla brunnar är inlästa, Centrifugera plattan på ~ 1000 x g under 5 minuter vid rumstemperatur för att ta bort bubblor och se till att vätskan är i botten av brunnarna. Några synliga bubblor pop med en liten pipettspetsen eller ren nål (t.ex., 25 gauge sterila &#34; rep top &#34; nål).</li>
</ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig1.jpg" /> figur 1 . Pipettering mall för assay plattan. Färgkodningen representerar korrekt reagens och prover (upp till 24 totalt) tillsätts assay plattan. Lägg till biotinylerade stege till väl A1 (orange), förberett prover från brunnar A2 upp till A25 (ljusblå), antikropp spädningsvätska 2 brunnar B1-B25 och C1 (ljusgrön), primär antikropp till brunnar C2 upp till C25 (blå), streptividin-HRP till väl D1 (mörkrosa), sekundära antikroppar mot brunnar D2 upp till D25 (Mörkgrön), och urin-peroxid mix till brunnar E1 upp till E25 (lila). Tvättbuffert läggs till de första tre raderna av större halva plattan wells (mörkblå). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig1large.jpg" target="_blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
 6. starta instrumentet kapillär immunoassay <ol><li>Se till att instrumentet och medföljande datorn är påslagna. Ingen uppvärmningstid behövs.</li>
	<li>Öppna instrumentering-programvaran på datorn. Välj först den &#34; Assay &#34; fliken till höger i fönstret och &#34; nya Assay &#34; under den &#34; Arkiv-menyn &#34; till vänster. Välj storlek, storlek spänner (e.g., 12-230 kDa) och kassett typ (t.ex., 25 kapillär) som användes för särskilt analysen. 
	Obs: En maj också ingång assay parametrar, inklusive proteinkoncentration, antikropp typ och utspädning, om önskat, men dessa är inte skyldiga att starta analysen.</li>
	<li>Öppna dörren på instrumentet genom att trycka på knappen ovanpå panelen orange.</li>
	<li>Ta försiktigt bort kapillär patronen ur förpackningen. Utan att röra glas kapillärer själva, placera bläckpatronen i patronhållaren. Verifierar patron sittplatser genom att observera inre ljuset ändras från orange till blått.</li>
	<li>Håll plattan stadigt på bänken och dra försiktigt av avdunstning sigill från den nedre delen av plattan. Pop alla bubblor som ses i dessa separation matrix brunnar med en smalla Pipettera spets eller ren nål (t.ex., 25 gauge sterila &#34; rep top &#34; nål).</li>
	<li>Placera assay plattan på hållaren plattan, för att säkerställa det sitter fullt, och Stäng dörren instrument.</li>
	<li>Klicka på den &#34; Start &#34; knappen i programvaran. 
	Obs: Om ingen Start-knappen visas anslutningen med instrumentet har förlorats. Välj Instrument från menyn längst upp till vänster och sedan ansluta. Ett popup-fönster ska visas med instrumentets serienummer; Välj detta, klicka på Anslut. Knappen Start bör nu visas.</li>
	<li>När körningen är klar, kassera plattan. Ta bort patronen och placera i en behållare för bortskaffande, tillsammans med några nålar som kan ha använts till pop bubblor. Lämna kraften på att undvika anslutningsproblem om instrumentet används regelbundet (t.ex., minst varje vecka).</li>
</ol> 7. Experimentera analys <ol><li>före analys, säkerställa de följande kvalitetskontroller utförs.
	<ol><li>Kontrollera fluorescerande standarder genom att välja den &#34; Visa standarder &#34; ikon. Kontrollera att normerna identifieras korrekt i den &#34; diagramvy &#34; fliken. Om de är felaktiga, gå till den &#34; vy &#34; ikon, högerklicka på den rätta toppen och välj &#34; kraft Standard &#34;, eller rätt klick på den felaktiga toppen och välj &#34; inte en Standard &#34;. Utföra denna kontroll för varje ny kapillär.</li>
		<li>Kontrollera biotinylerade stege genom att klicka på den &#34; prover &#34; och &#34; enda vy &#34; ikoner. Välj stegen på fliken experiment. Om en topp felaktigt identifieras, högerklicka på den i &#34; diagramvy &#34; och välj &#34; ta bort Peak &#34;. 
		Obs: till exempel biotinylerade stege används för 12-230 kDa kit bör Visa 12, 40, 66, 116, 180 och 230 kDa dimensionering toppar. Om detta steg inte utförs, dimensionering av provet topparna felaktigt ska beräknas, producera falska resultat.</li>
		<li>Visa och analysera provet toppar. Härleda uppgifter från toppar tabellen, inklusive molekylvikt, topparea, topphöjd och signal-brus (S/N), som behövs för experimentell beräkningar.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bradley, H. L., Sabnis, H., Pritchett, D., Bunting, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hematopoietic stem cell protocols. 1185, (2014).</li><li>Guo, L., Eldridge, S., Furniss, M., Mussio, J., Davis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+(hiPSC-CMs)+to+Monitor+Compound+Effects+on+Cardiac+Myocyte+Signaling+Pathways.">Use of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes (hiPSC-CMs) to Monitor Compound Effects on Cardiac Myocyte Signaling Pathways.</a> Curr Protoc Chem Biol. 7 (3), 141-185 (2015).</li><li>Chen, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantitation+of+endogenous+proteins+with+precision+and+accuracy+using+a+capillary+Western+system.">Absolute quantitation of endogenous proteins with precision and accuracy using a capillary Western system.</a> Anal Biochem. 442 (1), 97-103 (2013).</li><li>Chen, J. Q., Wakefield, L. M., Goldstein, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+nano-immunoassays:+advancing+quantitative+proteomics+analysis,+biomarker+assessment,+and+molecular+diagnostics.">Capillary nano-immunoassays: advancing quantitative proteomics analysis, biomarker assessment, and molecular diagnostics.</a> J Transl Med. 13, 182 (2015).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Application+of+a+Novel+Nanovolume+Capillary+Electrophoresis-+Based+Protein+Analysis+System+in+Personalized+&amp;+Translational+Medicine+Research.">The Application of a Novel Nanovolume Capillary Electrophoresis- Based Protein Analysis System in Personalized &amp; Translational Medicine Research.</a> J Bioanal Biomed. S3 (004), (2013).</li><li>ProteinSimple Western. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Size Assay Development Guide, Revision 1. , (2014).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+modern+quantitative+fluorescent+western+blotting+with+troubleshooting+strategies.">A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies.</a> J Vis Exp. (93), (2014).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western++blotting:+sample+preparation+to+detection.">Western blotting: sample preparation to detection.</a> J Vis Exp. (44), (2010).</li><li>Silva, J. M., McMahon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fastest+Western+in+town:+a+contemporary+twist+on+the+classic+Western+blot+analysis.">The fastest Western in town: a contemporary twist on the classic Western blot analysis.</a> J Vis Exp. (84), e51149 (2014).</li><li>Thorn, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin+pathways:+pharmacodynamics+and+adverse+effects.">Doxorubicin pathways: pharmacodynamics and adverse effects.</a> Pharmacogenet Genomics. 21 (7), 440-446 (2011).</li><li>Ernst, O., Zor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linearization+of+the+bradford+protein+assay.">Linearization of the bradford protein assay.</a> J Vis Exp. (38), (2010).</li><li>Taira, N., Yoshida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+of+p53+tumor+suppressor:+determinants+of+its+functional+targets.">Post-translational modifications of p53 tumor suppressor: determinants of its functional targets.</a> Histol Histopathol. 27 (4), 437-443 (2012).</li><li>Thompson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+p53+on+key+serines+is+dispensable+for+transcriptional+activation+and+apoptosis.">Phosphorylation of p53 on key serines is dispensable for transcriptional activation and apoptosis.</a> J Biol Chem. 279 (51), 53015-53022 (2004).</li><li>Currier, J. M., Cheng, W. Y., Menendez, D., Conolly, R., Chorley, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+Gene+Biomarker+at+the+Tipping+Point+of+Adaptive+and+Adverse+Responses+in+Human+Bronchial+Epithelial+Cells.">Developing a Gene Biomarker at the Tipping Point of Adaptive and Adverse Responses in Human Bronchial Epithelial Cells.</a> PLoS One. 11 (5), e0155875 (2016).</li><li>Moser, A. C., Hage, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+electrophoresis-based+immunoassays:+principles+and+quantitative+applications.">Capillary electrophoresis-based immunoassays: principles and quantitative applications.</a> Electrophoresis. 29 (16), 3279-3295 (2008).</li><li>Shintani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Capillary Electrophoresis Applications. , (1997).</li><li>. Wes reagents and consumables :: ProteinSimple Available from: <a target="_blank" href="https://www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html">https://www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html</a> (2017)</li></ol>

Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen. Detta manuskript har granskats av den nationella hälso- och miljömässiga effekter Research Laboratory och godkänts för publicering. Innehållet återspeglar inte nödvändigtvis åsikter US EPA heller utgör omnämnande av varunamn eller kommersiella produkter godkännande eller rekommendation för användning.

I årtionden, det har varit ihållande intresse i utvecklingen av kapillär elektrofores-baserad immunoassay metoder på grund av låg prov och reagens utgifter, minskade bearbetning tid jämfört med traditionella metoder och hög kompatibilitet med automatisera de förfarande4,15. Det finns ett antal olika protokoll för separation av proteiner som har utnyttjat kapillärer, inklusive genom elektrofores, våra, polymer siktning och isoelektrisk metoder, som isolerar proteiner av olika egenskaper (respektive, Elektrostatisk uppladdning, delning jämvikt, siktning boenden i Separerande matris och pH)16. Här beskriver vi ett antikroppsbaserade (eller immunoassay) kapillärelektrofores metod, med en polymer som siktning separation, som har automatiserats och kommersiellt antagna3. Fördelarna med detta system är användarvänlighet och drift, standardiserade och kommersiellt tillgängliga reagenser, och tillförlitlig, känsliga mätningar som kräver mindre reagens och prover jämfört med traditionella protein analyser såsom western blot, enzymkopplad immunanalys och andra format3,4,5. Det har noterats i tidigare bedömningar av denna teknik att storleksintervallet av protein som kan bedömas har begränsats av den tillgängliga separation matrix4, men senaste erbjudanden har utökat mätbara intervallet 2 till 440 kDa17 . Dessutom måste vissa lysate buffertar är kända för att vara oförenligt med den assay18, urval av de experimentella reagens som används således i förväg.
En stor fördel med ett automatiserat förfarande med kommersiellt tillgängliga komponenter är konsekvens av resultat genom standardiserade metoder och reagenser. Detta minskar risken för assay misslyckande genom att automatisera kritiska steg i förfarandet. Det är dock viktigt att notera att vissa förfaranden måste följas under protokollet att minimera problem med den kapillär elektrofores-baserad immunoassay. Det första är det kritiskt att urin-S/peroxid blandningen är beredda färska och omedelbart innan plattan laddar. Konsekvent timing kommer att resultera i konsekvent luminiscens när oxidationsmedel är lagt, vilket resulterar i konsekvent mått för en särskild antikropp test efter test. Dessutom är det viktigt att icke-expired reagenser som används, vilket främst påverkar styrkan av oxidationsmedel. Dessutom är det viktigt att ordern lastning av prover, antikroppar och andra reagenser följas strikt (se figur 1). Någon reagens pipetteras malplacerad resulterar i assay misslyckande och en bortkastad kör.
Förutom dessa kritiska steg, kan primära problem upplevde med tekniken generellt övervinnas genom optimering. Faktiskt, dessa villkor är specifika för varje modell system/antikropp kombination och därför bör prövas empiriskt för varje ny analys. I den här artikeln fokuserar vi på tre gemensamma optimering förfaranden: exponeringstid, lysate titrering och primär antikropp utspädning. Förmågan att generera mätbara resultat beror på analys av en exponeringstid när urin substratet inte är snabbt utfiskningen, som substrat utarmning resulterar i förlust av signal. Lysate titrering avgör det linjära dynamiska omfånget av varje test, som kan variera med olika modellsystem, liksom olika antikroppar, även för samma protein mål. Antikropp utspädningar valt vid eller nära mättar koncentrationer säkerställa förändringar i signalen inte påverkas av brist på gratis antikropp, men bara av olika mängd tillgängliga protein mål epitop. Andra överväganden under optimeringsprocessen kan innehålla antikroppar inkubationstiden och stapling/prov laddningstid. Erbjuda den bästa balansen mellan upplösning och känslighet i de flesta fall standardinställningarna för instrumentet. Dock i vissa fall kan dålig upplösning eller känslighet förbättras genom att justera dessa parametrar.
Kapillär elektrofores-baserad immunoassay metoder ger snabb, effektiv och reproducerbara protein mätningar. Medan dessa metoder har främst använts i forskning och utveckling inställningar, har konsekvensen av dessa tekniker potentiella verktyg i reglerings- och kliniska tillämpningar. Identifiering av mottagliga subpopulations miljögifter eller patienter med sjukdomsprogression kan exempelvis baseras på protein biomarkörer mätt i tillgängliga matriser, såsom blod, urin och saliv. Som reagens och drift kostnader droppe och antalet prover och mål som kan vara samtidigt bedömda ökar, kommer vi sannolikt se kapillär elektrofores-baserade immunanalysmetoder för dessa typer av applikationer.

Kapillär elektrofores immunanalyser mäter proteinuttryck i cell lysates använder storlek eller avgift separationssystem och ger flera fördelar jämfört med de traditionella immunanalyser. Till exempel jämfört med western blot, förfarandet för automatiserad kapillär-baserade eliminerar behovet av geler, överföring enheter, och manuell tvättar. Dessutom är den absoluta mängden protein som behövs cirka 10 gånger mindre, vilket gör kapillär-baserade system perfekt för användning med sällsynta celltyper eller begränsat urval1,2. Resultat erhålls i så lite som 3 h med automatiserade system och har tidigare visat sig vara mer kvantitativa och reproducerbar än konventionella western blot förfaranden3,4,5. Processen för storlek-baserade analyser består av lastning prover som innehåller sodium dodecyl sulfate (SDS), Ditiotreitol (DTT), och fluorescently märkt molekylvikt markörer i kapillär kolumner som innehåller stapling och separation matriser. Spänning att kapillärerna separerar proteiner i proverna enligt storlek och UV-ljus immobilizes separerade proteinerna i kapillär väggen. Kapillären är sedan immuno-utforskad med målet-specifik primär antikropp och pepparrot peroxidas (HRP)-konjugerad sekundär antikropp. Urin och peroxider catalyze Kemiluminiscens ljus generation som mäts av en kostnad kopplade enhet (CCD) kamera och analyseras för att kvantifiera protein.
Trots den relativa lätthet och snabbhet av en automatiserad kapillär-baserade elektroforetiska immunoassay-plattform är optimering av assay villkor såsom proteinkoncentration, antikropp utspädning och exponeringstid viktigt för att erhålla exakt och reproducerbar resultat. I allmänhet bör följande procedurer utföras för att optimera test för dessa system:
(1) en skärm bör utföras för att utvärdera och välja antikroppar för signal- och specificitet till målet för protein. Om tillgängligt, kan renat protein eller målet epitop användas att bedöma specificitet; Det är dock fortfarande viktigt att bedöma potentiella icke-specifik signal i totalt protein kommer från modellsystem.
(2) nästa, det dynamiska omfånget av analysen måste fastställas. I en ideal situation observeras signal fördubbling (mätt med hjälp av topparea) som provet koncentration fördubblas; dock i praktiken är en proportionell förändring i signal till ingång på ett förutsägbart sätt (t.ex., linjär passar) tillräckligt för protein kvantifiering. Dessutom kommer denna optimering definiera proteinkoncentration med hög signal, men fortfarande inom det linjära området för experimentell modell.
3) fastställa den optimala antikroppkoncentrationen med hjälp av fasta protein koncentrationen valdes i optimering steg 2. När antikroppkoncentrationen ökar, ökar signalen tills det platåer på mättnad. En antikroppskoncentration nära denna mättnadsnivån krävs för korrekt mätning av proteinkoncentration.
Processen används för att optimera protein koncentrationer, antikropp utspädningar och exponeringstider för en automatiserad kapillär-baserade storlek assay6 demonstreras med helcellsvaccin extrakt isolerade från BEAS-2B, en SV-40 omvandlas människa bronkial epitelial cell fodrar. Protein isolering från cell eller vävnad extrakt kan utföras med ett antal publicerade protokoll7,8,9 och behandlas inte här. Resultatet av en rättegång experiment med hjälp av de optimera villkor också rapporteras för total och fosforyleras (serin 15, serine 20) p53 i kulturer som utsätts för doxorubicin (en gemensam kemoterapeutiska medel som inducerar cell apoptos10) på 1,2, 1,8, och 2.4 µg/mL media för 4 h före skörd. P53 peak områdena är normaliserad till ɑ-tubulin, som används som en lastning kontroll.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Wes instrument</td>
			<td>ProteinSimple (Santa Clara, CA)</td>
			<td>004-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P53 DO-1 primary antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td>
			<td>sc-126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphorylated p53 (ser 15) primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphorylated p53 (ser 20) primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha-tubulin primary antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3873</td>
			<td>used as a loading control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compass Software</td>
			<td>ProteinSimple (Santa Clara, CA)</td>
			<td></td>
			<td>provided with the Wes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-230 kDa Master kit</td>
			<td>ProteinSimple (Santa Clara, CA)&#160;</td>
			<td>PS MK02 (since replaced by a new kit #)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html</td>
			<td>INCLUDES PART NO: 
			Wash Buffer (60 mL) 042-202 
			10X Sample Buffer (440 &#956;L) 042-195 
			Pre-Filled Microplates (8) PS-PP01 
			Capillary Cartridges (8) PS-CC01 
			Antibody Diluent II (20 mL) 042-203 
			Luminol-S (1.5 mL) 042-233 
			Peroxide (1.5 mL) 042-234 
			Streptavidin-HRP (132 &#956;L) 042-414 
			Standard Pack (8): Biotinylated ladder, fluorescent 5X master mix, DTT, and empty 0.6 mL tube PS-ST01 
			Anti-Rabbit Secondary Antibody 042-206 
			or 
			Anti-Mouse Secondary Antibody 042-205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name&#160;</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Cell culture, treatment, and harvest (using vendor recommended protocols; protocols not included in manuscript)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEAS-2B cells</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA)</td>
			<td>CRL-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>keratinocyte growth medium, KGM Gold</td>
			<td>Lonza Ltd (Basel, Switzerland)</td>
			<td>192152</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>keratinocyte basal medium, KBM Gold</td>
			<td>Lonza Ltd (Basel, Switzerland)</td>
			<td>192151</td>
			<td>serum free medium for chemical dosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>doxorubicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>D1515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Blue Bradford Assays</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td>
			<td>23200</td>
			<td>for protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Extract kit</td>
			<td>Active Motif (Carlsbad, CA)</td>
			<td>D1515</td>
			<td>used to prepare whole cell lysates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>INCLUDES:</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Lysis Buffer AM1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1M dithiothreitol (DTT)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10X PBS&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Phosphatase Inhibitors</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

procedure and key optimization strategies for an automated capillary electrophoretic-based immunoassay method

Nya teknologier som använder kapillär-baserade immunanalyser lovar snabbare och mer kvantitativ protein bedömning jämfört med traditionella immunanalyser. Liknar andra antikroppsbaserade protein assays, optimering av kapillär-baserad immunoassay parametrar, såsom proteinkoncentration, antikropp utspädning och exponeringstid är dock en viktig förutsättning till generation av meningsfulla och tillförlitlig data. Mätningar måste falla inom det linjära området analysens där förändringar i signalen är direkt proportionell till förändringar i lysate koncentration. Processen att välja lämpliga lysate koncentrationer, antikropp utspädningar och exponeringstider i raden mänsklig bronkial epitelial cell, BEAS-2B, demonstreras här. Assay linjäritet visas över en rad hela cellen extrakt protein koncentrationer med p53 och α-tubulin antikroppar. Ett exempel på signal utbrändhet ses vid de högsta koncentrationerna med långa exponeringstider, och en α-tubulin antikropp utspädning kurva visas visar mättnad. Dessutom redovisas exempel experimentella resultat för doxorubicin-behandlade celler använder optimerade parametrar.

Exponeringstid - Fastställa signal utbrändhet
Signalen utbrändhet kan uppstå när urin och peroxid substratet är slut för snabbt. Detta kan bestämmas genom att undersöka data på olika chemiluminescence exponeringstider. I analys programvara, gå till ”redigera – &#62; analys – &#62; bilder”. Exponeringar som sträcker sig från 5 till 480 s. Y-axeln i ett elektroferogram rapporterar signal/tid, så data från varje exponering bör ha en liknande signal/tid koefficient. Denna koefficient minskar med sekventiellt längre exponeringar om urin blir uttömda, som sett med p53-1 antikroppen (figur 2). På grund av substrat utarmning, denna analys som kan anses vara mätbara upp till 0,2 µg/µL koncentrationen endast på 5-30 s exponeringar. Därför, i det här exemplet 15 s var fast besluten att vara optimala data analys exponeringstiden för p53.
Lysate titrering - Att fastställa linjär dynamik
Det är viktigt att mätningar göras inom varje analys, linjär dynamiska omfång där förändringar i signalen mätt som topparean är proportionell mot förändringar av mängden protein i provet. Med hjälp av optimal exponeringstid av 15 s valda i föregående avsnitt, assay linjäritet demonstreras för både p53 och ɑ-tubulin över större än ett 15-fold utbud av koncentration (figur 3). Vår erfarenhet, R2 värdet &#62; 0,9 av en linjär regression som passar anses vara godtagbart för en utspädning rad renat protein av känd mängd (om analysen är en absolut kvantitativ mätning) eller prov lysate okänt mål protein (om analys är en relativ kvantitativ mätning).
Optimering av antikropp utspädning
Antikroppar vid mättar koncentrationer hjälper till att säkerställa att signalförändringar mätt rakt endast till förändringar i protein belopp. Som en demonstration, två BEAS-2B cellinje hela cellen extrakt (0.2 µg/µL totalprotein lästs in analysen) var utforskad med seriellt utspädda ɑ-tubulin antikropp koncentrationer från 1:25 - 1:800 (figur 4). Kemiluminiscens signal (här mätt som topparean) var plottas mot antikropp utspädning. Mättnad observerades nära 1:50 utspädning där kurvan börjar en märkbar platå.
Experimentellt försöket - Doxorubicin behandling i BEAS-2B celler
Med optimerad assay villkor, BEAS-2B cellkultur behandlades med tre olika koncentrationer av doxorubicin (1,2, 1.8 och 2.4 µg/mL) i 4 h (figur 5, tabell 1). Aktiveringen av p53 genom post-translationella modifieringar förmedlar flera cellulära svar, inklusive cellcykelarrest, åldras och apoptos12. Specifikt har fosforyleringen av serine 15 tillskrivits transkriptionell aktiveringen av p53, som leder till apoptos efter doxorubicin behandling13. I denna demonstration normaliserade ɑ-tubulin peak områden presenteras som vik av kontroll. Intressant, 3,5 till 4-faldig ökning av p53 fosforylering på Serin 15 och 2-faldig ökning nivån av p53 fosforyleras på Serin 20 observerades efter 4 h exponering för doxorubicin. Dessa resultat tyder på aktiveringen av p53; dock ingen dos-respons ses vid de koncentrationer som valt (däremot den lägsta testade dosen framkallade den högsta Svaren). Totala p53 visat inte ett tydligt behandlingssvar i detta modellsystem. Vi har tidigare observerat aktiveringen av p53 fosforylering i avsaknad av ökade nivåer av totala p53 under liknande förhållanden i zink-behandlade BEAS-2B celler14.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig2v3.jpg"> 
Figur 2 . Exponering bild jämförelse att upptäcka signal utbrändhet. Lane visningar Visa minskar protein koncentrationer för BEAS-2B lysates utforskad med p53-1 antikroppar vid en spädningsgrad av 1: 500. Chemiluminescence signal koefficienter, rapporteras som peak höjder i instrument-programvaran är överlagrade. Till skillnad från peak höjderna, visuella band stödnivåerna automatiskt genereras och justeras av de hjälpmedel för att visning av band och är inte jämförbara från en panel till en annan. Notera att minskningen i chemiluminescence signal som exponering ökar, med den signalen som börjar försvinna (split topp) på de två längsta exponeringar, som anger substrat utarmning. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig2v3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig3v3.jpg"> 
Figur 3 . Lysate titrering visar vyerna lane. Lysate titrering visar lane visningar (A) i BEAS-2B lysate när utforskad med 1: 500 p53-1 eller 1:50 ɑ-tubulin. Till skillnad från peak området värdena, de visuella band stödnivåerna automatiskt genereras och justeras av de hjälpmedel för att visning av band och är inte jämförbara från en panel till en annan. Linjär regressionsanalys (B) bekräftar analyserna är linjärt över hela sortimentet testas, från 0,01 till 0,20 µg/µL och 0,025 till 0,40 µg/µL, med R2 värden 0,999 och 0.985, respektive. Totalprotein koncentrationer mitt i det linjära området valdes att rymma potentiella mål protein variation i endera riktningen (t.ex., 0.2 µg/µL för α-tubulin). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig3v3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig4.jpg"> 
Figur 4 . Α-tubulin antikropp utspädning kurvor för två separata BEAS-2B protein lysates med och utan baslinje normalisering. En bestämd avdelningTure från linjäritet ses vid 1:50 (0,02) utspädning, vilket indikerar mättnad. 1:50 valdes därför som den optimala utspädningen för denna antikropp. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig5.jpg"> 
Figur 5. Effekten av 4 h doxorubicin (DXN) behandling på totalt och serin fosforyleras p53 proteinuttryck för BEAS-2B celler. Topp områden är normaliserad till α-tubulin och ritade som vik av kontroll (CTL). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/55911/55911tbl1.jpg"> 
Tabell 1. Effekten av 4 h doxorubicin (DXN) behandling på totalt och serin fosforyleras p53 proteinuttryck för BEAS-2B celler. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911tbl1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna tabell.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method at JoVE.com

Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method

En kapillär-baserad immunoassay med användande av en kommersiell plattform för att mäta målproteiner från totalprotein preparat demonstreras. Dessutom är assay parametrarna av exponeringstid, proteinkoncentration och antikropp utspädning optimerade för en modell för cellodlingssystem.

Förfarande och nyckel optimering strategier för en automatiserad kapillär elektrofores-baserad Immunoassay metod

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Optimization of the Ugi Reaction Using Parallel Synthesis and Automated Liquid Handling

Optimering av Ugi Reaktion Använda Parallell Syntes och automatiserade Vätskehantering

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described.  Triplicate runs ...

Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay Testing Methodology and Troubleshooting

Multiplexade Fluorometrisk immunoassay testmetoder och felsökning

To ensure the quality of animal models used in biomedical research we have developed a number of diagnostic testing strategies and methods to determine if ...

Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies

Polymerase Chain Reaction: Basic protokoll Plus Felsökning och optimering strategier

In the biological sciences there have been technological advances that catapult the discipline into golden ages of discovery. For example, the field of ...

Spatial Multiobjective Optimization of Agricultural Conservation Practices using a SWAT Model and an Evolutionary Algorithm

Spatial multiobjektiv Optimering av jordbruket Bevarande metoder med en SWAT modell och en evolutionär algoritm

Finding the cost-efficient (i.e., lowest-cost) ways of targeting conservation practice investments for the achievement of specific water quality goals ...

LeafJ: An ImageJ Plugin for Semi-automated Leaf Shape Measurement

LeafJ: En ImageJ Plugin för halvautomatisk bladform Mätning

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the ...

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

En känslig och specifik Kvantifiering Metod för fastställande av Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C av elektrokemiluminiscens Immunoassay

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

En innovativ metod för Exosome Kvantifiering och storlek Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...