Name: a standardized approach for multispecies purification of mammalian male germ cells by mechanical tissue dissociation and flow cytometry
Uploaded: 2017-07-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry at JoVE.com

Forfatterne takker Hillside Animal Hospital (St. Louis, MO) til hunde testikler; Jason Arand og Dr. Ted Cicero&#39;s lab ved Washington University i St. Louis (WashU) for at give rotte testikler og Brianne Tabers for at hjælpe med samlingen; Jared Hartsock og Dr. Salt&#39;s Lab at WashU til marsvin testes; Og Dr. Michael Talcott ved Division of Comparative Medicine på WashU til miniature gris testis. Forfatterne anerkender også Alvin J. Siteman Cancer Center ved Washington University School of Medicine og Barnes-Jewish Hospital i St. Louis, MO, til brug for Siteman Flow Cytometry Core, som leverede personaleopereret cellesorteringstjeneste. Siteman Cancer Center støttes delvist af NCI Cancer Center Support Grant # P30 CA91842. Denne forskning blev finansieret af et FCT-stipendium [SFRH / BD / 51695/2011 til ACL], tilskud fra De Forenede Nationers National Institutes of Health [R01HD078641 og R01MH101810 til DFC] og en FCT-forskningskontrakt [IF / 01262/2014 til AML].

Alle procedurer beskrevet nedenfor overholdt forskrifterne fra Animal Studies Committee ved Washington University i St. Louis. 1. Forberedelser til mekanisk dissociation protokol <ol><li> For-våd en 50 μm disponibel vævs-disaggregeringspatron til dissociation af en hel murint testis. BEMÆRK: Denne disponible vævsopdelingspatron indeholder mikroblader, der er designet til opskæring af væv og et immobilt stålnet med ca. 100 sekskantede huller. Forskellige stø...

<ol>
	<li>Bastos, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis.">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).</li><li>Gaysinskaya, V., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+murine+spermatocytes.">Flow cytometry of murine spermatocytes.</a> Curr Protoc Cytom. 72, (2015).</li><li>Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+for+gene+expression+studies+in+Mammalian+spermatogenesis.">Flow cytometry for gene expression studies in Mammalian spermatogenesis.</a> Cytogenet Genome Res. 128 (1-3), 46-56 (2010).</li><li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells.">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li><li>Lima, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispecies+Purification+of+Testicular+Germ+Cells.">Multispecies Purification of Testicular Germ Cells.</a> Biol Reprod. , (2016).</li><li>Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+spermatogenic+cell+types+using+STA-PUT+velocity+sedimentation.">Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation.</a> J Vis Exp. (80), (2013).</li><li>Chang, Y. F., Lee-Chang, J. S., Panneerdoss, S., MacLean, J. A., Rao, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Sertoli,+Leydig,+and+spermatogenic+cells+from+the+mouse+testis.">Isolation of Sertoli, Leydig, and spermatogenic cells from the mouse testis.</a> Biotechniques. 51 (5), (2011).</li><li>Margolin, G., Khil, P. P., Kim, J., Bellani, M. A., Camerini-Otero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+transcriptome+analysis+of+mouse+spermatogenesis.">Integrated transcriptome analysis of mouse spermatogenesis.</a> BMC Genomics. 15, 39 (2014).</li><li>Grogan, W. M., Farnham, W. F., Sabau, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+analysis+and+sorting+of+viable+mouse+testis+cells.">DNA analysis and sorting of viable mouse testis cells.</a> J Histochem Cytochem. 29 (6), 738-746 (1981).</li><li>Mays-Hoopes, L. L., Bolen, J., Riggs, A. D., Singer-Sam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+spermatogonia,+spermatocytes,+and+round+spermatids+for+analysis+of+gene+expression+using+fluorescence-activated+cell+sorting.">Preparation of spermatogonia, spermatocytes, and round spermatids for analysis of gene expression using fluorescence-activated cell sorting.</a> Biol Reprod. 53 (5), 1003-1011 (1995).</li><li>Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+flow+cytometry+isolation+of+murine+spermatocytes.">Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes.</a> Cytometry A. 85 (6), 556-565 (2014).</li><li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo.">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li><li>Watson, J. V., Nakeff, A., Chambers, S. H., Smith, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+fluorescence+emission+spectrum+analysis+of+Hoechst-33342-stained+DNA+in+chicken+thymocytes.">Flow cytometric fluorescence emission spectrum analysis of Hoechst-33342-stained DNA in chicken thymocytes.</a> Cytometry. 6 (4), 310-315 (1985).</li><li>Lassalle, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Side+Population'+cells+in+adult+mouse+testis+express+Bcrp1+gene+and+are+enriched+in+spermatogonia+and+germinal+stem+cells.">'Side Population' cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells.</a> Development. 131 (2), 479-487 (2004).</li><li>Omran, H. M., Bakhiet, M., Dashti, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+integrity+is+a+critical+molecular+indicator+for+the+assessment+of+male+infertility.">DNA integrity is a critical molecular indicator for the assessment of male infertility.</a> Mol Med Rep. 7 (5), 1631-1635 (2013).</li><li>Rodriguez-Casuriaga, R., Folle, G. A., Santinaque, F., Lopez-Carro, B., Geisinger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+technique+for+the+preparation+of+testicular+cell+suspensions.">Simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li><li>Rodriguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santinaque, F. F., Lopez-Carro, B., Folle, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-purity+flow+sorting+of+early+meiocytes+based+on+DNA+analysis+of+guinea+pig+spermatogenic+cells.">High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells.</a> Cytometry A. 79 (8), 625-634 (2011).</li><li>Rodriguez-Casuriaga, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+preparation+of+rodent+testicular+cell+suspensions+and+spermatogenic+stages+purification+by+flow+cytometry+using+a+novel+blue-laser-excitable+vital+dye.">Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye.</a> MethodsX. 1, 239-243 (2014).</li><li>Rodriguez-Casuriaga, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-fast+and+optimized+method+for+the+preparation+of+rodent+testicular+cells+for+flow+cytometric+analysis.">Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis.</a> Biol Proced Online. 11, 184-195 (2009).</li><li>Hess, R. A., Renato de Franca, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis+and+cycle+of+the+seminiferous+epithelium.">Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium.</a> Adv Exp Med Biol. 636, 1-15 (2008).</li><li>Zhao, H., Traganos, F., Dobrucki, J., Wlodkowic, D., Darzynkiewicz, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+DNA+damage+response+by+the+supravital+probes+of+nucleic+acids.">Induction of DNA damage response by the supravital probes of nucleic acids.</a> Cytometry A. 75 (6), 510-519 (2009).</li><li>Gassei, K., Ehmcke, J., Dhir, R., Schlatt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+activated+cell+sorting+allows+isolation+of+spermatogonia+from+adult+primate+testes+and+reveals+distinct+GFRa1-positive+subpopulations+in+men.">Magnetic activated cell sorting allows isolation of spermatogonia from adult primate testes and reveals distinct GFRa1-positive subpopulations in men.</a> J Med Primatol. 39 (2), 83-91 (2010).</li><li>Hayama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+selection+methods+for+rat+and+mouse+round+spermatids+without+DNA+staining+by+flow+cytometric+cell+sorting.">Practical selection methods for rat and mouse round spermatids without DNA staining by flow cytometric cell sorting.</a> Mol Reprod Dev. 83 (6), 488-496 (2016).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+selection+of+valuable+mutant+mouse+round+spermatids+and+strain+rescue+via+round+spermatid+injection.">FACS selection of valuable mutant mouse round spermatids and strain rescue via round spermatid injection.</a> Zygote. 23 (3), 336-341 (2015).</li></ol>

I betragtning af den stærkt konserverede chromatindynamik under spermatogenese hos pattedyr var målet med dette arbejde at udvikle en protokol til isolering af mandlige kønsceller i forskellige stadier af differentiering fra forskellige pattedyrs testikelvæv ( figur 1 ). En af de største hindringer i anvendelsen af ​​en enkelt arbejdsgang til forskellige dyremodeller er behovet for arterespecifikke tilpasninger, især med hensyn til vævsdissociationprotokoller. Nuværende metoder ...

På grund af manglen på et in vitro- system, der er repræsentativt for spermatogenese-progression, og tilstedeværelsen af ​​stor cellulær heterogenitet i testis kræver undersøgelser af mandlig kimcellebiologi robuste teknikker til at isolere berigede populationer af specifikke celletyper. Fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) er blevet anvendt i vid udstrækning til dette formål 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , da det giver høj udbytte og renhed og overgår andre isoleringsmetoder i antallet af kimcelletyper, som den kan identificere og Vælg 6 , 7 , 8 . Princippet om flowcytometrianalyse er baseret på påvisning af differentielle lysmønstre efter laserstråle-excitation af enkeltceller. Når en celle passerer gennem laseren, afspejler den / spredter lysetI alle vinkler, proportional med cellestørrelse (forward scatter; FSC) og til intracellulær kompleksitet (side scatter; SSC). Se Ormerod 9 for detaljerede oplysninger om flowcytometri. Mandlige kønsceller undergår specifikke modifikationer i DNA-indhold, kromatinstruktur, størrelse og form gennem forskellige stadier af spermatogenese. Således kan forskellige cellepopulationer identificeres og adskilles ved at kombinere lysfordeling og DNA-farvning med fluorescerende farvestoffer 10 , 11 . Adskillige farvestoffer kan anvendes til dette formål (gennemgået i Geisinger og Rodriguez-Casuriaga 3 ), såsom Hoechst-33342 (Hoechst), som ofte har været anvendt i flowcytometrianalyse af testikelceller i det sidste årti 1 , 2 , 4 , 10 , 12 . UpoN excitation med UV-lys udsender Hoechst blå fluorescens proportionalt med det cellulære DNA-indhold, mens langt rødt fluorescens afspejler variabilitet i kromatinstruktur og komprimering 1 , 13 , 14 . Som et resultat udviser male kimceller i forskellige trin af differentiering specifikke mønstre under FACS af Hoechst-farvede enkeltcellesuspensioner (Ho-FACS; 1 , 12 ). Interessant nok er intensiteten af ​​Hoechst-blå fluorescens på grund af en mekanisme for farveudstrømning, der kun er aktiv under spermatogoniumfasen, ikke proportional med chromatinindholdet i disse celler, og de klynker som en sidepopulation under Ho-FACS 15 . Desuden giver kombination af Hoechst-farvning med det ikke-permeante farvestofpropidiumiodid (PI) brugere mulighed for at diskriminere levende (PI-negative) fra døde (PI-positive) celler under FACS 1 &lt;Sup&gt;, 2 , 10 , 12 . Denne strategi er tidligere blevet anvendt i flowcytometriske analyser af testikelkimceller og optimeret meget i musen for at diskriminere op til 9 kimcelletyper, herunder celler i 4 forskellige stadier af meiose I 1 , 2 , 4 , 16 . Med henblik på dette arbejde har Hoechst-farvning tre hovedfordele. For det første er Ho-FACS blevet anvendt succesfuldt på isoleringen af ​​hankimceller i musemodellen 1 , 2 , 12 og andre gnavere såsom rotte og marsvin 17 , 18 , 19 . For det andet er Hoechst et cellepermeant farvestof og kræver ikke membranpermeabilisering, så det preserVes celle integritet. Endelig kræves ingen RNase-behandling, da Hoechst binder fortrinsvis til poly (d [AT]) DNA-sekvenser 1 , 20 , hvilket betyder, at RNA bevares og ud over DNA og proteiner kan anvendes til yderligere nedstrøms molekylære undersøgelser af kim Celle differentiering. På trods af ligheden i DNA-ploidi og / eller farvningsevne observeret i flowcytometrianalyser af pattedyrsarter (gennemgået i Geisinger og Rodriguez-Casuriaga 3 ) har der været en stor variabilitet i protokollerne beskrevet for mannlig bakteriecelleisolering ved flowcytometri. Forskellige undersøgelser har anvendt specifikke protokoller til vævsdissociation og anvendte forskellige DNA-bindende farvestoffer (alene eller i kombination) og FACS-gatingstrategier i forskellige modelorganismer, hovedsagelig musen, rotte og marsvin. Derfor kan direkte sammenligning af data indsamlet for forskellige arter påvirkes af unaccoUnted tekniske artefakter som følge af variabilitet mellem metoder. Det er vigtigt, at den slående bevarelse af chromatin-dynamik gennem pattedyrspermatogenese (2N-4N-2N-1N) antyder, at en standardiseret protokol kan anvendes tværgående på en række pattedyrsarter. Målet med denne undersøgelse var at udvikle en enkelt arbejdsgang, der kan anvendes på forskellige pattedyrarter ved at kombinere og tilpasse tidligere offentliggjorte teknikker 2 , 20 . Standardisering af en fremgangsmåde til vævsbehandling blev opnået ved at udføre mekanisk dissociation for at overvinde behovet for arterespecifikke tilpasninger, der kræves til enzymatisk fordøjelse 5 . Det er bemærkelsesværdigt, at mekanisk dissociation af gnavere testikelvæv har vist sig at udføre bedre end enzymatisk vævsfordøjelse 20 og Ho-FACS af enkeltcellesuspensioner frembragt ved begge metoder udviserDet sammenlignelige resultater 5 . Som principprincip beskriver denne protokol de indstillinger, der anvendes til at isolere op til 5 kimcellepopulationer: spermatogonia (SPG); Primære (SPC I) og sekundære spermatocytter (SPC II) og spermatider (SPD) - runde (rSPD) og forlængelse (eSPD). Det er vigtigt, at det er let at gennemføre i laboratoriet, hvor hovedkravene er systemet til vævsdissociation og adgang til en celle sorterer udstyret med en UV laser. Denne arbejdsgang ( Figur 1 ) er hurtig og ligetil og tillader samtidig isolering af 4 bakteriepopulationer fra frisk testikelvæv på mindre end 2 timer. Den reducerede behandlingstid er afgørende for at opretholde cellulær integritet til yderligere nedstrøms procedurer. Desuden tyder den succesfulde præstation i 5 forskellige arter, at den kan anvendes bredt i pattedyrskladet, hvilket gør den til den ideelle metode til at isolere kønsceller til sammenlignende studier af pattedyrs reproduktiv biollogi. Denne protokol består af tre hovedafsnit, bortset fra forberedende trin: (1) den mekaniske dissociation af testikelvæv og (2) farvning af testikelceller med Hoechst og PI efterfulgt af (3) FACS sortering af relevante spermatogene celler. Når de er opsamlet, kan disse berigede populationer af forskellige mammale testikulære kimceller anvendes til en lang række anvendelser. Denne protokol beskriver en dissociationmetode &quot;one-size fits all&quot; for at rense manlige kønsceller fra mange forskellige pattedyrsarter. Afhængigt af typen af ​​undersøgelse, som brugerne ønsker at udføre med de isolerede kimceller, kan andre medier eller buffere anvendes. De følgende protokolstrin er til generering af encellesuspensioner fra en hel murint testis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="731">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:239px;">4% paraformaldehyde</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">#15710</td>
			<td style="width:279px;">4% PFA, For fixing sorted cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Medimachine</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#340588;</td>
			<td>System for testis dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1X Dulbecco modified Eagle medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#31053</td>
			<td>DMEM, for testis dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Medicon</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#340591</td>
			<td>Disaggregation cartridge for testis dissociation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#10082139</td>
			<td>FBS, for FACS ceollction</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#H3570</td>
			<td>Hoecsht, For FACS staining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">40&#181;m cell strainer</td>
			<td>GREINER BIO-ONE</td>
			<td>#89508-342</td>
			<td>For testis dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100x 15mm petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#351029</td>
			<td>For testis dissection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5mL polypropylene round-bottom tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#352063</td>
			<td>For FACS collection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5mL Eppendorf tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#20170-650</td>
			<td>For FACS collection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3mL needless syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#309657</td>
			<td>For testis dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50mL conical tube</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>#C50R</td>
			<td>For testis dissociation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Propidium Iodide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#L7011</td>
			<td>PI, For FACS staining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MoFlo&#160;Legacy cell sorter</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>#ML99030</td>
			<td>For FACS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Summit Cell Sorting software</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>#ML99030</td>
			<td>For FACS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate buffered saline&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>#AM9625</td>
			<td>PBS, For microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscopic glass slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#12-544-4</td>
			<td>For microscopy&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>#12-548-87</td>
			<td>For microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Disposable transfer pipette (3mL)&#160;</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>#225</td>
			<td>For testis dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNase I&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>#10104159001</td>
			<td>For testis dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carbon steel surgical blade</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>#4-111</td>
			<td>For testis dissection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Countess automated cell counter&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#C10227&#160;</td>
			<td>For automatic cell counting&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypan blue solution (0.4%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#T8154</td>
			<td>For viability staining&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a standardized approach for multispecies purification of mammalian male germ cells by mechanical tissue dissociation and flow cytometry

Fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) har været en af ​​de metoder, der er valgfri til at isolere berigede populationer af pattedyrs testikulære kimceller. I øjeblikket tillader det diskriminering af op til 9 murine kimcellepopulationer med højt udbytte og renhed. Denne højopløsning i diskriminering og rensning er mulig på grund af unikke ændringer i kromatinstruktur og mængde i hele spermatogenese. Disse mønstre kan fanges ved hjælp af flowcytometri hos hankimceller farvet med fluorescerende DNA-bindende farvestoffer, såsom Hoechst-33342 (Hoechst). Heri er en detaljeret beskrivelse af en nyudviklet protokol til isolering af pattedyrs testikelkimceller. Kortfattet frembringes enkeltcellesuspensioner fra testikelvæv ved mekanisk dissociation, dobbeltfarvet med Hoechst og propidiumiodid (PI) og behandlet ved flowcytometri. En seriel gating-strategi, herunder udvælgelsen af ​​levende celler (PI-negative) med forskellige DNA-indhold (Hoechst-intensitet), jegS anvendt under FACS sortering for at diskriminere op til 5 bakterie celletyper. Disse indgår med tilsvarende gennemsnitlige renheder (bestemt ved mikroskopi evaluering): spermatogoni (66%), primære (71%) og sekundære (85%) spermatocytter og spermatider (90%), yderligere adskilt i runde (93%) og forlængende (87%) subpopulationer. Udførelse af hele arbejdsgangen er ligetil, giver mulighed for isolering af 4 celletyper samtidigt med den relevante FACS-maskine og kan udføres på mindre end 2 timer. Da reduceret behandlingstid er afgørende for at bevare fysiologien af ex vivo celler, er denne metode ideel til nedstrøms høj-gennemstrømningsundersøgelser af mandlig kimcellebiologi. Desuden eliminerer en standardiseret protokol til multispecies oprensning af mammakimceller metodologiske kilder til variabler og tillader et enkelt sæt reagenser at blive anvendt til forskellige dyremodeller.

Enkeltcellesuspensioner fra mekanisk dissociation af testikelvæv Figur 2 sammenligner enkeltcellesuspensioner opnået ved mekanisk dissociation af mus-testikelvæv under forskellige betingelser. Prøver opnået ved behandling af frisk væv, ufarvet ( Figur 2A ) eller farvet med Hoechst ( Figur 2B ), viser tilstedeværelsen af ​​enkeltce...

Watch this Scientific Journal Video about A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry at JoVE.com

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Dette værk beskriver standardiseringen af ​​en metode til opnåelse af rensede kimcellepopulationer fra testikelvæv af forskellige pattedyrsarter. Det er en simpel protokol, der kombinerer mekanisk testis dissociation, farvning med Hoechst-33342 og propidiumiodid og FACS sortering, med brede anvendelser i sammenlignende undersøgelser af reproduktionstoksikologisk biologi.

En standardiseret tilgang til multispecies Rensning af mammale mannlige germeller ved hjælp af mekanisk vævsdissociation og flowcytometri

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

Trin-specifik Sortering af Mouse spermatider ved flowcytometri

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Identifikation af erythromyeloidprogenitorer og deres afkom i musembryoen ved flowcytometri

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

Isolering og analysere celler i bugspytkirtlen mesenchym ved flowcytometri

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horisontal Hel Mount: En Novel Processing and Imaging Protocol for Tykke, Tredimensionale Tissue Tværsnit af Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome

Brug af hæmatopoietisk stamcelletransplantation at vurdere oprindelsen af myelodysplastisk syndrom

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood ...

Real-time Live-cell Flow Cytometry to Investigate Calcium Influx, Pore Formation, and Phagocytosis by P2X7 Receptors in Adult Neural Progenitor Cells

Realtids Live-celle flowcytometri at undersøge Calcium tilstrømning, Pore dannelse og fagocytose af P2X7 receptorer i voksne neurale stamceller

Live-cell flow cytometry is increasingly used among cell biologists to quantify biological processes in a living cell culture. This protocol describes a ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro Generation af Somite derivater fra menneskelige induceret celler pluripotente stamceller

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging

Kortlægning af den emergente rumlige organisering af pattedyrsceller ved hjælp af Mikromønstre og kvantitativ billeddannelse

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro ...

RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse

RiboTag Immunudffældning i kimcellerne i den mandlige mus

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, ...

Detection and Quantitation of Label-Retaining Cells in Mouse Incisors using a 3D Reconstruction Approach after Tissue Clearing

Påvisning og kvantificering af etiketbevarende celler i musefortænder ved hjælp af en 3D-rekonstruktionstilgang efter vævsrydning

The murine incisor is an organ that grows continuously throughout the lifespan of the mouse. The epithelial and mesenchymal stem cells residing in the ...