Name: a standardized approach for multispecies purification of mammalian male germ cells by mechanical tissue dissociation and flow cytometry
Uploaded: 2017-07-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry at JoVE.com

Forfatterne takker Hillside Animal Hospital (St. Louis, MO) for hundetestene; Jason Arand og Dr. Ted Cicero&#39;s lab ved Washington University i St. Louis (WashU) for å levere rotte testikler og Brianne Tabers for å bistå med samlingen; Jared Hartsock og Dr. Salt&#39;s Lab at WashU for marsvin testes; Og Dr. Michael Talcott ved divisjonen for Comparative Medicine at WashU for miniatyr gris testis. Forfatterne anerkjenner også Alvin J. Siteman Cancer Center ved Washington University School of Medicine og Barnes-Jewish Hospital i St. Louis, MO, for bruk av Siteman Flow Cytometry Core, som ga personale-operert cellesorteringstjeneste. Siteman Cancer Center støttes delvis av NCI Cancer Center Support Grant # P30 CA91842. Denne forskningen ble finansiert av et FCT-doktorgradsstudium [SFRH / BD / 51695/2011 til ACL], tilskudd fra USAs institusjoner for helse [R01HD078641 og R01MH101810 til DFC] og en FCT forskningskontrakt [IF / 01262/2014 til AML].

Alle prosedyrer beskrevet nedenfor overholdt forskrifter fra Animal Studies Committee ved Washington University i St. Louis. 1. Forberedelser for mekanisk dissesjonsprotokoll <ol><li> For-våt en 50 μm disponibel væskedispersjonskassett for dissosiasjon av en hel murint testis. MERK: Denne disponible væskedisponeringspatronen inneholder mikroblader laget for kutting av vev og et immobilt stålnett med omtrent 100 sekskantede hull. Forskjellige størrelser av nett...

<ol>
	<li>Bastos, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis.">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).</li><li>Gaysinskaya, V., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+murine+spermatocytes.">Flow cytometry of murine spermatocytes.</a> Curr Protoc Cytom. 72, (2015).</li><li>Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+for+gene+expression+studies+in+Mammalian+spermatogenesis.">Flow cytometry for gene expression studies in Mammalian spermatogenesis.</a> Cytogenet Genome Res. 128 (1-3), 46-56 (2010).</li><li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells.">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li><li>Lima, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispecies+Purification+of+Testicular+Germ+Cells.">Multispecies Purification of Testicular Germ Cells.</a> Biol Reprod. , (2016).</li><li>Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+spermatogenic+cell+types+using+STA-PUT+velocity+sedimentation.">Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation.</a> J Vis Exp. (80), (2013).</li><li>Chang, Y. F., Lee-Chang, J. S., Panneerdoss, S., MacLean, J. A., Rao, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Sertoli,+Leydig,+and+spermatogenic+cells+from+the+mouse+testis.">Isolation of Sertoli, Leydig, and spermatogenic cells from the mouse testis.</a> Biotechniques. 51 (5), (2011).</li><li>Margolin, G., Khil, P. P., Kim, J., Bellani, M. A., Camerini-Otero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+transcriptome+analysis+of+mouse+spermatogenesis.">Integrated transcriptome analysis of mouse spermatogenesis.</a> BMC Genomics. 15, 39 (2014).</li><li>Grogan, W. M., Farnham, W. F., Sabau, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+analysis+and+sorting+of+viable+mouse+testis+cells.">DNA analysis and sorting of viable mouse testis cells.</a> J Histochem Cytochem. 29 (6), 738-746 (1981).</li><li>Mays-Hoopes, L. L., Bolen, J., Riggs, A. D., Singer-Sam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+spermatogonia,+spermatocytes,+and+round+spermatids+for+analysis+of+gene+expression+using+fluorescence-activated+cell+sorting.">Preparation of spermatogonia, spermatocytes, and round spermatids for analysis of gene expression using fluorescence-activated cell sorting.</a> Biol Reprod. 53 (5), 1003-1011 (1995).</li><li>Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+flow+cytometry+isolation+of+murine+spermatocytes.">Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes.</a> Cytometry A. 85 (6), 556-565 (2014).</li><li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo.">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li><li>Watson, J. V., Nakeff, A., Chambers, S. H., Smith, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+fluorescence+emission+spectrum+analysis+of+Hoechst-33342-stained+DNA+in+chicken+thymocytes.">Flow cytometric fluorescence emission spectrum analysis of Hoechst-33342-stained DNA in chicken thymocytes.</a> Cytometry. 6 (4), 310-315 (1985).</li><li>Lassalle, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Side+Population'+cells+in+adult+mouse+testis+express+Bcrp1+gene+and+are+enriched+in+spermatogonia+and+germinal+stem+cells.">'Side Population' cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells.</a> Development. 131 (2), 479-487 (2004).</li><li>Omran, H. M., Bakhiet, M., Dashti, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+integrity+is+a+critical+molecular+indicator+for+the+assessment+of+male+infertility.">DNA integrity is a critical molecular indicator for the assessment of male infertility.</a> Mol Med Rep. 7 (5), 1631-1635 (2013).</li><li>Rodriguez-Casuriaga, R., Folle, G. A., Santinaque, F., Lopez-Carro, B., Geisinger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+technique+for+the+preparation+of+testicular+cell+suspensions.">Simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li><li>Rodriguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santinaque, F. F., Lopez-Carro, B., Folle, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-purity+flow+sorting+of+early+meiocytes+based+on+DNA+analysis+of+guinea+pig+spermatogenic+cells.">High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells.</a> Cytometry A. 79 (8), 625-634 (2011).</li><li>Rodriguez-Casuriaga, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+preparation+of+rodent+testicular+cell+suspensions+and+spermatogenic+stages+purification+by+flow+cytometry+using+a+novel+blue-laser-excitable+vital+dye.">Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye.</a> MethodsX. 1, 239-243 (2014).</li><li>Rodriguez-Casuriaga, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-fast+and+optimized+method+for+the+preparation+of+rodent+testicular+cells+for+flow+cytometric+analysis.">Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis.</a> Biol Proced Online. 11, 184-195 (2009).</li><li>Hess, R. A., Renato de Franca, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis+and+cycle+of+the+seminiferous+epithelium.">Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium.</a> Adv Exp Med Biol. 636, 1-15 (2008).</li><li>Zhao, H., Traganos, F., Dobrucki, J., Wlodkowic, D., Darzynkiewicz, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+DNA+damage+response+by+the+supravital+probes+of+nucleic+acids.">Induction of DNA damage response by the supravital probes of nucleic acids.</a> Cytometry A. 75 (6), 510-519 (2009).</li><li>Gassei, K., Ehmcke, J., Dhir, R., Schlatt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+activated+cell+sorting+allows+isolation+of+spermatogonia+from+adult+primate+testes+and+reveals+distinct+GFRa1-positive+subpopulations+in+men.">Magnetic activated cell sorting allows isolation of spermatogonia from adult primate testes and reveals distinct GFRa1-positive subpopulations in men.</a> J Med Primatol. 39 (2), 83-91 (2010).</li><li>Hayama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+selection+methods+for+rat+and+mouse+round+spermatids+without+DNA+staining+by+flow+cytometric+cell+sorting.">Practical selection methods for rat and mouse round spermatids without DNA staining by flow cytometric cell sorting.</a> Mol Reprod Dev. 83 (6), 488-496 (2016).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+selection+of+valuable+mutant+mouse+round+spermatids+and+strain+rescue+via+round+spermatid+injection.">FACS selection of valuable mutant mouse round spermatids and strain rescue via round spermatid injection.</a> Zygote. 23 (3), 336-341 (2015).</li></ol>

Med tanke på den høyt konserverte kromatindynamikken under spermatogenese hos pattedyr, var målet med dette arbeidet å utvikle en protokoll for å isolere mannlige kimceller i forskjellige stadier av differensiering fra forskjellige pattedyrs testikulære vev ( figur 1 ). En av de største hindringene ved bruk av en enkelt arbeidsflyt til forskjellige dyremodeller er behovet for arterespesifikke tilpasninger, spesielt når det gjelder vevdissociasjonsprotokoller. Nåværende metoder er ...

På grunn av mangelen på et in vitro- system som er representative for spermatogeneseprogresjonen, og tilstedeværelsen av stor cellulær heterogenitet i testis, krever studier av mannlig kimcellebiologi robuste teknikker for å isolere berikede populasjoner av spesifikke celletyper. Fluorescensaktivert cellesortering (FACS) har blitt mye brukt til dette formål 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , da det gir høyt utbytte og renhet, og overgår andre isolasjonsmetoder i antall bakterieformer som den kan identifisere og Velg 6 , 7 , 8 . Prinsippet for strømningscytometrianalyse er basert på deteksjon av differensielle lysmønstre etter laserstråle-eksitering av enkeltceller. Når en celle passerer gjennom laseren, reflekterer den / sprer lysetI alle vinkler, proporsjonal med cellestørrelse (forward scatter; FSC) og til intracellulær kompleksitet (side scatter; SSC). Se Ormerod 9 for detaljert informasjon om flytcytometri. Mannlige kimceller undergår spesifikke modifikasjoner i DNA-innhold, kromatinstruktur, størrelse og form gjennom forskjellige stadier av spermatogenese. Dermed kan forskjellige cellepopulasjoner identifiseres og skilles ved å kombinere lys-spredning og DNA-farging med fluorescerende fargestoffer 10 , 11 . Flere farvestoffer kan brukes til dette formålet (gjennomgått i Geisinger og Rodriguez-Casuriaga 3 ), som Hoechst-33342 (Hoechst), som ofte har vært brukt i flytcytometrianalyse av testikkelceller i det siste tiåret 1 , 2 , 4 , 10 , 12 . UpoN eksitering med UV-lys, utmerker Hoechst blå fluorescens proporsjonal med det cellulære DNA-innholdet mens langt rødt fluorescens reflekterer variabilitet i kromatinstruktur og komprimering 1 , 13 , 14 . Som et resultat oppviser mannlige bakterieceller i forskjellige stadier av differensiering spesifikke mønstre under FACS av Hoechst-farget enkeltcellesuspensjoner (Ho-FACS; 1 , 12 ). Interessant, på grunn av en mekanisme for fargestoffutstrømning som bare er aktiv i spermatogonale scenen, er intensiteten av Hoechst blå fluorescens ikke proporsjonal med kromatininnholdet i disse cellene, og de klynger som en sidepopulasjon under Ho-FACS 15 . I tillegg kan kombinasjon av Hoechst-farging med det ikke-permeant fargestoffidiodjodid (PI) tillate brukere å diskriminere levende (PI-negative) fra døde (PI positive) celler under FACS 1 &lt;Sup&gt;, 2 , 10 , 12 . Denne strategien har tidligere blitt brukt i strømningscytometriske analyser av testikulære bakterieceller og optimalisert omfattende i musen for å diskriminere opptil 9 kimcelletyper, inkludert celler i 4 forskjellige stadier av meiosis I 1 , 2 , 4 , 16 . For dette arbeidet har Hoechst-farging tre hovedfordeler. Først har Ho-FACS blitt anvendt med suksess på isolering av mannlige bakterieceller i musemodell 1 , 2 , 12 og andre gnagere som rotte og marsvin 17 , 18 , 19 . For det andre, Hoechst er et celle-permeant fargestoff og krever ikke membranpermeabilisering, så det preserVes celle integritet. Endelig er ingen RNase-behandling nødvendig siden Hoechst binder fortrinnsvis til poly (d [AT]) DNA-sekvenser 1 , 20 , hvilket betyr at RNA er bevart og i tillegg til DNA og proteiner kan brukes til videre nedstrøms molekylære studier av bakterier Celledifferensiering. Til tross for likheten i DNA-ploidi og / eller flekkbarhet observert i strømningscytometrianalyser av pattedyrsarter (vurdert i Geisinger og Rodriguez-Casuriaga 3 ), har det vært en stor variasjon i protokollene beskrevet for mannlig bakterie-isolasjon ved hjelp av flytcytometri. Ulike studier har benyttet spesifikke protokoller for vevsdissociasjon, og brukte forskjellige DNA-bindende fargestoffer (alene eller i kombinasjon) og FACS-gatingstrategier i forskjellige modellorganismer, hovedsakelig musen, rotte og marsvin. Derfor kan direkte sammenligning av data samlet for forskjellige arter påvirkes av unaccoUnted tekniske artefakter som skyldes variabilitet mellom metodene. Det er viktig at den slående bevaringen av kromatin-dynamikken gjennom pattedyrspermatogenese (2N-4N-2N-1N) antyder at en standardisert protokoll kan bli på tverrgående måte påført en rekke pattedyrsarter. Målet med denne studien var å utvikle en enkelt arbeidsflyt som gjelder for forskjellige pattedyrarter, ved å kombinere og tilpasse tidligere publiserte teknikker 2 , 20 . Standardisering av en metode for vevbehandling ble oppnådd ved å utføre mekanisk dissosiasjon for å overvinne behovet for artsspesifikke tilpasninger som kreves for enzymatisk fordøyelse 5 . Det er bemerkelsesverdig at mekanisk dissosiasjon av gnagertestikulært vev har blitt vist å utføre bedre enn enzymatisk vevsfordøyning 20 og Ho-FACS av enkeltcellesuspensjoner frembrakt ved begge metoderDet sammenlignbare resultatene 5 . Som prinsippprotokoll beskriver denne protokollen innstillingene som brukes til å isolere opptil 5 bakteriepopulasjoner: spermatogonia (SPG); Primær (SPC I) og sekundære spermatocytter (SPC II) og spermatider (SPD) - runde (rSPD) og forlengelse (eSPD). Viktig er at det er lett å implementere i laboratoriet, med hovedkravene som systemet for vevsdissociering og tilgang til en celle sorterer utstyrt med en UV laser. Denne arbeidsflyten ( Figur 1 ) er rask og enkel og muliggjør samtidig isolering av 4 bakteriepopulasjoner fra fersk testikkelvev på mindre enn 2 timer. Den reduserte behandlingstiden er avgjørende for å opprettholde cellulær integritet for videre nedstrøms prosedyrer. Dessuten viser den vellykkede ytelsen i 5 forskjellige arter at den kan brukes bredt i pattedyrkledden, noe som gjør den til den ideelle metoden for å isolere bakterieceller for sammenlignende studier av pattedyrs mannlig reproduktiv biolforstå informasjonsteknologi. Denne protokollen består av tre hoveddeler, bortsett fra forberedende trinn: (1) mekanisk dissosiasjon av testikkelvev og (2) farging av testikkelceller med Hoechst og PI, etterfulgt av (3) FACS-sortering av relevante spermatogene celler. Når de er oppsamlet, kan disse berikede populasjonene av forskjellige bakterier i pattedyrs testiklene brukes til et bredt spekter av anvendelser. Denne protokollen beskriver en &quot;one-size fits all&quot; dissociation metode for å rense mannlige bakterieceller fra mange forskjellige pattedyrsarter. Avhengig av typen studie som brukere ønsker å gjennomføre med de isolerte bakteriene, kan andre medier eller buffere brukes. De følgende protokollstrinn er for å generere enkelcelle-suspensjoner fra en hel murint testis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="731">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:239px;">4% paraformaldehyde</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">#15710</td>
			<td style="width:279px;">4% PFA, For fixing sorted cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Medimachine</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#340588;</td>
			<td>System for testis dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1X Dulbecco modified Eagle medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#31053</td>
			<td>DMEM, for testis dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Medicon</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#340591</td>
			<td>Disaggregation cartridge for testis dissociation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#10082139</td>
			<td>FBS, for FACS ceollction</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#H3570</td>
			<td>Hoecsht, For FACS staining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">40&#181;m cell strainer</td>
			<td>GREINER BIO-ONE</td>
			<td>#89508-342</td>
			<td>For testis dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100x 15mm petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#351029</td>
			<td>For testis dissection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5mL polypropylene round-bottom tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#352063</td>
			<td>For FACS collection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5mL Eppendorf tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#20170-650</td>
			<td>For FACS collection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3mL needless syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#309657</td>
			<td>For testis dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50mL conical tube</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>#C50R</td>
			<td>For testis dissociation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Propidium Iodide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#L7011</td>
			<td>PI, For FACS staining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MoFlo&#160;Legacy cell sorter</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>#ML99030</td>
			<td>For FACS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Summit Cell Sorting software</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>#ML99030</td>
			<td>For FACS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate buffered saline&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>#AM9625</td>
			<td>PBS, For microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscopic glass slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#12-544-4</td>
			<td>For microscopy&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>#12-548-87</td>
			<td>For microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Disposable transfer pipette (3mL)&#160;</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>#225</td>
			<td>For testis dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNase I&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>#10104159001</td>
			<td>For testis dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carbon steel surgical blade</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>#4-111</td>
			<td>For testis dissection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Countess automated cell counter&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#C10227&#160;</td>
			<td>For automatic cell counting&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypan blue solution (0.4%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#T8154</td>
			<td>For viability staining&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a standardized approach for multispecies purification of mammalian male germ cells by mechanical tissue dissociation and flow cytometry

Fluorescensaktivert cellesortering (FACS) har vært en av metodene som er valgfrie for å isolere berikte populasjoner av pattedyrs testikulære bakterieceller. For tiden tillater det diskriminering av opptil 9 murine kimcellepopulasjoner med høyt utbytte og renhet. Denne høyoppløsningen i diskriminering og rensing er mulig på grunn av unike endringer i kromatinstruktur og kvantitet gjennom spermatogenese. Disse mønstrene kan fanges ved hjelp av flytcytometri hos mannlige bakterieceller farget med fluorescerende DNA-bindende fargestoffer som Hoechst-33342 (Hoechst). Her er en detaljert beskrivelse av en nylig utviklet protokoll for å isolere pattedyrs testikulære bakterieceller. Kort fortalt genereres enkeltcellesuspensjoner fra testikkelvev ved mekanisk dissosiasjon, dobbeltfarget med Hoechst og propidiumjodid (PI) og behandlet ved hjelp av flytcytometri. En seriell gating strategi, inkludert valg av levende celler (PI negative) med forskjellig DNA innhold (Hoechst intensitet), jegS som brukes under FACS sortering for å diskriminere opptil 5 kimcelletyper. Disse inkluderer, med tilsvarende gjennomsnittlige renheter (bestemt ved mikroskopi-evaluering): spermatogoni (66%), primær (71%) og sekundær (85%) spermatocytter og spermatider (90%), videre separert til runde (93%) og forlengende (87%) delpopulasjoner. Gjennomføring av hele arbeidsflyten er enkel, muliggjør isolering av 4 celletyper samtidig med riktig FACS-maskin, og kan utføres på mindre enn 2 timer. Siden redusert behandlingstid er avgjørende for å bevare fysiologien til ex vivo- celler, er denne metoden ideell for nedstrøms høye gjennomstrømningsundersøkelser av mannlig bakteriebiologi. Videre eliminerer en standardisert protokoll for rensing av pattedyrkimceller med metodiske metoder metodiske kilder til variabler og tillater at et enkelt sett med reagenser brukes til forskjellige dyremodeller.

Enkeltcellesuspensjoner fra mekanisk dissosiasjon av testikkelvev Figur 2 sammenligner enkeltcellesuspensjoner oppnådd ved mekanisk dissosiasjon av mus-testikkelvev under forskjellige betingelser. Prøver oppnådd ved behandling av ferskt vev, ufarget ( Figur 2A ) eller farget med Hoechst ( Figur 2B ), viser tilstedeværelsen av enkeltcelle...

Watch this Scientific Journal Video about A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry at JoVE.com

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Dette arbeidet beskriver standardisering av en metode for å oppnå rensede bakteriepopulasjoner fra testikkelvev av forskjellige pattedyrsarter. Det er en enkel protokoll som kombinerer mekanisk testis dissosiasjon, flekker med Hoechst-33342 og propidiumjodid, og FACS sortering, med brede anvendelser i sammenlignende studier av mannlig reproduktiv biologi.

En standardisert tilnærming til multispecies Rensing av mammaliske mannlige kimceller ved hjelp av mekanisk vævsdissosiasjon og flytcytometri

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

Step-spesifikk Sortering av Musespermatider ved flowcytometrisystemer

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Identifikasjon av erytromyeloidprogenitorer og deres avkom i musembryoen ved flowcytometri

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

Isolere og analysere cellene i bukspyttkjertelen Mesenchyme ved flowcytometri

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horisontal helmontering: En romanbehandlings- og bildeprotokoll for tykke, tredimensjonale vev Tverrsnitt av huden

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome

Bruk av blodkreft stamcelletransplantasjon å vurdere opprinnelsen til AML

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood ...

Real-time Live-cell Flow Cytometry to Investigate Calcium Influx, Pore Formation, and Phagocytosis by P2X7 Receptors in Adult Neural Progenitor Cells

Sanntid Live-celle flowcytometri å undersøke kalsium tilstrømningen Pore dannelse og fagocytose av P2X7 reseptorer i voksen nevrale stamceller

Live-cell flow cytometry is increasingly used among cell biologists to quantify biological processes in a living cell culture. This protocol describes a ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro generasjon av Somite derivater fra menneske indusert stamceller Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging

Kartlegging av emergent romlig organisering av pattedyrceller bruker Micropatterns og kvantitativ Imaging

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro ...

RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse

RiboTag Immunnedbør i bakteriecellene i den mannlige musen

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, ...

Detection and Quantitation of Label-Retaining Cells in Mouse Incisors using a 3D Reconstruction Approach after Tissue Clearing

Deteksjon og kvantifisering av etikettbeholdende celler i musesnitt ved hjelp av en 3D-rekonstruksjonstilnærming etter vevsrydding

The murine incisor is an organ that grows continuously throughout the lifespan of the mouse. The epithelial and mesenchymal stem cells residing in the ...