Name: a standardized approach for multispecies purification of mammalian male germ cells by mechanical tissue dissociation and flow cytometry
Uploaded: 2017-07-12T14:00:00
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Les auteurs remercient l&#39;hôpital Hillside Animal (St. Louis, MO) pour les testicules de chien; Jason Arand et le laboratoire du Dr Ted Cicero à l&#39;Université de Washington à St. Louis (WashU) pour fournir des testicules de rat et Brianne Tabers pour aider à la collecte; Jared Hartsock et Dr. Salt&#39;s Lab à WashU pour les testicules de guinée; Et le Dr Michael Talcott à la Division de la médecine comparée chez WashU pour les testicules miniatures de porc. Les auteurs reconnaissent également le Alvin J. Siteman Cancer Center à la Washington University School of Medicine et Barnes-Jewish Hospital à St. Louis, MO, pour l&#39;utilisation de Siteman Flow Cytometry Core, qui a fourni un service de tri cellulaire. The Siteman Cancer Center est soutenu en partie par la subvention de soutien NCI Cancer Center # P30 CA91842. Cette recherche a été financée par une bourse de doctorat de FCT [SFRH / BD / 51695/2011 à ACL], des subventions des National Institutes of Health des États-Unis [R01HD078641 et R01MH101810 à DFC] et un contrat de recherche FCT [IF / 01262/2014 à AML].

Toutes les procédures décrites ci-dessous ont respecté les règlements du comité des études animales de l&#39;Université de Washington à St. Louis. 1. Préparations pour le protocole de dissociation mécanique <ol><li> Pré-mouiller une cartouche de désagrégation de tissu jetable de 50 μm pour la dissociation d&#39;un testicule murin entier. REMARQUE: cette cartouche jetable de désagrégation de tissu contient des micro-lames conçues pour couper des tiss...

<ol>
	<li>Bastos, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis.">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).</li><li>Gaysinskaya, V., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+murine+spermatocytes.">Flow cytometry of murine spermatocytes.</a> Curr Protoc Cytom. 72, (2015).</li><li>Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+for+gene+expression+studies+in+Mammalian+spermatogenesis.">Flow cytometry for gene expression studies in Mammalian spermatogenesis.</a> Cytogenet Genome Res. 128 (1-3), 46-56 (2010).</li><li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells.">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li><li>Lima, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispecies+Purification+of+Testicular+Germ+Cells.">Multispecies Purification of Testicular Germ Cells.</a> Biol Reprod. , (2016).</li><li>Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+spermatogenic+cell+types+using+STA-PUT+velocity+sedimentation.">Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation.</a> J Vis Exp. (80), (2013).</li><li>Chang, Y. F., Lee-Chang, J. S., Panneerdoss, S., MacLean, J. A., Rao, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Sertoli,+Leydig,+and+spermatogenic+cells+from+the+mouse+testis.">Isolation of Sertoli, Leydig, and spermatogenic cells from the mouse testis.</a> Biotechniques. 51 (5), (2011).</li><li>Margolin, G., Khil, P. P., Kim, J., Bellani, M. A., Camerini-Otero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+transcriptome+analysis+of+mouse+spermatogenesis.">Integrated transcriptome analysis of mouse spermatogenesis.</a> BMC Genomics. 15, 39 (2014).</li><li>Grogan, W. M., Farnham, W. F., Sabau, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+analysis+and+sorting+of+viable+mouse+testis+cells.">DNA analysis and sorting of viable mouse testis cells.</a> J Histochem Cytochem. 29 (6), 738-746 (1981).</li><li>Mays-Hoopes, L. L., Bolen, J., Riggs, A. D., Singer-Sam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+spermatogonia,+spermatocytes,+and+round+spermatids+for+analysis+of+gene+expression+using+fluorescence-activated+cell+sorting.">Preparation of spermatogonia, spermatocytes, and round spermatids for analysis of gene expression using fluorescence-activated cell sorting.</a> Biol Reprod. 53 (5), 1003-1011 (1995).</li><li>Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+flow+cytometry+isolation+of+murine+spermatocytes.">Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes.</a> Cytometry A. 85 (6), 556-565 (2014).</li><li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo.">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li><li>Watson, J. V., Nakeff, A., Chambers, S. H., Smith, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+fluorescence+emission+spectrum+analysis+of+Hoechst-33342-stained+DNA+in+chicken+thymocytes.">Flow cytometric fluorescence emission spectrum analysis of Hoechst-33342-stained DNA in chicken thymocytes.</a> Cytometry. 6 (4), 310-315 (1985).</li><li>Lassalle, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Side+Population'+cells+in+adult+mouse+testis+express+Bcrp1+gene+and+are+enriched+in+spermatogonia+and+germinal+stem+cells.">'Side Population' cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells.</a> Development. 131 (2), 479-487 (2004).</li><li>Omran, H. M., Bakhiet, M., Dashti, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+integrity+is+a+critical+molecular+indicator+for+the+assessment+of+male+infertility.">DNA integrity is a critical molecular indicator for the assessment of male infertility.</a> Mol Med Rep. 7 (5), 1631-1635 (2013).</li><li>Rodriguez-Casuriaga, R., Folle, G. A., Santinaque, F., Lopez-Carro, B., Geisinger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+technique+for+the+preparation+of+testicular+cell+suspensions.">Simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li><li>Rodriguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santinaque, F. F., Lopez-Carro, B., Folle, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-purity+flow+sorting+of+early+meiocytes+based+on+DNA+analysis+of+guinea+pig+spermatogenic+cells.">High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells.</a> Cytometry A. 79 (8), 625-634 (2011).</li><li>Rodriguez-Casuriaga, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+preparation+of+rodent+testicular+cell+suspensions+and+spermatogenic+stages+purification+by+flow+cytometry+using+a+novel+blue-laser-excitable+vital+dye.">Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye.</a> MethodsX. 1, 239-243 (2014).</li><li>Rodriguez-Casuriaga, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-fast+and+optimized+method+for+the+preparation+of+rodent+testicular+cells+for+flow+cytometric+analysis.">Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis.</a> Biol Proced Online. 11, 184-195 (2009).</li><li>Hess, R. A., Renato de Franca, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis+and+cycle+of+the+seminiferous+epithelium.">Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium.</a> Adv Exp Med Biol. 636, 1-15 (2008).</li><li>Zhao, H., Traganos, F., Dobrucki, J., Wlodkowic, D., Darzynkiewicz, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+DNA+damage+response+by+the+supravital+probes+of+nucleic+acids.">Induction of DNA damage response by the supravital probes of nucleic acids.</a> Cytometry A. 75 (6), 510-519 (2009).</li><li>Gassei, K., Ehmcke, J., Dhir, R., Schlatt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+activated+cell+sorting+allows+isolation+of+spermatogonia+from+adult+primate+testes+and+reveals+distinct+GFRa1-positive+subpopulations+in+men.">Magnetic activated cell sorting allows isolation of spermatogonia from adult primate testes and reveals distinct GFRa1-positive subpopulations in men.</a> J Med Primatol. 39 (2), 83-91 (2010).</li><li>Hayama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+selection+methods+for+rat+and+mouse+round+spermatids+without+DNA+staining+by+flow+cytometric+cell+sorting.">Practical selection methods for rat and mouse round spermatids without DNA staining by flow cytometric cell sorting.</a> Mol Reprod Dev. 83 (6), 488-496 (2016).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+selection+of+valuable+mutant+mouse+round+spermatids+and+strain+rescue+via+round+spermatid+injection.">FACS selection of valuable mutant mouse round spermatids and strain rescue via round spermatid injection.</a> Zygote. 23 (3), 336-341 (2015).</li></ol>

Compte tenu de la dynamique de la chromatine hautement conservée pendant la spermatogenèse chez les mammifères, l&#39;objectif de ce travail était de développer un protocole pour isoler les cellules germinales masculines dans différents stades de différenciation de différents tissus testiculaires de mammifères ( figure 1 ). L&#39;un des principaux obstacles à l&#39;application d&#39;un flux de travail unique à différents modèles animaux est la nécessité d&#39;ajustements spé...

Compte tenu de l&#39;absence d&#39;un système in vitro représentatif de la progression de la spermatogenèse et de la présence d&#39;une grande hétérogénéité cellulaire chez les testicules, les études sur la biologie des cellules germinales masculines nécessitent des techniques robustes pour isoler les populations enrichies de types de cellules spécifiques. Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) a été largement utilisé à cet effet 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , car il fournit un rendement et une pureté élevés et surpasse d&#39;autres méthodes d&#39;isolement dans le nombre de types de cellules germinales qu&#39;il peut identifier et Sélectionnez 6 , 7 , 8 . Le principe de l&#39;analyse par cytométrie de flux est basé sur la détection de modèles de lumière différentielle suite à l&#39;excitation du faisceau laser de cellules individuelles. À mesure que la cellule passe à travers le laser, elle reflète / diffuse la lumièreÀ tous les angles, proportionnel à la taille de la cellule (diffusion vers l&#39;avant, FSC) et à la complexité intracellulaire (scatter latéral, SSC). Voir Ormerod 9 pour des informations détaillées sur la cytométrie en flux. Les cellules germinales mâles subissent des modifications spécifiques de la teneur en ADN, la structure de la chromatine, la taille et la forme dans différents stades de la spermatogenèse. Ainsi, des populations de cellules distinctes peuvent être identifiées et séparées en combinant la diffusion de la lumière et la coloration de l&#39;ADN avec des colorants fluorescents 10 , 11 . Plusieurs colorants peuvent être utilisés à cet effet (revus dans Geisinger et Rodriguez-Casuriaga 3 ), tels que Hoechst-33342 (Hoechst) qui a été fréquemment utilisé dans l&#39;analyse par cytométrie de flux de cellules testiculaires au cours de la dernière décennie 1 , 2 , 4 , 10 , 12 . UpoN d&#39;excitation avec la lumière UV, Hoechst émet une fluorescence bleue proportionnelle à la teneur en ADN cellulaire, alors que la fluorescence lointain reflète la variabilité dans la structure de la chromatine et la compaction 1 , 13 , 14 . En conséquence, les cellules germinales mâles dans différents stades de différenciation présentent des modèles spécifiques pendant FACS des suspensions de cellules individuelles colorées par Hoechst (Ho-FACS; 1 , 12 ). Fait intéressant, en raison d&#39;un mécanisme d&#39;efflux de colorant qui n&#39;est actif que pendant le stade spermatogoniale, l&#39;intensité de la fluorescence Hoechst bleu n&#39;est pas proportionnelle à la teneur en chromatine dans ces cellules, et elles se groupent en tant que population latérale pendant Ho-FACS 15 . De plus, la combinaison de la coloration Hoechst avec l&#39;iodure de propidium (PI) non perméable permet aux utilisateurs de discriminer en direct (PI négatif) des cellules mortes (PI positives) pendant FACS 1 &lt;Sup&gt;, 2 , 10 , 12 . Cette stratégie a été précédemment utilisée dans les analyses cytométriques de flux de cellules germinales testiculaires et optimisée de manière approfondie dans la souris pour discriminer jusqu&#39;à 9 types de cellules germinales, y compris les cellules dans 4 différents stades de la méiose I 1 , 2 , 4 , 16 . Aux fins de ce travail, la coloration Hoechst présente trois avantages principaux. Tout d&#39;abord, Ho-FACS a été appliqué avec succès à l&#39;isolement des cellules germinales masculines dans les modèles de souris 1 , 2 , 12 et d&#39;autres rongeurs tels que le rat et le cochon d&#39;Inde 17 , 18 , 19 . Deuxièmement, Hoechst est un colorant perméable aux cellules et ne nécessite pas la perméabilisation de la membrane, de sorte qu&#39;il préserveIntégrité des cellules. Enfin, aucun traitement par RNase n&#39;est requis puisque Hoechst se lie préférentiellement aux séquences d&#39;ADN 1 , 20 (ce qui signifie que l&#39;ARN est conservé et, en plus de l&#39;ADN et des protéines, peut être utilisé pour d&#39;autres études moléculaires en aval du germe différenciation cellulaire. Malgré la similitude dans la pléoïde de l&#39;ADN et / ou la colorabilité observée dans les analyses de cytométrie de flux d&#39;espèces de mammifères (revues dans Geisinger et Rodriguez-Casuriaga 3 ), il existe une grande variabilité dans les protocoles décrits pour l&#39;isolement masculin des cellules germinales par cytométrie de flux. Différentes études ont utilisé des protocoles spécifiques pour la dissociation des tissus et ont utilisé des colorants distincts liés à l&#39;ADN (seul ou en combinaison) et des stratégies de fermeture de FACS dans différents organismes modèles, principalement la souris, le rat et le cochon d&#39;inde. Par conséquent, la comparaison directe des données recueillies pour différentes espèces peut être affectée par le tabagismeDes artefacts techniques non issus de la variabilité entre les méthodologies. Il est important de noter que la conservation frappante de la dynamique de la chromatine dans la spermatogenèse des mammifères (2N-4N-2N-1N) suggère qu&#39;un protocole standardisé pourrait être appliqué transversalement à une variété d&#39;espèces de mammifères. L&#39;objectif de cette étude était de développer un flux de travail unique applicable à différentes espèces de mammifères, en combinant et en adaptant les techniques 2 , 20 précédemment publiées. La normalisation d&#39;une méthode de traitement des tissus a été obtenue en effectuant une dissociation mécanique afin de surmonter la nécessité d&#39;effectuer des ajustements propres aux espèces nécessaires à la digestion enzymatique 5 . Il est à noter que la dissociation mécanique du tissu testiculaire des rongeurs s&#39;est révélée supérieure à la digestion enzymatique des tissus 20 et Ho-FACS des suspensions de cellules individuelles générées par les deux méthodes.Des résultats comparables 5 . En tant que preuve de principe, ce protocole décrit les paramètres utilisés pour isoler jusqu&#39;à 5 populations de cellules germinales: la spermatogonie (SPG); Les spermatocytes primaires (SPC I) et les spermatocytes secondaires (SPC II) et les spermatides (SPD) - round (rSPD) et allongement (eSPD). Fait important, il est facile à mettre en œuvre dans le laboratoire, les principales exigences étant le système de dissociation des tissus et l&#39;accès à un trieur de cellules équipé d&#39;un laser UV. Ce flux de travail ( Figure 1 ) est rapide et direct et permet l&#39;isolement simultané de 4 populations de cellules germinales à partir de tissu testiculaire frais en moins de 2 h. Le temps de traitement réduit est essentiel pour maintenir l&#39;intégrité cellulaire pour d&#39;autres procédures en aval. En outre, sa performance réussie dans 5 espèces différentes suggère qu&#39;il pourrait être largement appliqué dans le clade de mammifères, ce qui en fait la méthode idéale pour isoler les cellules germinales pour des études comparatives de mammifères masculins reproducteurs biolOgy. Ce protocole est composé de trois sections majeures, en dehors des étapes préparatoires: (1) la dissociation mécanique du tissu testiculaire et (2) la coloration des cellules testiculaires avec Hoechst et PI, suivie par (3) le triage FACS de cellules spermatogènes pertinentes. Une fois recueillies, ces populations enrichies de différentes cellules germinales testiculaires de mammifères peuvent être utilisées pour une large gamme d&#39;applications. Ce protocole décrit une méthode de dissociation «unique pour tous» pour purifier les cellules germinales mâles de différentes espèces de mammifères différentes. Selon le type d&#39;étude que les utilisateurs souhaitent effectuer avec les cellules germinales isolées, d&#39;autres supports ou tampons peuvent être utilisés. Les étapes suivantes du protocole consistent à générer des suspensions monocellulaires à partir d&#39;un testicule murin entier.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="731">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:239px;">4% paraformaldehyde</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">#15710</td>
			<td style="width:279px;">4% PFA, For fixing sorted cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Medimachine</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#340588;</td>
			<td>System for testis dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1X Dulbecco modified Eagle medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#31053</td>
			<td>DMEM, for testis dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Medicon</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#340591</td>
			<td>Disaggregation cartridge for testis dissociation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#10082139</td>
			<td>FBS, for FACS ceollction</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#H3570</td>
			<td>Hoecsht, For FACS staining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">40&#181;m cell strainer</td>
			<td>GREINER BIO-ONE</td>
			<td>#89508-342</td>
			<td>For testis dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100x 15mm petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#351029</td>
			<td>For testis dissection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5mL polypropylene round-bottom tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#352063</td>
			<td>For FACS collection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5mL Eppendorf tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#20170-650</td>
			<td>For FACS collection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3mL needless syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#309657</td>
			<td>For testis dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50mL conical tube</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>#C50R</td>
			<td>For testis dissociation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Propidium Iodide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#L7011</td>
			<td>PI, For FACS staining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MoFlo&#160;Legacy cell sorter</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>#ML99030</td>
			<td>For FACS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Summit Cell Sorting software</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>#ML99030</td>
			<td>For FACS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate buffered saline&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>#AM9625</td>
			<td>PBS, For microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscopic glass slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#12-544-4</td>
			<td>For microscopy&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>#12-548-87</td>
			<td>For microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Disposable transfer pipette (3mL)&#160;</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>#225</td>
			<td>For testis dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNase I&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>#10104159001</td>
			<td>For testis dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carbon steel surgical blade</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>#4-111</td>
			<td>For testis dissection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Countess automated cell counter&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#C10227&#160;</td>
			<td>For automatic cell counting&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypan blue solution (0.4%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#T8154</td>
			<td>For viability staining&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a standardized approach for multispecies purification of mammalian male germ cells by mechanical tissue dissociation and flow cytometry

Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) a été l&#39;une des méthodes de choix pour isoler les populations enrichies de cellules germinales testiculaires de mammifères. Actuellement, il permet de discriminer jusqu&#39;à 9 populations de cellules germinales murines à haut rendement et à la pureté. Cette résolution élevée en matière de discrimination et de purification est possible en raison de changements uniques dans la structure et la quantité de la chromatine pendant la spermatogenèse. Ces motifs peuvent être capturés par cytométrie de flux de cellules germinales mâles colorées avec des colorants fluorescents liés à l&#39;ADN tels que Hoechst-33342 (Hoechst). Voici une description détaillée d&#39;un protocole récemment développé pour isoler les cellules germinales testiculaires de mammifères. En bref, des suspensions de cellules individuelles sont générées à partir du tissu testiculaire par dissociation mécanique, doublement colorées avec Hoechst et iodure de propidium (PI) et traitées par cytométrie en flux. Une stratégie de verrouillage en série, y compris le choix des cellules vivantes (PI négatif) avec une teneur différente en ADN (intensité Hoechst), iS utilisé lors du tri FACS pour discriminer jusqu&#39;à 5 types de cellules germinales. Ceux-ci incluent, avec des puretés moyennes correspondantes (déterminées par évaluation microscopique): spermatogonie (66%), spermatocytes primaires (71%) et secondaires (85%) et spermatides (90%), séparés en rond (93%) et allongés (87%) sous-populations. L&#39;exécution de l&#39;ensemble du flux de travail est simple, permet d&#39;isoler 4 types de cellules simultanément avec la machine FACS appropriée et peut être effectuée en moins de 2 h. Étant donné que le temps de traitement réduit est crucial pour préserver la physiologie des cellules ex vivo , cette méthode est idéale pour les études à haut débit en aval de la biologie des cellules germinales masculines. En outre, un protocole normalisé pour la purification multispécifique de cellules germinales de mammifères élimine les sources méthodologiques de variables et permet d&#39;utiliser un seul ensemble de réactifs pour différents modèles animaux.

Suspensions cellulaires simples de la dissociation mécanique du tissu testiculaire La figure 2 compare les suspensions de cellules individuelles obtenues par dissociation mécanique du tissu testiculaire de souris dans différentes conditions. Les échantillons obtenus en traitant du tissu frais, non colorés ( Figure 2A ) ou colorés avec Hoechst ( <strong class="xfig"...

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A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Ce travail décrit la standardisation d&#39;une méthode pour obtenir des populations de cellules germinales purifiées à partir d&#39;un tissu testiculaire de différentes espèces de mammifères. C&#39;est un protocole simple qui combine la dissociation des testicules mécaniques, la coloration avec Hoechst-33342 et l&#39;iodure de propidium, et le triage FACS, avec de larges applications dans des études comparatives de la biologie de la reproduction masculine.

Une approche standardisée pour la purification multispécifique des cellules germinales masculines de mammifères par dissociation mécanique des tissus et cytométrie de flux

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

-Étape spécifique de tri Spermatides souris par cytométrie en flux

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Recherche

Biologie du développement

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Identification des progéniteurs érythromyélidiens et de leur descendance dans l&#39;embryon de souris par cytométrie de flux

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

Isoler et analyse des cellules du pancréas Mesenchyme par cytométrie de flux

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horizontal Whole Mount: un protocole de traitement et d&#39;imagerie géniaux pour les sections transversales épaisses en tissu tridimensionnel

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome

Utilisation de la greffe de cellules souches hématopoïétiques pour évaluer l’origine du Syndrome myélodysplasique

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood ...

Real-time Live-cell Flow Cytometry to Investigate Calcium Influx, Pore Formation, and Phagocytosis by P2X7 Receptors in Adult Neural Progenitor Cells

Cytométrie en cellules vivantes en temps réel d’enquêter sur l’Influx calcique, la Formation de pores et phagocytose par les récepteurs P2X7 dans des cellules progénitrices neurales adultes

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In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging

Cartographier l'organisation spatiale émergente des cellules mammifères à l'aide de micromodèles et d'imagerie quantitative

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro ...

RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse

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