Name: a standardized approach for multispecies purification of mammalian male germ cells by mechanical tissue dissociation and flow cytometry
Uploaded: 2017-07-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry at JoVE.com

Os autores agradecem o Hillside Animal Hospital (St. Louis, MO) para testículos para cães; Jason Arand e o laboratório do Dr. Ted Cicero na Universidade de Washington em St. Louis (WashU) para fornecer testículos de ratos e Brianne Tabers para ajudar com a coleção; Jared Hartsock e Dr. Salt&#39;s Lab em WashU para os testículos de cobaia; E o Dr. Michael Talcott na Divisão de Medicina Comparada da WashU para o testículo em porco em miniatura. Os autores também reconhecem o Alvin J. Siteman Cancer Center na Escola de Medicina da Universidade de Washington e Barnes-Jewish Hospital em St. Louis, MO, pelo uso do Siteman Flow Cytometry Core, que forneceu o serviço de classificação de células operado pelo pessoal. O Siteman Cancer Center é apoiado em parte pelo NCI Cancer Center Support Grant # P30 CA91842. Esta pesquisa foi financiada por uma bolsa de doutorado da FCT [SFRH / BD / 51695/2011 a ACL], doações dos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos [R01HD078641 e R01MH101810 a DFC] e um contrato de pesquisa FCT [IF / 01262/2014 para AML].

Todos os procedimentos descritos abaixo obedeceram aos regulamentos do Comitê de Estudos Animais da Universidade de Washington em St. Louis. 1. Preparações para o protocolo de dissociação mecânica <ol><li> Pré-molhar um cartucho de desagregação de tecido descartable de 50 μm para a dissociação de um testículo murino inteiro. NOTA: Este cartucho de desagregação de tecido descartable contém micro-lâminas projetadas para cortar tecidos e uma malha de a...

<ol>
	<li>Bastos, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis.">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).</li><li>Gaysinskaya, V., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+murine+spermatocytes.">Flow cytometry of murine spermatocytes.</a> Curr Protoc Cytom. 72, (2015).</li><li>Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+for+gene+expression+studies+in+Mammalian+spermatogenesis.">Flow cytometry for gene expression studies in Mammalian spermatogenesis.</a> Cytogenet Genome Res. 128 (1-3), 46-56 (2010).</li><li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells.">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li><li>Lima, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispecies+Purification+of+Testicular+Germ+Cells.">Multispecies Purification of Testicular Germ Cells.</a> Biol Reprod. , (2016).</li><li>Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+spermatogenic+cell+types+using+STA-PUT+velocity+sedimentation.">Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation.</a> J Vis Exp. (80), (2013).</li><li>Chang, Y. F., Lee-Chang, J. S., Panneerdoss, S., MacLean, J. A., Rao, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Sertoli,+Leydig,+and+spermatogenic+cells+from+the+mouse+testis.">Isolation of Sertoli, Leydig, and spermatogenic cells from the mouse testis.</a> Biotechniques. 51 (5), (2011).</li><li>Margolin, G., Khil, P. P., Kim, J., Bellani, M. A., Camerini-Otero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+transcriptome+analysis+of+mouse+spermatogenesis.">Integrated transcriptome analysis of mouse spermatogenesis.</a> BMC Genomics. 15, 39 (2014).</li><li>Grogan, W. M., Farnham, W. F., Sabau, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+analysis+and+sorting+of+viable+mouse+testis+cells.">DNA analysis and sorting of viable mouse testis cells.</a> J Histochem Cytochem. 29 (6), 738-746 (1981).</li><li>Mays-Hoopes, L. L., Bolen, J., Riggs, A. D., Singer-Sam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+spermatogonia,+spermatocytes,+and+round+spermatids+for+analysis+of+gene+expression+using+fluorescence-activated+cell+sorting.">Preparation of spermatogonia, spermatocytes, and round spermatids for analysis of gene expression using fluorescence-activated cell sorting.</a> Biol Reprod. 53 (5), 1003-1011 (1995).</li><li>Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+flow+cytometry+isolation+of+murine+spermatocytes.">Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes.</a> Cytometry A. 85 (6), 556-565 (2014).</li><li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo.">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li><li>Watson, J. V., Nakeff, A., Chambers, S. H., Smith, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+fluorescence+emission+spectrum+analysis+of+Hoechst-33342-stained+DNA+in+chicken+thymocytes.">Flow cytometric fluorescence emission spectrum analysis of Hoechst-33342-stained DNA in chicken thymocytes.</a> Cytometry. 6 (4), 310-315 (1985).</li><li>Lassalle, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Side+Population'+cells+in+adult+mouse+testis+express+Bcrp1+gene+and+are+enriched+in+spermatogonia+and+germinal+stem+cells.">'Side Population' cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells.</a> Development. 131 (2), 479-487 (2004).</li><li>Omran, H. M., Bakhiet, M., Dashti, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+integrity+is+a+critical+molecular+indicator+for+the+assessment+of+male+infertility.">DNA integrity is a critical molecular indicator for the assessment of male infertility.</a> Mol Med Rep. 7 (5), 1631-1635 (2013).</li><li>Rodriguez-Casuriaga, R., Folle, G. A., Santinaque, F., Lopez-Carro, B., Geisinger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+technique+for+the+preparation+of+testicular+cell+suspensions.">Simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li><li>Rodriguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santinaque, F. F., Lopez-Carro, B., Folle, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-purity+flow+sorting+of+early+meiocytes+based+on+DNA+analysis+of+guinea+pig+spermatogenic+cells.">High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells.</a> Cytometry A. 79 (8), 625-634 (2011).</li><li>Rodriguez-Casuriaga, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+preparation+of+rodent+testicular+cell+suspensions+and+spermatogenic+stages+purification+by+flow+cytometry+using+a+novel+blue-laser-excitable+vital+dye.">Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye.</a> MethodsX. 1, 239-243 (2014).</li><li>Rodriguez-Casuriaga, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-fast+and+optimized+method+for+the+preparation+of+rodent+testicular+cells+for+flow+cytometric+analysis.">Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis.</a> Biol Proced Online. 11, 184-195 (2009).</li><li>Hess, R. A., Renato de Franca, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis+and+cycle+of+the+seminiferous+epithelium.">Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium.</a> Adv Exp Med Biol. 636, 1-15 (2008).</li><li>Zhao, H., Traganos, F., Dobrucki, J., Wlodkowic, D., Darzynkiewicz, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+DNA+damage+response+by+the+supravital+probes+of+nucleic+acids.">Induction of DNA damage response by the supravital probes of nucleic acids.</a> Cytometry A. 75 (6), 510-519 (2009).</li><li>Gassei, K., Ehmcke, J., Dhir, R., Schlatt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+activated+cell+sorting+allows+isolation+of+spermatogonia+from+adult+primate+testes+and+reveals+distinct+GFRa1-positive+subpopulations+in+men.">Magnetic activated cell sorting allows isolation of spermatogonia from adult primate testes and reveals distinct GFRa1-positive subpopulations in men.</a> J Med Primatol. 39 (2), 83-91 (2010).</li><li>Hayama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+selection+methods+for+rat+and+mouse+round+spermatids+without+DNA+staining+by+flow+cytometric+cell+sorting.">Practical selection methods for rat and mouse round spermatids without DNA staining by flow cytometric cell sorting.</a> Mol Reprod Dev. 83 (6), 488-496 (2016).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+selection+of+valuable+mutant+mouse+round+spermatids+and+strain+rescue+via+round+spermatid+injection.">FACS selection of valuable mutant mouse round spermatids and strain rescue via round spermatid injection.</a> Zygote. 23 (3), 336-341 (2015).</li></ol>

Considerando a dinâmica de cromatina altamente conservada durante a espermatogênese em mamíferos, o objetivo deste trabalho foi desenvolver um protocolo para isolar células germinais masculinas em diferentes estádios de diferenciação de diferentes tecidos testiculares de mamíferos ( Figura 1 ). Um dos principais obstáculos na aplicação de um único fluxo de trabalho a diferentes modelos animais é a necessidade de ajustes específicos das espécies, especialmente no que diz respe...

Dada a falta de um sistema in vitro representativo da progressão da espermatogênese e a presença de grande heterogeneidade celular no testículo, estudos de biologia de células germinais masculinas requerem técnicas robustas para isolar populações enriquecidas de tipos específicos de células. A classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) tem sido amplamente utilizada para este propósito 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , pois fornece alto rendimento e pureza e supera outros métodos de isolamento no número de tipos de células germinativas que ele pode identificar e Selecione 6 , 7 , 8 . O princípio da análise de citometria de fluxo baseia-se na detecção de padrões de luz diferencial após a excitação do raio laser de células isoladas. À medida que uma célula passa pelo laser reflete / dispersa a luzEm todos os ângulos, proporcional ao tamanho da célula (dispersão para frente, FSC) e à complexidade intracelular (dispersão lateral, SSC). Veja Ormerod 9 para obter informações detalhadas sobre citometria de fluxo. As células germinativas masculinas sofrem modificações específicas no conteúdo de DNA, estrutura da cromatina, tamanho e forma em diferentes estágios da espermatogênese. Assim, populações de células distintas podem ser identificadas e separadas pela combinação de dispersão de luz e coloração de DNA com corantes fluorescentes 10 , 11 . Vários corantes podem ser utilizados para este propósito (revisado em Geisinger e Rodriguez-Casuriaga 3 ), como Hoechst-33342 (Hoechst), que tem sido freqüentemente usado na análise de citometria de fluxo de células testiculares na última década 1 , 2 , 4 , 10 , 12 . UpoN excitação com luz UV, Hoechst emite fluorescência azul proporcional ao conteúdo de DNA celular, enquanto a fluorescência vermelha distante reflete variabilidade na estrutura da cromatina e compactação 1 , 13 , 14 . Como resultado, as células germinativas masculinas em diferentes estádios de diferenciação exibem padrões específicos durante FACS de suspensões de células individuais manchadas com Hoechst (Ho-FACS; 1 , 12 ). Curiosamente, devido a um mecanismo de efluxo de corante que é apenas ativo durante o estágio espermatogônico, a intensidade da fluorescência Hoechst azul não é proporcional ao conteúdo de cromatina nessas células e se agrupa como uma população lateral durante Ho-FACS 15 . Além disso, combinar a coloração de Hoechst com o iodeto de propídio de corante não-permeante (PI) permite aos usuários discriminar em tempo real (PI negativo) de células mortas (PI positivas) durante FACS 1 &lt;Sup&gt;, 2 , 10 , 12 . Esta estratégia foi anteriormente utilizada em análises de citometria de fluxo de células germinativas testiculares e otimizada amplamente no mouse para discriminar até 9 tipos de células germinativas, incluindo células em 4 estádios diferentes da meiose I 1 , 2 , 4 , 16 . Para o propósito deste trabalho, a coloração Hoechst tem três vantagens principais. Primeiro, Ho-FACS foi aplicado com sucesso ao isolamento de células germinais masculinas no modelo de mouse 1 , 2 , 12 e outros roedores, como ratos e cobaias 17 , 18 , 19 . Segundo, o Hoechst é um tinte permeável às células e não requer a permeabilização da membrana, de modo que ele preserIntegridade das células. Finalmente, nenhum tratamento com RNase é necessário, uma vez que Hoechst se liga preferencialmente a sequências de DNA de poli (d [AT]) 1 , 20 , o que significa que o ARN é preservado e, além de DNA e proteínas, pode ser usado para estudos moleculares a jusante do germe diferenciação celular. Apesar da semelhança na ploidia de DNA e / ou mancha observada em análises de citometria de fluxo de espécies de mamíferos (revisadas em Geisinger e Rodriguez-Casuriaga 3 ), houve uma grande variabilidade nos protocolos descritos para isolamento de células germinativas masculinas por citometria de fluxo. Diferentes estudos empregaram protocolos específicos para a dissociação tecidual e utilizaram diferentes tipos de corantes de ligação ao DNA (isolados ou em combinação) e FACS em diferentes organismos modelo, principalmente o rato, o rato e a cobaia. Assim, a comparação direta de dados coletados para diferentes espécies pode ser afetada pelo tabacoArtefatos técnicos não produzidos resultantes da variabilidade entre metodologias. Importante, a conservação marcante da dinâmica da cromatina em toda a espermatogênese de mamíferos (2N-4N-2N-1N) sugere que um protocolo padronizado pode ser aplicado transversalmente a uma variedade de espécies de mamíferos. O objetivo deste estudo foi desenvolver um único fluxo de trabalho aplicável a diferentes espécies de mamíferos, combinando e adaptando as técnicas 2 , 20 anteriormente publicadas. A padronização de um método para o processamento de tecidos foi conseguida através da dissociação mecânica para superar a necessidade de ajustes específicos da espécie necessários para a digestão enzimática 5 . Vale ressaltar que a dissociação mecânica do tecido testicular de roedores mostrou-se melhor que a digestão de tecido enzimático 20 e Ho-FACS de suspensões de células individuais geradas por ambos os métodos.Resultados comparáveis 5 . Como prova de princípio, este protocolo descreve as configurações usadas para isolar até 5 populações de células germinativas: espermatogonia (SPG); Primários (SPC I) e espermatócitos secundários (SPC II) e espermátides (SPD) - redondo (rSPD) e alongamento (eSPD). Importante, é fácil de implementar no laboratório, sendo os principais requisitos o sistema de dissociação de tecidos e acesso a um classificador de células equipado com um laser UV. Este fluxo de trabalho ( Figura 1 ) é rápido e direto e permite o isolamento simultâneo de 4 populações de células germinativas a partir de tecido testicular fresco em menos de 2 h. O tempo de processamento reduzido é crucial para manter a integridade celular para outros procedimentos a jusante. Além disso, seu desempenho bem sucedido em 5 espécies diferentes sugere que poderia ser amplamente aplicado dentro do clade de mamíferos, tornando-o o método ideal para isolar células germinativas para estudos comparativos de mamíferos reprodutores masculinos biolOgy. Este protocolo é composto por três seções principais, além das etapas preparatórias: (1) a dissociação mecânica do tecido testicular e (2) a coloração das células testiculares com Hoechst e PI, seguido de (3) classificação FACS de células espermatogênicas relevantes. Uma vez recolhidos, estas populações enriquecidas de diferentes células germinativas testiculares de mamíferos podem ser usadas para uma ampla gama de aplicações. Este protocolo descreve um método de dissociação de &quot;tamanho único&quot; para purificar células germinais masculinas de diferentes espécies de mamíferos diferentes. Dependendo do tipo de estudo que os usuários desejam realizar com as células germinativas isoladas, outras mídias ou tampões podem ser usados. As seguintes etapas de protocolo são para gerar suspensões de células individuais de um testículo murino inteiro.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="731">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:239px;">4% paraformaldehyde</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">#15710</td>
			<td style="width:279px;">4% PFA, For fixing sorted cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Medimachine</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#340588;</td>
			<td>System for testis dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1X Dulbecco modified Eagle medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#31053</td>
			<td>DMEM, for testis dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Medicon</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#340591</td>
			<td>Disaggregation cartridge for testis dissociation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#10082139</td>
			<td>FBS, for FACS ceollction</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#H3570</td>
			<td>Hoecsht, For FACS staining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">40&#181;m cell strainer</td>
			<td>GREINER BIO-ONE</td>
			<td>#89508-342</td>
			<td>For testis dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100x 15mm petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#351029</td>
			<td>For testis dissection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5mL polypropylene round-bottom tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#352063</td>
			<td>For FACS collection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5mL Eppendorf tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#20170-650</td>
			<td>For FACS collection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3mL needless syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#309657</td>
			<td>For testis dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50mL conical tube</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>#C50R</td>
			<td>For testis dissociation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Propidium Iodide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#L7011</td>
			<td>PI, For FACS staining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MoFlo&#160;Legacy cell sorter</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>#ML99030</td>
			<td>For FACS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Summit Cell Sorting software</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>#ML99030</td>
			<td>For FACS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate buffered saline&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>#AM9625</td>
			<td>PBS, For microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscopic glass slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#12-544-4</td>
			<td>For microscopy&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>#12-548-87</td>
			<td>For microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Disposable transfer pipette (3mL)&#160;</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>#225</td>
			<td>For testis dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNase I&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>#10104159001</td>
			<td>For testis dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carbon steel surgical blade</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>#4-111</td>
			<td>For testis dissection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Countess automated cell counter&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#C10227&#160;</td>
			<td>For automatic cell counting&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypan blue solution (0.4%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#T8154</td>
			<td>For viability staining&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a standardized approach for multispecies purification of mammalian male germ cells by mechanical tissue dissociation and flow cytometry

A classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) foi um dos métodos de escolha para isolar populações enriquecidas de células germinativas testiculares de mamíferos. Atualmente, permite a discriminação de até 9 populações de células germinativas murinas com alto rendimento e pureza. Esta alta resolução em discriminação e purificação é possível devido a mudanças únicas na estrutura e na quantidade de cromatina durante a espermatogênese. Esses padrões podem ser capturados por citometria de fluxo de células germinativas masculinas coradas com corantes fluorescentes de ligação ao DNA tais como Hoechst-33342 (Hoechst). Aqui está uma descrição detalhada de um protocolo recentemente desenvolvido para isolar células germinativas testiculares de mamíferos. Resumidamente, as suspensões de células individuais são geradas a partir do tecido testicular por dissociação mecânica, coradas duas vezes com Hoechst e iodeto de propídio (PI) e processadas por citometria de fluxo. Uma estratégia de bloqueio em série, incluindo a seleção de células vivas (PI negativo) com conteúdo de DNA diferente (intensidade Hoechst), iS usados ​​durante a classificação FACS para discriminar até 5 tipos de células germinativas. Estes incluem, com purezas médias correspondentes (determinadas por avaliação microscópica): espermatozóides (66%), espermatites primários (71%) e secundários (85%) e espermátides (90%), mais separados em rodada (93%) e alongamento (87%) subpopulações. A execução de todo o fluxo de trabalho é direta, permite o isolamento de 4 tipos de células simultaneamente com a máquina FACS apropriada e pode ser realizada em menos de 2 h. Como o tempo de processamento reduzido é crucial para preservar a fisiologia das células ex vivo , esse método é ideal para estudos de alto débito a jusante da biologia de células germinativas masculinas. Além disso, um protocolo padronizado para a purificação multiespecífica de células germinais de mamíferos elimina fontes metodológicas de variáveis ​​e permite que um único conjunto de reagentes seja usado para diferentes modelos de animais.

Suspensões celulares simples da dissociação mecânica do tecido testicular A Figura 2 compara suspensões celulares únicas obtidas por dissociação mecânica do tecido testicular do rato em diferentes condições. As amostras obtidas por processamento de tecido fresco, não coradas ( Figura 2A ) ou coradas com Hoechst ( Figura 2B ), mos...

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A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Este trabalho descreve a padronização de um método para obter populações de células germinativas purificadas a partir de tecido testicular de diferentes espécies de mamíferos. É um protocolo direto que combina dissociação mecânica com testículos, manchas com Hoechst-33342 e iodeto de propídio, e classificação FACS, com amplas aplicações em estudos comparativos de biologia reprodutiva masculina.

Uma abordagem padronizada para a purificação multiespecífica de células germinais masculinas de mamíferos por dissociação mecânica do tecido e citometria de fluxo

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

Passo-específico Seleção de mouse Espermátides por citometria de fluxo

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Biologia do Desenvolvimento

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Identificação de progenitores eritromoelóides e sua progênie no embrião de mouse por citometria de fluxo

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

Isolando e analisando células do pâncreas Mesênquima por citometria de fluxo

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horizontal Whole Mount: um protocolo de processamento e imagem de Novel para secções transversais grossas de tecidos tridimensionais

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome

Uso de transplante de células-tronco hematopoiéticas para avaliar a origem da síndrome mielodisplásica

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood ...

Real-time Live-cell Flow Cytometry to Investigate Calcium Influx, Pore Formation, and Phagocytosis by P2X7 Receptors in Adult Neural Progenitor Cells

Citometria de fluxo de viver-pilha em tempo real para investigar o influxo de cálcio, formação de poros e fagocitose pelos receptores P2X7 em células progenitoras neurais adulto

Live-cell flow cytometry is increasingly used among cell biologists to quantify biological processes in a living cell culture. This protocol describes a ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Na geração de Vitro do Somite derivados de humanos induzida por células tronco pluripotentes

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging

Mapeando a organização espacial emergente de células de mamíferos usando Micropatterns e imagens quantitativas

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro ...

RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse

Imunoprecipitação ribotag nas células germinativas do rato macho

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, ...

Detection and Quantitation of Label-Retaining Cells in Mouse Incisors using a 3D Reconstruction Approach after Tissue Clearing

Detecção e Quantificação de Células Retentoras de Marcação em Incisivos de Camundongos utilizando uma Abordagem de Reconstrução 3D após Limpeza de Tecidos

The murine incisor is an organ that grows continuously throughout the lifespan of the mouse. The epithelial and mesenchymal stem cells residing in the ...