Name: a standardized approach for multispecies purification of mammalian male germ cells by mechanical tissue dissociation and flow cytometry
Uploaded: 2017-07-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry at JoVE.com

Författarna tackar Hillside Animal Hospital (St. Louis, MO) för hund testes; Jason Arand och Dr. Ted Cicero&#39;s lab vid Washington University i St. Louis (WashU) för att tillhandahålla råttesteser och Brianne Tabers för att hjälpa till med samlingen; Jared Hartsock och Dr. Salt Lab på WashU för marsvin testes; Och Dr. Michael Talcott vid Division of Comparative Medicine vid WashU för miniatyrgris testis. Författarna erkänner också Alvin J. Siteman Cancer Center vid Washington University School of Medicine och Barnes-Jewish Hospital i St. Louis, MO, för användning av Siteman Flow Cytometry Core, som tillhandahöll personalstyrd cellsorteringstjänst. Siteman Cancer Center stöds delvis av NCI Cancer Center Support Grant # P30 CA91842. Denna forskning finansierades av ett FCT-stipendium [SFRH / BD / 51695/2011 till ACL], bidrag från Förenta staternas nationella institut för hälsa [R01HD078641 och R01MH101810 till DFC] och ett FCT-forskningskontrakt [IF / 01262/2014 till AML].

Alla procedurer som beskrivs nedan överensstämde med bestämmelserna i Animal Studies Committee vid Washington University i St. Louis. 1. Förberedelser för mekanisk dissociation protokoll <ol><li> Förvätska en 50 μm disponibel vävnadsdisaggeringspatron för dissociering av en hel murint testis. ANMÄRKNING: Denna disponibla vävnadsdisagreringspatron innehåller mikrobladen avsedda för skärning av vävnader och ett immobilt stålnät med cirka 100 hexagona...

<ol>
	<li>Bastos, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis.">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).</li><li>Gaysinskaya, V., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+murine+spermatocytes.">Flow cytometry of murine spermatocytes.</a> Curr Protoc Cytom. 72, (2015).</li><li>Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+for+gene+expression+studies+in+Mammalian+spermatogenesis.">Flow cytometry for gene expression studies in Mammalian spermatogenesis.</a> Cytogenet Genome Res. 128 (1-3), 46-56 (2010).</li><li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells.">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li><li>Lima, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispecies+Purification+of+Testicular+Germ+Cells.">Multispecies Purification of Testicular Germ Cells.</a> Biol Reprod. , (2016).</li><li>Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+spermatogenic+cell+types+using+STA-PUT+velocity+sedimentation.">Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation.</a> J Vis Exp. (80), (2013).</li><li>Chang, Y. F., Lee-Chang, J. S., Panneerdoss, S., MacLean, J. A., Rao, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Sertoli,+Leydig,+and+spermatogenic+cells+from+the+mouse+testis.">Isolation of Sertoli, Leydig, and spermatogenic cells from the mouse testis.</a> Biotechniques. 51 (5), (2011).</li><li>Margolin, G., Khil, P. P., Kim, J., Bellani, M. A., Camerini-Otero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+transcriptome+analysis+of+mouse+spermatogenesis.">Integrated transcriptome analysis of mouse spermatogenesis.</a> BMC Genomics. 15, 39 (2014).</li><li>Grogan, W. M., Farnham, W. F., Sabau, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+analysis+and+sorting+of+viable+mouse+testis+cells.">DNA analysis and sorting of viable mouse testis cells.</a> J Histochem Cytochem. 29 (6), 738-746 (1981).</li><li>Mays-Hoopes, L. L., Bolen, J., Riggs, A. D., Singer-Sam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+spermatogonia,+spermatocytes,+and+round+spermatids+for+analysis+of+gene+expression+using+fluorescence-activated+cell+sorting.">Preparation of spermatogonia, spermatocytes, and round spermatids for analysis of gene expression using fluorescence-activated cell sorting.</a> Biol Reprod. 53 (5), 1003-1011 (1995).</li><li>Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+flow+cytometry+isolation+of+murine+spermatocytes.">Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes.</a> Cytometry A. 85 (6), 556-565 (2014).</li><li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo.">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li><li>Watson, J. V., Nakeff, A., Chambers, S. H., Smith, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+fluorescence+emission+spectrum+analysis+of+Hoechst-33342-stained+DNA+in+chicken+thymocytes.">Flow cytometric fluorescence emission spectrum analysis of Hoechst-33342-stained DNA in chicken thymocytes.</a> Cytometry. 6 (4), 310-315 (1985).</li><li>Lassalle, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Side+Population'+cells+in+adult+mouse+testis+express+Bcrp1+gene+and+are+enriched+in+spermatogonia+and+germinal+stem+cells.">'Side Population' cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells.</a> Development. 131 (2), 479-487 (2004).</li><li>Omran, H. M., Bakhiet, M., Dashti, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+integrity+is+a+critical+molecular+indicator+for+the+assessment+of+male+infertility.">DNA integrity is a critical molecular indicator for the assessment of male infertility.</a> Mol Med Rep. 7 (5), 1631-1635 (2013).</li><li>Rodriguez-Casuriaga, R., Folle, G. A., Santinaque, F., Lopez-Carro, B., Geisinger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+technique+for+the+preparation+of+testicular+cell+suspensions.">Simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li><li>Rodriguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santinaque, F. F., Lopez-Carro, B., Folle, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-purity+flow+sorting+of+early+meiocytes+based+on+DNA+analysis+of+guinea+pig+spermatogenic+cells.">High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells.</a> Cytometry A. 79 (8), 625-634 (2011).</li><li>Rodriguez-Casuriaga, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+preparation+of+rodent+testicular+cell+suspensions+and+spermatogenic+stages+purification+by+flow+cytometry+using+a+novel+blue-laser-excitable+vital+dye.">Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye.</a> MethodsX. 1, 239-243 (2014).</li><li>Rodriguez-Casuriaga, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-fast+and+optimized+method+for+the+preparation+of+rodent+testicular+cells+for+flow+cytometric+analysis.">Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis.</a> Biol Proced Online. 11, 184-195 (2009).</li><li>Hess, R. A., Renato de Franca, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis+and+cycle+of+the+seminiferous+epithelium.">Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium.</a> Adv Exp Med Biol. 636, 1-15 (2008).</li><li>Zhao, H., Traganos, F., Dobrucki, J., Wlodkowic, D., Darzynkiewicz, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+DNA+damage+response+by+the+supravital+probes+of+nucleic+acids.">Induction of DNA damage response by the supravital probes of nucleic acids.</a> Cytometry A. 75 (6), 510-519 (2009).</li><li>Gassei, K., Ehmcke, J., Dhir, R., Schlatt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+activated+cell+sorting+allows+isolation+of+spermatogonia+from+adult+primate+testes+and+reveals+distinct+GFRa1-positive+subpopulations+in+men.">Magnetic activated cell sorting allows isolation of spermatogonia from adult primate testes and reveals distinct GFRa1-positive subpopulations in men.</a> J Med Primatol. 39 (2), 83-91 (2010).</li><li>Hayama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+selection+methods+for+rat+and+mouse+round+spermatids+without+DNA+staining+by+flow+cytometric+cell+sorting.">Practical selection methods for rat and mouse round spermatids without DNA staining by flow cytometric cell sorting.</a> Mol Reprod Dev. 83 (6), 488-496 (2016).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+selection+of+valuable+mutant+mouse+round+spermatids+and+strain+rescue+via+round+spermatid+injection.">FACS selection of valuable mutant mouse round spermatids and strain rescue via round spermatid injection.</a> Zygote. 23 (3), 336-341 (2015).</li></ol>

Med tanke på den högt konserverade kromatindynamiken under spermatogenesen hos däggdjur var målet med detta arbete att utveckla ett protokoll för att isolera manliga könsceller i olika steg av differentiering från olika däggdjursvätskor i testiklar ( Figur 1 ). Ett av de största hindren i tillämpningen av ett enda arbetsflöde på olika djurmodeller är behovet av artsspecifika anpassningar, speciellt vad gäller vävnadsdissociationsprotokoll. Nuvarande metoder förlitar sig huv...

Med tanke på bristen på ett in vitro- system som är representativt för spermatogenesprogression och närvaron av stor cell heterogenitet i testis, kräver studier av manlig bakteriefelbiologi robusta tekniker för att isolera berikade populationer av specifika celltyper. Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) har använts i stor utsträckning för detta ändamål 1 , 2 , 3 , 4 , 5 eftersom det ger hög utbyte och renhet och överträffar andra isoleringsmetoder i antalet bakteriecellstyper som den kan identifiera och Välj 6 , 7 , 8 . Principen för flödescytometrianalys är baserad på detektering av differentialljusmönster efter laserstrålens excitation av enskilda celler. När en cell passerar genom lasern speglar den / sprider ljusetVid alla vinklar, proportionell mot cellstorlek (framåtriktad scatter; FSC) och till intracellulär komplexitet (sidospridning; SSC). Se Ormerod 9 för detaljerad information om flödescytometri. Manliga bakterieceller genomgår specifika modifieringar i DNA-innehåll, kromatinstruktur, storlek och form under olika steg av spermatogenes. Sålunda kan separata cellpopulationer identifieras och separeras genom att kombinera ljusspridning och DNA-färgning med fluorescerande färgämnen 10 , 11 . Flera färgämnen kan användas för detta ändamål (översynen i Geisinger och Rodriguez-Casuriaga 3 ), såsom Hoechst-33342 (Hoechst) som har använts ofta i flödescytometrianalys av testikelceller under det senaste decenniet 1 , 2 , 4 , 10 , 12 . UpoN excitation med UV-ljus, emitterar Hoechst blå fluorescens proportionell mot cell-DNA-innehållet medan långt röd fluorescens återspeglar variation i kromatinstruktur och komprimering 1 , 13 , 14 . Som ett resultat uppvisar manliga könsceller i olika steg av differentiering specifika mönster under FACS av Hoechst-färgade enkelcellsuspensioner (Ho-FACS; 1 , 12 ). Intressant är att intensiteten hos Hoechst-blå fluorescens inte är proportionell mot kromatinhalten i dessa celler på grund av en mekanism för färgutsläpp som endast är aktiv under spermatogonalt stadium, och de kluster som en sidopopulation under Ho-FACS 15 . Dessutom tillåter kombinering av Hoechst-färgning med det icke-permeanta färgämnet propidiumjodid (PI) användarna att diskriminera levande (PI-negativa) från döda (PI-positiva) celler under FACS 1 &lt;Sup&gt;, 2 , 10 , 12 . Denna strategi har tidigare använts i flödescytometriska analyser av testikulära bakterieceller och optimeras extensivt i musen för att diskriminera upp till 9 bakterie celltyper, inklusive celler i 4 olika steg av meiosi I 1 , 2 , 4 , 16 . För detta arbete har Hoechstfärgning tre huvudfördelar. Först har Ho-FACS framgångsrikt applicerats på isoleringen av manliga könsceller i musmodellen 1 , 2 , 12 och andra gnagare såsom råtta och marsvin 17 , 18 , 19 . För det andra är Hoechst ett cellgenomsläppligt färgämne och kräver inte membranpermeabilisering, så det förbehållsVes cellintegritet. Slutligen krävs ingen RNase-behandling eftersom Hoechst binder företrädesvis till poly (d [AT]) DNA-sekvenser 1 , 20 vilket innebär att RNA bevaras och förutom DNA och proteiner kan användas för ytterligare nedströms molekylära studier av bakterie Celldifferentiering. Trots likheten i DNA-ploidi och / eller fläckbarhet observerad i flödescytometrianalyser av däggdjursarter (granskad i Geisinger och Rodriguez-Casuriaga 3 ) har det skett en stor variation i protokollen som beskrivits för manlig bakteriecells isolering genom flödescytometri. Olika studier har använt specifika protokoll för vävnadsdissociation och använde separata DNA-bindande färgämnen (ensamma eller i kombination) och FACS-gatingstrategier i olika modellorganismer, huvudsakligen mus, råtta och marsvin. Följaktligen kan direkt jämförelse av data som samlas in för olika arter påverkas av unaccoUnted tekniska artefakter som härrör från variationer mellan metoder. Viktigt är att den slående bevarande av kromatindynamiken genom hela spermatogenesen hos däggdjur (2N-4N-2N-1N) antyder att ett standardiserat protokoll kan tillämpas tvärs över en mängd olika däggdjursarter. Målet med denna studie var att utveckla ett enda arbetsflöde som är tillämpligt på olika däggdjursarter genom att kombinera och anpassa tidigare publicerade tekniker 2 , 20 . Standardisering av en metod för vävnadsbehandling uppnåddes genom att man utför mekanisk dissociation för att övervinna behovet av artspecifika justeringar som krävs för enzymatisk digestion 5 . Det är anmärkningsvärt att mekanisk dissociation av gnagare testikulär vävnad har visat sig fungera bättre än enzymatisk vävnadsdigestion 20 och Ho-FACS av enkelcellssuspensioner som alstras med båda metoderna uppvisarDet jämförbara resultatet 5 . Som principiellt bevis beskriver detta protokoll de inställningar som används för att isolera upp till 5 bakteriecellspopulationer: spermatogonia (SPG); Primär (SPC I) och sekundära spermatocyter (SPC II) och spermatider (SPD) - round (rSPD) och elongating (eSPD). Viktigt är att det är lätt att genomföra i labbet, där huvudkraven är systemet för vävnadsdissociation och tillgång till en cell sorterare utrustad med en UV-laser. Detta arbetsflöde ( Figur 1 ) är snabb och okomplicerad och möjliggör samtidig isolering av 4 bakteriecellspopulationer från frisk testikelvävnad på mindre än 2 timmar. Den reducerade bearbetningstiden är avgörande för att upprätthålla cellulär integritet för ytterligare nedströms procedurer. Dessutom föreslår dess framgångsrika prestanda i 5 olika arter att den i stor utsträckning kan appliceras inom däggdjursskivan, vilket gör den till en idealisk metod för att isolera bakterieceller för jämförande studier av däggdjursframkallande biology. Detta protokoll består av tre huvuddelar, bortsett från förberedande steg: (1) den mekaniska dissociationen av testikelvävnad och (2) färgning av testikelceller med Hoechst och PI, följt av (3) FACS-sortering av relevanta spermatogena celler. När de är uppsamlade kan dessa berikade populationer av olika testceller från däggdjursceller användas för ett brett användningsområde. Detta protokoll beskriver en dissociationsmetod för &quot;enstorlek som passar alla&quot; för att rena manliga bakterieceller från många olika däggdjursarter. Beroende på vilken typ av studie användarna vill genomföra med de isolerade bakteriecellerna kan andra medier eller buffertar användas. Följande protokollsteg är för att generera enkelcellsuspensioner från en hel murint testis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="731">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:239px;">4% paraformaldehyde</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">#15710</td>
			<td style="width:279px;">4% PFA, For fixing sorted cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Medimachine</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#340588;</td>
			<td>System for testis dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1X Dulbecco modified Eagle medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#31053</td>
			<td>DMEM, for testis dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Medicon</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#340591</td>
			<td>Disaggregation cartridge for testis dissociation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#10082139</td>
			<td>FBS, for FACS ceollction</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#H3570</td>
			<td>Hoecsht, For FACS staining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">40&#181;m cell strainer</td>
			<td>GREINER BIO-ONE</td>
			<td>#89508-342</td>
			<td>For testis dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100x 15mm petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#351029</td>
			<td>For testis dissection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5mL polypropylene round-bottom tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#352063</td>
			<td>For FACS collection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5mL Eppendorf tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#20170-650</td>
			<td>For FACS collection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3mL needless syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#309657</td>
			<td>For testis dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50mL conical tube</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>#C50R</td>
			<td>For testis dissociation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Propidium Iodide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#L7011</td>
			<td>PI, For FACS staining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MoFlo&#160;Legacy cell sorter</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>#ML99030</td>
			<td>For FACS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Summit Cell Sorting software</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>#ML99030</td>
			<td>For FACS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate buffered saline&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>#AM9625</td>
			<td>PBS, For microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscopic glass slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#12-544-4</td>
			<td>For microscopy&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>#12-548-87</td>
			<td>For microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Disposable transfer pipette (3mL)&#160;</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>#225</td>
			<td>For testis dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNase I&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>#10104159001</td>
			<td>For testis dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carbon steel surgical blade</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>#4-111</td>
			<td>For testis dissection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Countess automated cell counter&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#C10227&#160;</td>
			<td>For automatic cell counting&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypan blue solution (0.4%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#T8154</td>
			<td>For viability staining&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a standardized approach for multispecies purification of mammalian male germ cells by mechanical tissue dissociation and flow cytometry

Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) har varit en av de metoder som valts för att isolera berikade populationer av däggdjurs testikulära bakterieceller. För närvarande tillåter det diskriminering av upp till 9 murina bakteriecellspopulationer med högt utbyte och renhet. Denna högupplösning i diskriminering och rening är möjlig på grund av unika förändringar i kromatinstruktur och kvantitet genom spermatogenes. Dessa mönster kan fångas genom flödescytometri hos manliga bakterieceller färgade med fluorescerande DNA-bindande färgämnen, såsom Hoechst-33342 (Hoechst). Här är en detaljerad beskrivning av ett nyligen utvecklat protokoll för att isolera däggdjurs testikulära bakterieceller. I korthet alstras enkelcellssuspensioner från testikelvävnad genom mekanisk dissociation, dubbelfärgad med Hoechst och propidiumjodid (PI) och behandlad genom flödescytometri. En seriell gatingstrategi, inklusive valet av levande celler (PI-negativa) med olika DNA-innehåll (Hoechst-intensitet), jagS som används vid FACS-sortering för att diskriminera upp till 5 bakteriecellstyper. Dessa ingår, med motsvarande genomsnittliga renheter (bestämda genom mikroskopi-utvärdering): spermatogoni (66%), primära (71%) och sekundära (85%) spermatocyter och spermatider (90%), ytterligare separerade till rund (93%) och förlängande (87%) subpopulationer. Utförandet av hela arbetsflödet är enkelt, möjliggör isolering av 4 celltyper samtidigt med lämplig FACS-maskin och kan utföras på mindre än 2 timmar. Eftersom reducerad bearbetningstid är avgörande för att bevara fysiologin hos ex vivo- celler, är denna metod ideell för nedströms hög genomströmningsstudier av manlig bakteriebiologi. Vidare eliminerar ett standardiserat protokoll för multispecies-rening av däggdjurscellenceller metodkällor för variabler och tillåter att en enda uppsättning reagenser används för olika djurmodeller.

Enkeltcellssuspensioner från mekanisk dissociation av testikelvävnad I figur 2 jämförs enkelcellsuspensioner erhållna genom mekanisk dissociation av mus-testikelvävnad under olika betingelser. Prover erhållna genom behandling av färsk vävnad, ostainad ( Figur 2A ) eller färgad med Hoechst ( Figur 2B ) visar närvaron av enskilda ce...

Watch this Scientific Journal Video about A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry at JoVE.com

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Detta arbete beskriver standardiseringen av en metod för att erhålla renade bakteriecellspopulationer från testikelvävnad hos olika däggdjursarter. Det är ett enkelt protokoll som kombinerar mekanisk testdissociation, färgning med Hoechst-33342 och propidiumjodid och FACS-sortering, med breda tillämpningar i jämförande studier av manlig reproduktiv biologi.

En standardiserad tillvägagångssätt för multispecies Rening av mammaliska manliga cellceller genom mekanisk vävnadsdissociation och flödescytometri

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

Steg-specifik Sortering av mus spermatider med flödescytometri

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Identifikation av erytromyeloidprogenitorer och deras avkomma i musembryo med flödescytometri

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

Isolera och analysera celler i bukspottkörteln mesenkym med flödescytometri

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horisontell helmontering: Ett nytt bearbetnings- och bildprotokoll för tjocka, tredimensionella vävnads tvärsnitt av huden

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome

Användning av hematopoetisk stamcellstransplantation att bedöma beskärningen av myelodysplastiskt syndrom

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood ...

Real-time Live-cell Flow Cytometry to Investigate Calcium Influx, Pore Formation, and Phagocytosis by P2X7 Receptors in Adult Neural Progenitor Cells

Realtid Live-cell flödescytometri att undersöka kalcium tillströmning, Pore bildandet och fagocytos av P2X7-receptorer i vuxen neurala stamceller

Live-cell flow cytometry is increasingly used among cell biologists to quantify biological processes in a living cell culture. This protocol describes a ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro Generation av Somite derivat från mänskliga inducerade stamceller pluripotenta

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging

Kartlägga den framväxande rumsliga organiseringen av däggdjursceller med hjälp av Mikromönster och kvantitativ avbildning

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro ...

RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse

RiboTag Immunoprecipitation i Könsmusens celler

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, ...

Detection and Quantitation of Label-Retaining Cells in Mouse Incisors using a 3D Reconstruction Approach after Tissue Clearing

Detektion och kvantifiering av etiketthållande celler i musframtänder med hjälp av en 3D-rekonstruktionsmetod efter vävnadsrensning

The murine incisor is an organ that grows continuously throughout the lifespan of the mouse. The epithelial and mesenchymal stem cells residing in the ...