Name: a standardized approach for multispecies purification of mammalian male germ cells by mechanical tissue dissociation and flow cytometry
Uploaded: 2017-07-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry at JoVE.com

Авторы благодарят больницу Hillside Animal Hospital (Сент-Луис, Миссури) для собак; Джейсон Аранд и лаборатория доктора Теда Цицерона в Вашингтонском университете в Сент-Луисе (WashU) за предоставление крысиных яичек и Брайан Таберс для оказания помощи в сборе; Джаред Харток и лаборатория доктора Солт в WashU для яиц морских свинок; И д-р Майкл Тэлкотт в Отделе сравнительной медицины в WashU для миниатюрного свиного яичка. Авторы также признают Раковый центр Элвина Дж. Ситмана в Школе медицины Вашингтонского университета и Барнс-еврейскую больницу в Сент-Луисе, штат Миссури, за использование ячеистого цитометрического ядра Siteman, который предоставил персональную службу сортировки клеток. Рак-центр Siteman частично поддерживается грантом поддержки NCK Cancer Center № P30 CA91842. Это исследование было профинансировано докторантурой FCT [SFRH / BD / 51695/2011 до ACL], грантами от Национального института здоровья США [R01HD078641 и R01MH101810 до DFC] и исследовательский контракт FCT [IF / 01262/2014 на AML].

Все описанные ниже процедуры соответствовали положениям Комитета по изучению животных в Вашингтонском университете в Сент-Луисе. 1. Подготовка к протоколу механической диссоциации <ol><li> Предварительно намочите картридж для дезагрегации одноразовой ткани размер?...

<ol>
	<li>Bastos, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis.">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).</li><li>Gaysinskaya, V., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+murine+spermatocytes.">Flow cytometry of murine spermatocytes.</a> Curr Protoc Cytom. 72, (2015).</li><li>Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+for+gene+expression+studies+in+Mammalian+spermatogenesis.">Flow cytometry for gene expression studies in Mammalian spermatogenesis.</a> Cytogenet Genome Res. 128 (1-3), 46-56 (2010).</li><li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells.">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li><li>Lima, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispecies+Purification+of+Testicular+Germ+Cells.">Multispecies Purification of Testicular Germ Cells.</a> Biol Reprod. , (2016).</li><li>Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+spermatogenic+cell+types+using+STA-PUT+velocity+sedimentation.">Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation.</a> J Vis Exp. (80), (2013).</li><li>Chang, Y. F., Lee-Chang, J. S., Panneerdoss, S., MacLean, J. A., Rao, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Sertoli,+Leydig,+and+spermatogenic+cells+from+the+mouse+testis.">Isolation of Sertoli, Leydig, and spermatogenic cells from the mouse testis.</a> Biotechniques. 51 (5), (2011).</li><li>Margolin, G., Khil, P. P., Kim, J., Bellani, M. A., Camerini-Otero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+transcriptome+analysis+of+mouse+spermatogenesis.">Integrated transcriptome analysis of mouse spermatogenesis.</a> BMC Genomics. 15, 39 (2014).</li><li>Grogan, W. M., Farnham, W. F., Sabau, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+analysis+and+sorting+of+viable+mouse+testis+cells.">DNA analysis and sorting of viable mouse testis cells.</a> J Histochem Cytochem. 29 (6), 738-746 (1981).</li><li>Mays-Hoopes, L. L., Bolen, J., Riggs, A. D., Singer-Sam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+spermatogonia,+spermatocytes,+and+round+spermatids+for+analysis+of+gene+expression+using+fluorescence-activated+cell+sorting.">Preparation of spermatogonia, spermatocytes, and round spermatids for analysis of gene expression using fluorescence-activated cell sorting.</a> Biol Reprod. 53 (5), 1003-1011 (1995).</li><li>Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+flow+cytometry+isolation+of+murine+spermatocytes.">Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes.</a> Cytometry A. 85 (6), 556-565 (2014).</li><li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo.">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li><li>Watson, J. V., Nakeff, A., Chambers, S. H., Smith, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+fluorescence+emission+spectrum+analysis+of+Hoechst-33342-stained+DNA+in+chicken+thymocytes.">Flow cytometric fluorescence emission spectrum analysis of Hoechst-33342-stained DNA in chicken thymocytes.</a> Cytometry. 6 (4), 310-315 (1985).</li><li>Lassalle, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Side+Population'+cells+in+adult+mouse+testis+express+Bcrp1+gene+and+are+enriched+in+spermatogonia+and+germinal+stem+cells.">'Side Population' cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells.</a> Development. 131 (2), 479-487 (2004).</li><li>Omran, H. M., Bakhiet, M., Dashti, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+integrity+is+a+critical+molecular+indicator+for+the+assessment+of+male+infertility.">DNA integrity is a critical molecular indicator for the assessment of male infertility.</a> Mol Med Rep. 7 (5), 1631-1635 (2013).</li><li>Rodriguez-Casuriaga, R., Folle, G. A., Santinaque, F., Lopez-Carro, B., Geisinger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+technique+for+the+preparation+of+testicular+cell+suspensions.">Simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li><li>Rodriguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santinaque, F. F., Lopez-Carro, B., Folle, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-purity+flow+sorting+of+early+meiocytes+based+on+DNA+analysis+of+guinea+pig+spermatogenic+cells.">High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells.</a> Cytometry A. 79 (8), 625-634 (2011).</li><li>Rodriguez-Casuriaga, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+preparation+of+rodent+testicular+cell+suspensions+and+spermatogenic+stages+purification+by+flow+cytometry+using+a+novel+blue-laser-excitable+vital+dye.">Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye.</a> MethodsX. 1, 239-243 (2014).</li><li>Rodriguez-Casuriaga, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-fast+and+optimized+method+for+the+preparation+of+rodent+testicular+cells+for+flow+cytometric+analysis.">Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis.</a> Biol Proced Online. 11, 184-195 (2009).</li><li>Hess, R. A., Renato de Franca, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis+and+cycle+of+the+seminiferous+epithelium.">Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium.</a> Adv Exp Med Biol. 636, 1-15 (2008).</li><li>Zhao, H., Traganos, F., Dobrucki, J., Wlodkowic, D., Darzynkiewicz, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+DNA+damage+response+by+the+supravital+probes+of+nucleic+acids.">Induction of DNA damage response by the supravital probes of nucleic acids.</a> Cytometry A. 75 (6), 510-519 (2009).</li><li>Gassei, K., Ehmcke, J., Dhir, R., Schlatt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+activated+cell+sorting+allows+isolation+of+spermatogonia+from+adult+primate+testes+and+reveals+distinct+GFRa1-positive+subpopulations+in+men.">Magnetic activated cell sorting allows isolation of spermatogonia from adult primate testes and reveals distinct GFRa1-positive subpopulations in men.</a> J Med Primatol. 39 (2), 83-91 (2010).</li><li>Hayama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+selection+methods+for+rat+and+mouse+round+spermatids+without+DNA+staining+by+flow+cytometric+cell+sorting.">Practical selection methods for rat and mouse round spermatids without DNA staining by flow cytometric cell sorting.</a> Mol Reprod Dev. 83 (6), 488-496 (2016).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+selection+of+valuable+mutant+mouse+round+spermatids+and+strain+rescue+via+round+spermatid+injection.">FACS selection of valuable mutant mouse round spermatids and strain rescue via round spermatid injection.</a> Zygote. 23 (3), 336-341 (2015).</li></ol>

Учитывая высокую консервативную динамику хроматина во время сперматогенеза у млекопитающих, целью этой работы было разработать протокол для выделения мужских половых клеток на разных стадиях дифференциации от различных тканей яичек млекопитающих ( рис. 1 ). Одним из о?...

Учитывая отсутствие системы in vitro , представляющей прогрессию сперматогенеза, а также наличие большой клеточной гетерогенности в яичках, исследования биологии клеток мужских половых клеток требуют надежных методов выделения обогащенных популяций конкретных типов клеток. Для этой цели широко используется флуоресцентная сортировка клеток (FACS) 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , так как она обеспечивает высокий выход и чистоту и превосходит другие методы изоляции в количестве типов зародышевых клеток, которые она может идентифицировать и Выберите 6 , 7 , 8 . Принцип анализа проточной цитометрии основан на обнаружении дифференциальных световых образцов после лазерного возбуждения одиночных клеток. Когда камера проходит через лазер, она отражает / рассеивает светПри всех углах, пропорциональных размеру ячейки (прямое рассеяние, FSC) и внутриклеточной сложности (боковой разброс, SSC). См. Ormerod 9 для получения подробной информации о проточной цитометрии. Мужские зародышевые клетки подвергаются специфическим модификациям в отношении содержания ДНК, структуры хроматина, размера и формы на разных стадиях сперматогенеза. Таким образом, отдельные клеточные популяции могут быть идентифицированы и разделены путем объединения рассеяния света и окрашивания ДНК флуоресцентными красителями 10 , 11 . Для этой цели можно использовать несколько красителей (обзор в Geisinger и Rodriguez-Casuriaga 3 ), такой как Hoechst-33342 (Hoechst), который часто использовался в проточном цитометрическом анализе клеток тестикула в течение последнего десятилетия 1 , 2 , 4 , 10 , 12 . UpoN возбуждение ультрафиолетовым излучением, Hoechst излучает синюю флуоресценцию, пропорциональную содержанию клеточной ДНК, тогда как красная флуоресценция отражает изменчивость структуры хроматина и уплотнения 1 , 13 , 14 . В результате мужские зародышевые клетки на разных стадиях дифференцировки проявляют специфические закономерности во время FACS окрашенных Hoechst одноклеточных суспензий (Ho-FACS, 1 , 12 ). Интересно, что из-за механизма оттока красителя, который активен только на стадии сперматогона, интенсивность синей флуоресценции Хехста не пропорциональна содержанию хроматина в этих клетках, и они группируются как побочная популяция во время Ho-FACS 15 . Кроме того, объединение Hoechst-окрашивания с иодидом пропидиума без проницаемости (PI) позволяет пользователям различать живые (отрицательные значения PI) из мертвых (PI-положительных) клеток во время FACS 1 &lt;Sup&gt;, 2 , 10 , 12 . Эта стратегия ранее использовалась в проточных цитометрических анализах яичек зародышевых клеток и интенсивно оптимизировалась у мышей, чтобы различать до 9 типов зародышевых клеток, включая клетки на 4 разных стадиях мейоза I 1 , 2 , 4 , 16 . Для целей этой работы окрашивание Hoechst имеет три основных преимущества. Во-первых, Ho-FACS успешно применяется для выделения мужских зародышевых клеток в мышиной модели 1 , 2 , 12 и других грызунов, таких как крыса и морская свинка 17 , 18 , 19 . Во-вторых, Hoechst является клеточно-проникающим красителем и не требует мембранной проницаемости, поэтому онVes. Наконец, никакой обработки РНКазой не требуется, так как Hoechst связывается преимущественно с поли (d [AT]) последовательностями ДНК 1 , 20 , что означает, что РНК сохраняется и, помимо ДНК и белков, может быть использована для последующих молекулярных исследований зародышей Клеточной дифференцировки. Несмотря на сходство в плоидности и / или бледности ДНК, наблюдаемую при анализе проточной цитометрии видов млекопитающих (рассмотренная в Geisinger и Rodriguez-Casuriaga 3 ), в протоколах, описанных для выделения мужских зародышевых клеток методом проточной цитометрии, была значительная изменчивость. В различных исследованиях использовались конкретные протоколы для диссоциации тканей и использовались различные ДНК-связывающие красители (отдельно или в комбинации) и стратегии стробирования FACS у разных модельных организмов, главным образом мыши, крысы и морской свинки. Следовательно, прямое сравнение данных, собираемых для разных видов, может быть затронутоНеиспользованные технические артефакты, возникающие в результате изменчивости между методологиями. Важно отметить, что поразительное сохранение динамики хроматина во всем сперматогенезе млекопитающих (2N-4N-2N-1N) предполагает, что стандартизованный протокол может быть поперечно применен к различным видам млекопитающих. Целью этого исследования было разработать единый рабочий процесс, применимый к различным видам млекопитающих, путем комбинирования и адаптации ранее опубликованных методов 2 , 20 . Стандартизация метода для обработки тканей была достигнута путем проведения механической диссоциации для преодоления потребности в видоспецифических корректировках, необходимых для ферментативного расщепления 5 . Следует отметить, что механическая диссоциация ткани тестикулярного грызуна показала, что она лучше, чем ферментативное переваривание ткани 20, и Ho-FACS одноцепочечных суспензий, генерируемых обоими методами, проявляютЭто сопоставимые результаты 5 . В качестве доказательства принципа этот протокол описывает параметры, используемые для выделения до 5 популяций зародышевых клеток: сперматогония (SPG); Первичный (SPC I) и вторичные сперматоциты (SPC II) и сперматиды (SPD) - круглые (rSPD) и удлиненные (eSPD). Важно отметить, что это легко осуществить в лаборатории, причем основными требованиями являются система диссоциации тканей и доступ к сортировщику клеток, оснащенному УФ-лазером. Этот рабочий процесс ( рис. 1 ) является быстрым и прямым и позволяет одновременное выделение 4 популяций зародышевых клеток из свежей ткани тестикула менее чем за 2 часа. Сокращение времени обработки имеет решающее значение для поддержания целостности сотовой связи для последующих последующих процедур. Более того, его успешная работа у 5 разных видов предполагает, что он может широко применяться в клане млекопитающих, что делает его идеальным методом для выделения зародышевых клеток для сравнительных исследований репродуктивного биола млекопитающихгия. Этот протокол состоит из трех основных разделов, за исключением подготовительных этапов: (1) механическая диссоциация ткани яичка и (2) окрашивание тестикулярных клеток с помощью Hoechst и PI, а затем (3) сортировка FACS соответствующих сперматогенных клеток. После сбора этих обогащенных популяций различных клеток яичек млекопитающих можно использовать для широкого спектра применений. В этом протоколе описывается метод «единственного размера для всех» диссоциации для очистки мужских половых клеток от многих видов млекопитающих. В зависимости от типа исследования, которое пользователи хотят проводить с изолированными зародышевыми клетками, могут использоваться другие носители или буферы. Следующие этапы протокола предназначены для получения одноцепочечных суспензий из одного целого мышиного яичка.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="731">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:239px;">4% paraformaldehyde</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">#15710</td>
			<td style="width:279px;">4% PFA, For fixing sorted cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Medimachine</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#340588;</td>
			<td>System for testis dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1X Dulbecco modified Eagle medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#31053</td>
			<td>DMEM, for testis dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Medicon</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#340591</td>
			<td>Disaggregation cartridge for testis dissociation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#10082139</td>
			<td>FBS, for FACS ceollction</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#H3570</td>
			<td>Hoecsht, For FACS staining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">40&#181;m cell strainer</td>
			<td>GREINER BIO-ONE</td>
			<td>#89508-342</td>
			<td>For testis dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100x 15mm petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#351029</td>
			<td>For testis dissection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5mL polypropylene round-bottom tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#352063</td>
			<td>For FACS collection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5mL Eppendorf tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#20170-650</td>
			<td>For FACS collection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3mL needless syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#309657</td>
			<td>For testis dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50mL conical tube</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>#C50R</td>
			<td>For testis dissociation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Propidium Iodide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#L7011</td>
			<td>PI, For FACS staining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MoFlo&#160;Legacy cell sorter</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>#ML99030</td>
			<td>For FACS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Summit Cell Sorting software</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>#ML99030</td>
			<td>For FACS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate buffered saline&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>#AM9625</td>
			<td>PBS, For microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscopic glass slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#12-544-4</td>
			<td>For microscopy&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>#12-548-87</td>
			<td>For microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Disposable transfer pipette (3mL)&#160;</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>#225</td>
			<td>For testis dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNase I&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>#10104159001</td>
			<td>For testis dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carbon steel surgical blade</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>#4-111</td>
			<td>For testis dissection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Countess automated cell counter&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#C10227&#160;</td>
			<td>For automatic cell counting&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypan blue solution (0.4%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#T8154</td>
			<td>For viability staining&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a standardized approach for multispecies purification of mammalian male germ cells by mechanical tissue dissociation and flow cytometry

Флуоресцентно-активированная сортировка клеток (FACS) была одним из методов выбора для выделения обогащенных популяций клеток яичек млекопитающих. В настоящее время он позволяет различать до 9 популяций половых клеток мыши с высоким выходом и чистотой. Это высокое разрешение в отношении дискриминации и очистки возможно благодаря уникальным изменениям структуры и количества хроматина во всем сперматогенезе. Эти образцы могут быть захвачены проточной цитометрией мужских половых клеток, окрашенных флуоресцентными ДНК-связывающими красителями, такими как Hoechst-33342 (Hoechst). Здесь представлено подробное описание недавно разработанного протокола для выделения клеток яичек млекопитающих. Вкратце, одноцепочечные суспензии образуются из ткани тестикулята механической диссоциацией, дважды окрашиваются Hoechst и пропидиум иодидом (PI) и обрабатываются проточной цитометрией. Последовательная стратегия стробирования, включая выбор живых клеток (отрицательный PI) с различным содержанием ДНК (интенсивность Хоэста), iS, используемые во время сортировки FACS, чтобы различать до 5 типов зародышевых клеток. К ним относятся, с соответствующей средней чистотой (определяемой с помощью оценки микроскопии): сперматогония (66%), первичные (71%) и вторичные (85%) сперматоциты и сперматиды (90%), далее разделенные на круглые (93%) и удлиненные (87%) субпопуляций. Выполнение всего рабочего процесса является простым, позволяет одновременно изолировать 4 типа ячеек с соответствующей машиной FACS и может выполняться менее чем за 2 часа. Поскольку сокращение времени обработки имеет решающее значение для сохранения физиологии клеток ex vivo , этот метод идеально подходит для исследований с высокой пропускной способностью по сравнению с биохимией мужских половых клеток. Более того, стандартизованный протокол для многовидовой очистки зародышевых клеток млекопитающих исключает методологические источники переменных и позволяет использовать один набор реагентов для разных моделей животных.

Одноцепочечные суспензии от механической диссоциации ткани яичка На рисунке 2 сравниваются одноцепочечные суспензии, полученные механической диссоциацией ткани яичек мыши в разных условиях. Образцы, полученные путем ...

Watch this Scientific Journal Video about A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry at JoVE.com

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

В этой работе описывается стандартизация метода получения очищенных популяций зародышевых клеток из ткани яичка различных видов млекопитающих. Это простой протокол, который объединяет механическую диссоциацию яичка, окрашивание Hoechst-33342 и пропидиум иодидом и сортировку FACS с широким применением в сравнительных исследованиях мужской репродуктивной биологии.

Стандартизованный подход к многовидовой очистке клеток мужского германия млекопитающих с помощью механической диссоциации тканей и проточной цитометрии

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

Шаг конкретных сортировка мыши сперматидах цитометрическим

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Идентификация эритромиелоидных прародителей и их потомство в мышечном эмбрионе методом проточной цитометрии

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

Разделительный и анализ клеток поджелудочной железы мезенхимы с помощью проточной цитометрии

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Горизонтальная целая гора: новый протокол обработки и обработки изображений для толстых, трехмерных поперечных сечений кожи

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome

Использование трансплантации гемопоэтических стволовых клеток для оценки происхождения миелодиспластический синдром

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood ...

Real-time Live-cell Flow Cytometry to Investigate Calcium Influx, Pore Formation, and Phagocytosis by P2X7 Receptors in Adult Neural Progenitor Cells

В реальном времени живой клетки проточной цитометрии расследовать приток кальция, порообразования и фагоцитоз, P2X7 рецепторы в клетках взрослых нейронных прародителя

Live-cell flow cytometry is increasingly used among cell biologists to quantify biological processes in a living cell culture. This protocol describes a ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

В Vitro поколения Сомит производных от человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging

Картирование возобновительной пространственной организации клеток млекопитающих с использованием микрошаблонов и количественных изображений

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro ...

RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse

RiboTag Иммунопресации в зародышевых клеток мужской мыши

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, ...

Detection and Quantitation of Label-Retaining Cells in Mouse Incisors using a 3D Reconstruction Approach after Tissue Clearing

Обнаружение и количественное определение клеток, удерживающих метки, в резцах мышей с использованием подхода 3D-реконструкции после очистки тканей

The murine incisor is an organ that grows continuously throughout the lifespan of the mouse. The epithelial and mesenchymal stem cells residing in the ...