Name: bioengineering of humanized bone marrow microenvironments in mouse and their visualization by live imaging
Uploaded: 2017-08-01T15:00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging at JoVE.com

Vi takker personalet i kernefaciliteterne på Francis Crick Institute (Biologisk Forskningsfacilitet, In Vivo Imaging and Experimental Histopathology) og Yolanda Saavedra-Torres og Mercedes Sanchez-Garzon, dyrlægerne hos Crick og LRI, for deres værdifulde hjælp. Vi er taknemmelige for Dr. W. Gray for kritisk læsning af manuskriptet. DP blev støttet af et ikke-klinisk stipendium fra EHA. Dette arbejde blev støttet af The Francis Crick Institute, der modtager sin kernefinansiering fra Cancer Research UK (FC001045), Det Forenede Kongerige Medical Research Council (FC001045) og Welcome Trust (FC001045).

Alle dyreforsøg blev udført under PPL 70/8904, godkendt af UK Home Office og i overensstemmelse med Cancer Research UK retningslinjer. Anvendelsen af ​​humant navlestrengsblod (UCB) og primær human akut myeloid leukæmi (AML) -prøver blev godkendt af det østlige etiske udvalg efter godkendelse og blev udført i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen. 1. Bioengineering kollagenbaserede stilladser med humane hæmatopoietiske og stromale celler BEMÆRK: Hele protokollen skal udføres i sterile forhold og med sterilt materiale. Cellekulturmedium 1 svarer til hMSC-medium (MEM-a, P / S og 10% hMSC-FBS); Cellekulturmedium 2 svarer til EC-medium (M199, 20% FBS, P / S, 10 mM HEPES, 50 μg / ml heparin, 2 mM glutamin og 50 μg / ml ECGS) og cellekulturmedium 3 svarer til hæmatopoietisk cellemedium (H5100 Og P / S). <ol><li> Klargør navlestrengsblod mOnonucleære celler (CB-MNC&#39;er) eller primære AML (knoglemarv eller perifere blod MNC&#39;er) ved anvendelse af en Ficoll-Paque densitetsgradient ifølge veletablerede protokoller 53 . <ol><li> For AML nedbryder T-cellerne ved hjælp af OKT.3-antistof. Inkuber 4 μg OKT.3 pr. 1 x 10 6 AML MNC&#39;er i 30 minutter ved stuetemperatur, før vask af cellerne i PBS. Hvis det kræves, cryopreserve MNC&#39;erne i FBS med 10% DMSO ved 2 x 10 8 celler per ml. </li></ol></li><li> Forbered hMSC (kulturmedium 1) og EC (kulturmedium 2) cellekulturer. Plad hMSC-celler (se Materialetabellen ) på almindelige cellekulturflasker i hMSC-medium. Plade EC&#39;er (se Materialetabellen ) på kollagen 1-belagte overflader i EC-medium. </li><li> Ved 85-90% cellekonfluens fjerne mediet, vask to gange med PBS, og der tilsættes trypsin-EDTA-opløsning (20 pi pr cm2). <ol><li> Efter 5 minutter skal du kontrollere, at cellerne er adskilt. Genopret cellerne ved at fortynde 1:3 med cellekulturmedium. Centrifuger ved 300 xg i 5 minutter og suspenderes i det tilsvarende medium for hver celletype og tæller cellerne ved anvendelse af et Neubauer-kammer. </li><li> Brug celler ved 2 x 10 6 - 10 7 celler pr. Ml. Hvis begge celletyper skal bruges sammen, blandes hMSC- og EC-suspensionerne i et 1: 1-forhold. </li></ol></li><li> Overfør cellesuspensionen til en insulinsprøjte. </li><li> Ved hjælp af en skalpel skal du klippe den oprindelige stillads (20 mm x 60 mm x 7 mm) af steriliseret gelatinsvamp ( f.eks. Gelfoam) i 24 stk. Af samme størrelse (6,6 mm x 7,5 mm x 7 mm, figur 1A og B ). </li><li> Rekonstituer gelatine stilladser ved nedsænkning i PBS (5 min). </li><li> En efter en sæt forsigtigt stilladserne på et sterilt væv for at fjerne overskydende PBS. Overfør stilladserne til en brønd i en 24-brønds plade (ultra-lav vedhæftningsoverflade), og brug sprøjten til at injicere 50 μL indeholdende 10 5 - 10 6 celler (hMSC alEn eller i kombination med hEC; Figur 1C ). </li><li> Gentag trin 1.7 med hver stillads, indtil alle nødvendige stilladser er podet med stromaceller. </li><li> Inkubér i 1 time i en cellekultur-inkubator (37 ° C og CO 2 5%). </li><li> Fyld hver brønd med 3 ml cellekulturmedium 1 ( Figur 1D ) og returner stilladserne til en cellekulturinkubator (37 ° C og CO 2 5%) til inkubation natten over. Brug cellekulturmedium 2, hvis EC&#39;er anvendes i stilladserne. </li><li> Optø CB-MNC&#39;er og isoler CD34 + celler fra dem efter en passende CD34 + sektions kit protokol. Suspender de valgte CD34 + celler i medium 3 og tæl dem i et Neubauer-kammer. BEMÆRK: Her blev celler anvendt i en koncentration på 2 x 106 celler pr. Ml. <ol><li> Hvis AML-patientafledte primære prøver anvendes, skal de tøde cellerne, fortynde dem 1:10 i FBS, centrifugere dem i 5 minutter ved 300Xg, resuspender cellerne i PBS-2% FBS, tilsæt anti-humant CD3-antistof (2 - 4 μg pr. 106 celler) og inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter. Centrifuger i 5 minutter ved 300 xg og resuspenderes i hæmatopoietisk cellemedium suppleret med cytokiner (20 ng / ml granulocytkolonistimulerende faktor (G-CSF), 20 ng / ml IL-3 og 20 ng / ml thrombopoietin (TPO)) . </li></ol></li><li> Gentag trin 1.7 - 1.9, men i dette tilfælde frø 1 x 10 5 humane hæmatopoietiske celler i stedet for stromalkomponenter som ovenfor. <ol><li> Fyld brønden med 3 ml cellekulturmedium 3 ( Figur 1D ) og returner stilladserne til en cellekulturinkubator (37 ° C og CO 2 5%) til inkubation natten over. Brug en 1: 1 blanding af cellekulturmedier 2 og 3 Hvis EC&#39;er anvendes i stilladserne. </li></ol></li><li> For kun rekombinant humant knoglemorfogenetisk protein-2 (rhBMP-2) bærestativ stiller forsigtigt stilladserne en efter en på et sterilt væv for at fjerne overskydende PBS. Overfør stilladserne til en brønd af en u-bund, 96-brønds plade ( Figur 1E ) og tilsæt 5 μL rhBMP-2, der dækker grundigt bygningen. <ol><li> Tilsæt 20 μl thrombin efterfulgt af 20 μl fibrinogen, og dækker grundigt dækket hver gang ( figur 1F ). Gentag proceduren for hver stillads, indtil alle nødvendige stilladser er behandlet og inkuber derefter i 5 - 10 minutter ved 37 ° C. Kontroller, om koagulering er vellykket dannet. </li></ol></li></ol> 2. Kirurgisk implantation af bioengineerede stilladser BEMÆRK: Her anvendes enten mænd eller kvinder, 6- til 12 ugers gamle NSG-mus. Da dyrene er immunodeficiente, skal alle procedurer udføres under sterile betingelser. Trin 2.10 - 2.13 er relateret til overlevelsesstrategier og postkirurgisk pleje. <ol><li> 60 - 120 minutter før kirurgi, administrere smertemedicin (carprofen, 5 mg / kg legemsvægt / mus) subkutant.</li><li> Narkosen i et kammer med 0,5% isofluran og 2 L / min O2. Mus skal overvåges kontinuerligt under proceduren. Overfør dyret til det kirurgiske område i udsat position for at få nem adgang til ryggen. Hold dyret under anæstesi ved hjælp af en næse kegle, der leverer 1,5% isofluran og 2 L / min O 2 . Hold musen under anæstesi under den kirurgiske procedure og kontroller ofte dyrtilstanden. </li><li> Mens det er under bedøvelse, skal du bruge oftalmisk gel i øjnene af musen for at forhindre tørhed og holde musen ved 37 ° C. </li><li> Barber det kirurgiske område på bagsiden af ​​musen ved hjælp af en elektrisk trimmer. For at sterilisere huden, dip en bomuldsspids i fortyndet clorexidin (fortyndet 1:10 i PBS) og brug dette tip til at rengøre hudoverfladen. Gentag denne procedure to gange. </li><li> Ved hjælp af sterile pincet og en skalpæl (eller saks), lav en 0,5 til 0,7 cm anterior-til-posterior fuld indsnit af huden. Brug pincet indsatUnder det subkutane væv for at lave en lomme. </li><li> Indsæt stilladset subkutant, sørg for at det er placeret dybt inde i lommen ( Figur 1G og H ). Luk snit med kirurgisk lim ( figur 1I og J ). </li><li> Til behandling af postkirurgisk smerte administrerer subkutant buprenorphin (0,1 mg / kg legemsvægt). </li><li> Ved genopretning skal dyret placeres i sin side i et forvarmet bur og overvåges, indtil normal adfærd er observeret. </li><li> Fortynd smerte medicin i vand (carprofen, 0,1 mg / ml vand) og give det til dyr som drikkevand i 4 dage efter operationen. </li><li> Kontroller dyret og såret ofte i 48-timers efter-kirurgisk periode for mulige bivirkninger. </li></ol> 3. Musebehandlinger, eutanasi og prøveudtagning til billeddannelse BEMÆRK: Analyse af stilladserne udføres mellem8 og 24 uger efter implantation. <ol><li> 60 minutter før billeddannelse, hold den implanterede mus varm i en opvarmningskasse ved 37 ° C og administrer 100 μL human immunoglobulin intravenøst ​​for at blokere uspecifikke steder. </li><li> 30 minutter før billeddannelse administrerer intravenøst ​​10 μg (pr. Mus) af specifikke antistoffer til mærkning af celler af interesse. </li><li> 5 minutter før billeddannelse administreres intravenøst ​​15 μL (fortyndet i 100 μl PBS) af 655 nm fluorophore-mærket, kar-poolingsmiddel (655-VPA) for at visualisere vaskulære strukturer. </li><li> Euthanize musen via cervikal dislokation. </li><li> Ved hjælp af skarpe saks, lav et langsgående hudindsnit på bagsiden af ​​musen, nær det originale implantationssted. </li><li> Ved hjælp af pincet og saks adskilles huden forsigtigt fra den subkutane lomme, hvor stilladset er blevet implanteret. </li><li> Hold stilladset med pincet og ekspander forsigtigt det fra huden ved at skære den resterende membran aNd væv omkring bygningen ved hjælp af saks. Se eksempler på stilladser, der skal udvindes i figur 2 . </li><li> Fastgør stilladset med hurtigvirkende klæbemiddellim til en billedplade (en 35 mm x 10 mm petriskål) og fyld med saltvandsløsning (PBS) ved stuetemperatur. </li><li> For BMP-stilladser, før du fylder pladen med PBS, skal du bruge en kirurgisk mikrodrill til at tynde knogleoverfladen under et mikrokirurgisk mikroskop. Dette tillader fluorofor visualisering og billedoptagelse med høj opløsning. Brug enten 1,2- eller 1,6 mm burrerne afhængigt af stillads størrelse. BEMÆRK: Brugeren vil indse, hvor meget der skal bores afhængigt af benets tykkelse. I almindelighed, da BMP-stilladserne er vaskulariserede, vil benet lidt ændre farve og blive mere rød, når den nærmer sig den korrekte tykkelse til billeddannelse. </li><li> Indsæt pladen på scenen af ​​det konfokale mikroskop. </li></ol> 4. Live-billeddannelse ved brug af to-foton mikroskopKopier BEMÆRK: Brug altid NDD-skyderen til billeddannelse til at styre fluorescensen til NDD, når der anvendes ikke-descannede detektorer (NDD). Mikroskopkonfigurationen er tilvejebragt i figur 3 . <ol><li> Tænd mikroskopet og computeren, start softwaren ved at klikke på &quot;Start system&quot; og gå til &quot;Acquisition&quot; -tilstanden. </li><li> Marker boksen &quot;Vis manuelle værktøjer&quot;. I &quot;Laser&quot; -menuen tændes &quot;to&quot; -fotonlaseren og tillader den at varme op og stabilisere. </li><li> I menuen &quot;Imaging Setup&quot; aktiveres samtidig &quot;Channel Mode&quot; og &quot;Switch track every Frame.&quot; Vælg &quot;Non Descanned&quot; og &quot;Main Beam Splitter MBS 760+&quot; i menuen &quot;Light Path&quot;. Marker for at aktivere de fire NDD&#39;er og indstil konfigurationen som vist i Figur 3 . BEMÆRK: Med denne konfiguration er collagensignalet fra knoglestrukturer (sekOnd harmonisk generation, SHG) indsamles ved 380 - 485 nm, FITC-hCD31 + humane endotelceller og AF488-hCD45 + humane hæmatopoietiske celler ved 500-550 nm og 655-VPA ved 640-690 nm. </li><li> I &quot;Kanaler&quot; -menuen indstilles &quot;laserbølgelængden&quot; til 890 nm og effekten til 50%. Indstil &quot;Gain (Master)&quot; til 500-600, &quot;Digital Offset&quot; til 0 og &quot;Digital Gain&quot; til 15 for hver kanal. Juster disse værdier, når overtagelsen er startet. </li><li> I &quot;Acquisition Mode&quot; skal du oprette de nødvendige parametre for at opnå billeder i høj opløsning uden at beskadige vævet og blegning af fluoroforerne. Indstil &quot;Scan Mode&quot; til &quot;Frame&quot;, &quot;Frame Size&quot; til &quot;x512 y512,&quot; Line Step &quot;til 1,&quot; Speed ​​&quot;til 9,&quot; Averaging nummer &quot;til 8,&quot; Bitdybde &quot;til&quot; 8 Bit &quot; Mode &quot;til&quot; linje &quot;,&quot; retning &quot;til&quot; tovejs &quot;og&quot; metode &quot;til&quot; betyde &quot;. <ol><li> Indstil &quot;ZoOm &quot;til 1 for den første scanning af billedet, og øg den hvis det kræves for at fokusere på bestemte områder. </li></ol></li><li> Placér pladen, der indeholder stilladset på mikroskopstrinnet under 20X, 1,0 NA vanddypen, og sænk linsen, indtil den berører saltopløsningen. Indstil linsens fokus på stilladset ved hjælp af mikroskopens okularer ved hjælp af en lampe som lyskilde. </li><li> Aktiver &quot;Z-stack&quot; -menuen, vælg funktionen &quot;Første / sidste&quot; og indstil det ønskede interval mellem to sub-sekventielle skiver ( fx 2-μm Z-stack). Hold intervallerne konstante inden for Z-stacken. </li><li> Vælg &quot;Live&quot; for at se en live scan af prøven og juster &quot;Digital Gain&quot; og &quot;Digital Offset&quot; for optimal eksponering. For at visualisere flere kanaler på samme tid, vælg &quot;Split&quot; -funktionen. </li><li> I menuen &quot;Stage&quot; skal du scanne i &quot;Live&quot; -tilstanden og se &quot;Marker&quot; -områderne i interEst (ROI), såsom placeringen af ​​humane hæmatopoietiske celler og vaskulære strukturer. Når scanningen af ​​prøven er færdig, skal du flytte til det første ROI for at starte billeddannelsen. </li><li> I &quot;Live&quot; -modus skal du indstille toppen og bunden af ​​3D Z-stacken, der omgiver området af interesse ved hjælp af funktionerne &quot;Set first&quot; og &quot;Set last&quot;. Når du er færdig, sættes centret, &quot;C.&quot; Start overtagelsen af ​​investeringsafkastet med knappen &quot;start eksperiment&quot;. Se eksempler på billeder i figur 4 , figur 5 og figur 6 . </li><li> Når købet er færdigt, skal du gemme billedet i den udpegede mappe. Flyt til det næste afkast og gentag trin 4.10. Når eksperimentet er færdigt, skal du fjerne billedpladen fra mikroskopet, afmonter prøven forsigtigt fra pladen, og rengør eventuelt resterende lim. </li><li> Forbered prøven til næste analyseteknik. </li></ol> 5. PrøveprocesG for histologi og immunforsvar BEMÆRK: Prøver behandles i overensstemmelse med protokollen beskrevet i JoVE generelle laboratorieteknikker 54, der beskriver prøvefiksering, indlejring og sektionsprocesser. Bendannende prøver skal behandles i 7 dage i et EDTA-baseret afkalkningsmiddel mellem fikserings- og indlejringsprocesserne. Blokerings- / permeabiliseringsopløsningen er 10 mM PBS pH 7,4 buffer med 1% Triton X-100, 1% bovint serumalbumin (BSA) og 10% normalt gedsserum (NGS). <ol><li> Sætte skiverne i xylen i 10 minutter), xylen i 5 minutter, 100% ethanol i 5 minutter, 70% ethanol i 5 minutter, 50% ethanol i 5 minutter, og H2O i 5 min. </li><li> Overfør skiverne til en citratbaseret antennemaskerende arbejdsløsning. </li><li> Kog skiverne i 15 minutter og lad dem køle af til stuetemperatur. </li><li> Vask skiverne i 10 mM PBS pH 7,4 opløsning med 1% Triton X-100 (5 minutter, 3 gange). </li><li> Overfør samPles til blokerings / permeabiliseringsopløsningen og inkuberes i 30 minutter. </li><li> Tilsæt primær antistof fortyndet i blokerings / permeabiliseringsopløsning og inkuber natten over ved 4 ° C. </li><li> Vask skiverne i 10 mM PBS pH 7,4 opløsning med 1% Triton X-100 (5 minutter, 3 gange). </li><li> Tilsæt sekundært antistof fortyndet i blokerende / permeabiliseringsopløsning i 1 time i mørke ved stuetemperatur. </li><li> Vask med H 2 O (5 min, 3 gange). </li><li> For at reducere baggrundsfluorescens, nedsænk skiverne i Sudan Black arbejdsløsning i 10 minutter, i mørke og ved stuetemperatur. </li><li> Vask skiverne i H 2 O (5 min, 3 gange). </li><li> Monter skiverne ved hjælp af fluorescerende monteringsmedium med DAPI (0,5 μg / ml). </li><li> Opbevar skiverne ved 4 ° C og kontroller, at monteringsmediet er tørt, før du udfører fluorescerende billeddannelse. Se eksempelbilleder i figur 7 . </li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

<html> Betydning med hensyn til eksisterende metoder: I denne protokol beskrev vi en metode til at generere forskellige humaniserede mikromiljøer i mus og visualisere deres arkitektur via to-foton mikroskopi og histologi. De angivne repræsentative data viser gennemførligheden af ​​tilgangen ved anvendelse af forskellige stromaceller til manipulering af humaniserede væv. Protokollen har specifikke anvendelser til undersøgelsen af ​​humane hæmatopoietiske celler og næseafledte celler fra knoglemarv under normale og patologiske forhold. Disse applikationer indbefatter undersøgelsen af ​​klonal evolution, lægemiddel screening og krydsning mellem humane HSC&#39;er og stromale komponenter. I det fremvoksende område af vævsteknik er der blevet foreslået flere alternative tilgange. Tilnærmelser til noten omfatter udviklingen af ​​3D humaniserede BM strukturer in vitro 55 , 56 , 57 ,S = &quot;xref&quot;&gt; 58 , 59 , 60 , 61 , 62 , 63 og det ortopotopiske implantat af humaniserede BM-stilladser i mus 64 . Vores tilgang har den fordel at kombinere både kompleksiteten af in vivo- systemet med den let anatomiske tilgængelighed af det humaniserede vævstransplantat. Modifikationer og fejlfinding: En kilde til variabilitet i denne protokol kan findes i udvælgelsen af ​​celler, der anvendes til udsåning af stilladserne. I vores arbejde brugte vi BM-afledte hMSC&#39;er. Imidlertid kan mesenkymceller opnås fra flere væv, som kan vise særprægede egenskaber afhængigt af oprindelsen. Derfor kan anvendelsen af ​​hMSC&#39;er afledt fra forskellige organer overvejes. Imidlertid bør deres evne til at danne knoglevæv in vivo testes før anvendelse på denne sideRotokol. Denne protokol anvender en kommercielt tilgængelig human endothelcellekilde ( dvs. E4ORF1-transduceret HUVEC). For nylig er brugen af ​​organspecifikke endotelceller til forskellige formål blevet rapporteret 65 , 66 . Desuden kan anvendelsen af ​​primære hEC&#39;er afledt fra BM udgøre en interessant forbedring af protokollen. Derfor kan anvendelsen af ​​forskellige kilder til endotelceller producere forskellige in vivo- resultater. Vi brugte NSG-immunokompromitterede modtagermus til fordel for implantationen af ​​humaniserede stilladser og for at undgå vævsafvisning. Vi udelukker ikke muligheden for at anvende denne protokol til at konstruere ektopiske knoglemarvvæv i andre musestammer. Faktisk kan rhBMP-2 inducere knogledannelse i forskellige pattedyrsmodeller 47 , 48 , 49 , 50 <sup&gt;, 52 . Forskelle i cellelevedygtighed og langtidstransplantation forventes imidlertid at blive observeret ved anvendelse af forskellige stammer / modeller. Timingen af ​​stilladsgenvinding kan også være fleksibel, afhængigt af det endelige formål med eksperimentet. I den præsenterede protokol genvinder vi prøver pr. 8-12 uger efter implantation for at vurdere langsigtet hæmatopoietisk engraftment. For at studere tidlige trin i den humane BM nicheformation ( fx osteokondralvævdannelse 47 eller vaskulær udvikling) kan forskellige tidspunkter vælges. Den levende billedteknik, vi beskrev i denne protokol, er angivet til kortvarig billeddannelse af eksplantater. Anvendelsen af ​​et ækvilibreret kammer til opretholdelse af fysiologisk temperatur, iltspænding og CO 2 -koncentration bør overvejes i tilfælde af langvarig billeddannelse, såsom at studere motilitetsadfærd. Kritisk stEps i protokollen: Blandt udfordringerne relateret til protokollen vil vi fremhæve de tekniske færdigheder, der kræves for nogle trin. Mesenkymale og endotelceller bør anvendes ved lavcellepassagetal; Ellers vil de ikke være i stand til at understøtte humant hæmatopoietisk cellegradering in vivo eller til at deltage i de novo vaskulatur og knogledannelse in vivo . Vi anbefaler brug af hMSC&#39;er og hEC&#39;er i passager 1 - 5. Stilladsforberedelse og cellesædningstrin kræver grundlæggende cellekulturevner og kendskab til egenskaberne hos de specifikke celler, der anvendes i proceduren. Operationsprotokollen er ret ligetil, men kræver nogle øvelser. Vedligeholdelse af et aseptisk miljø for at undgå forurening af de implanterede stilladser i immunodeficiente mus er afgørende for at sikre eksperimentets succes. Prøveeksplanter og levende billeddannelse kræver kirurgisk praksis (især til brug af microdrill) og viden omMikroskop system. Endelig kræver prøvebehandling og histologi grundlæggende kendskab til de teknikker, der skal anvendes. Begrænsninger af teknikken: Den tilgang, vi beskriver giver mulighed for visualisering af levende humane hæmatopoietiske celler, der spiser et humaniseret knoglemarvsmiljømiljø, hvor humane endotelceller danner vaskulære strukturer og mesenkymceller, der danner knoglemarv / knoglemarvplads. Da vævet dannes in vivo , vil den endelige konstruerede stillads stadig være kimær (human og murin). Dette problem bør tages i betragtning, da det kimære væv måske ikke fuldt ud efterligner humant knoglemarvskompleksitet og miljø. Stilladserne implanterede har en begrænset størrelse (vi forsøgte maksimalt 6,6 x 7,5 x 7 mm), og de kan derfor være vært for et begrænset antal celler til xenotransplantation. Det absolutte antal genvundne celler vil også være begrænset; Således skal antallet af implanterede stilladserBeregnes som en funktion af antallet af celler, der kræves til eksperimentet. Den billeddannelsesapplikation, vi beskrev, er særlig nyttig til observation af store områder af levende væv i dybder på 150-200 μm fra overfladen uden at forstyrre arkitekturen og beskadige cellerne. Derfor tillader det ikke visualisering af hele stilladset. Hvis en fuldstændig scanning af vævet er påkrævet, ville standard immunofluorescensfremgangsmåder være mere passende. Fremtidige applikationer: Den fremtidige retning af denne bioengineerede model ville være at øge kompleksiteten af ​​de humane komponenter i vævet. Kendskabet til og karakteriseringen af ​​den humane BM niche har udviklet sig i de seneste år 67 , og den beskrevne protokol kan være en interessant platform til at studere funktionen af ​​disse nye cellulære komponenter og opløselige faktorer, såvel som deres rolle i at støtte normal / malignAnt HSCs. Desuden giver billedteknikken potentialet til intravital billeddannelse af stilladserne i longitudinale undersøgelser, hvilket ville kræve tekniske forbedringer ved billeddannelsen af ​​stilladserne i levende bedøvede mus med genopretning efter kirurgi. Denne tilgang ville kræve yderligere skridt og er i øjeblikket under undersøgelse i laboratoriet.

Cell-skæbnebeslutninger observeret i stamcellekamre er tæt reguleret af både indre og ekstrinsiske faktorer. Især er det nu almindeligt anerkendt, at BM mikromiljøet spiller en afgørende rolle i styringen af ​​omskifteren i HSCs fra en hvilende til en aktiv tilstand, såvel som i deres selvfornyelses- eller differentierings skæbnebeslutning 1 . Endvidere viser nylige resultater, at hæmatologiske maligniteter påvirker BM-mikromiljøets funktion og peger på eksistensen af ​​aktiv kryds mellem de to rum 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . På trods af de seneste fremskridt er der fortsat mange vigtige spørgsmål om, hvordan aktiviteten af ​​specifikke BM-niche-komponenter bidrager til HSC-adfærd og malign transformation. BM mikromiljøet er meget heterogent<html> Enous og kompleks blanding af mange forskellige celletyper, hver med specialiserede funktioner. Den rigelige endoteliale (EC) og vaskulære komponent regulerer næringsstof- og metabolittenes omsætning, indgangen og udgangen af ​​forskellige celler til og fra BM og flere HSC-funktioner 7 , 8 . Mesenkymale stromaceller (MSC&#39;er), en heterogen population af udifferentierede stamceller og forfædre begået gennem tre forskellige linjer ( dvs. osteogen, chondrogen, en adipogen) er en anden grundlæggende komponent i BM nicheen. Disse MSC&#39;er lokaliseres både i centrale områder af BM og i nærheden af ​​endosteal regionen. De kan være forbundet med vaskulære strukturer og er impliceret i reguleringen af ​​HSC-funktion 9 , 10 , 11 , 12 , 13 ,&quot;&gt; 14 , 15 . Mange rapporter tyder på, at HSC&#39;er bor på forskellige bestemte steder inden for margenen, og at deres funktion kan afhænge af deres præcise lokalisering. Det meste af den nuværende viden om HSCs og deres interaktion med BM mikromiljø stammer fra murine studier 1 . Anvendelsen af ​​xenograft-modeller har udvidet denne viden til humane normale og ondartede HSC&#39;er, engrafting inden for murine BM af immunodeficiente mus 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . Selv om dette repræsenterer en gyldig model, frembyder den stadig mange udfordringer, såsom behovet for at betinge modtagermusen i de fleste tilfælde for at tillade humant HSC-homing og engraftment eller cross-species barrieren og dens dårligt forstået indflydelse på cellecelleinteraktioner og funktioner. Anvendelsen af ​​neutraliserende antistoffer og genetisk modificerede mus sammen med xenotransplantation har været medvirkende til at fremhæve den komplekse dialog, som menneskelige HSC&#39;er etablerer med deres mikro-miljøer. Introduktionen og udviklingen af ​​intravital to-foton-konfokalmikroskopi har flyttet disse undersøgelser et skridt fremad, hvilket giver mulighed for direkte, høj opløsning og dynamisk billeddannelse af knoglemarv 19 , 20 , 21 , 22 og giver et stærkt værktøj til funktionelle Karakterisering af BM mikromiljøet og dets rolle i regulering af HSC-funktionen. For at omgå nogle af de problemer, der opstår i klassiske xenotransplantationsmodeller, er begrebet engineering en humaniseret BM struktur blevet fremhævet. Sammenlægning af biomaterialer og celleimplantationskoncepter har rapporter vist muligheden for at efterligne den humane knoglemPil mikromiljø i heterotopområderne 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . Dette åbner mulighed for at anvende bioengineering i musemodeller til at studere human normal og malign hæmatopoiesis 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , tumorigenese og metastase 40 , 41 , 42 , 43 , 44 . Baseret på tidligere erfaringer inden for knoglevævsteknik og in vivo- billeddannelse 19 , 22 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50 , 51 , 52 beskriver vi en protokol til bioengineer og levende image-organotype humane BM-væv. Disse strukturer stammer fra implantationen af ​​humane BM-afledte stromaceller i kollagenbaserede stilladser subkutant podet i immunodeficiente mus. I en tidligere rapport viste vi, at menneskelige MSC&#39;er sikrer dannelsen af ​​et humant mikromiljø, der er tilstrækkeligt til engraftment af humane hæmatopoietiske celler 45 . Herudover beskriver vi, hvordan co-implantering af anden human BM-cellulær komponentS, såsom humane endotelceller (hEC) og / eller cytokiner, der er vigtige for knogledannelse ( f.eks. HBMP2), samarbejder med hMSC&#39;er for at generere forskellige humaniserede mikromiljøer, som kan levendegøres in situ .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1378">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Ficoll-Paque</td>
			<td style="width:277px;">Ge Healthcare</td>
			<td style="width:229px;">17-1440-03</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Cd34 positive selection Kit</td>
			<td style="width:277px;">Stemcell</td>
			<td style="width:229px;">18056</td>
			<td style="width:480px;">Store a 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Magnet</td>
			<td style="width:277px;">Stemcell</td>
			<td style="width:229px;">18000</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Anti-human CD3 antibody, clone OKT-3</td>
			<td style="width:277px;">Bioxcell</td>
			<td style="width:229px;">BE0001-2</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4&#176;C. Used for T cell depletion in primary AML samples.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:392px;">Cytokines (IL3, G-CSF, and TPO)</td>
			<td style="width:277px;">PeproTech</td>
			<td style="width:229px;">200-03, 300-23 and 300-18</td>
			<td style="width:480px;">For doing the stock: Dilute each one of the cytokines in 100&#956;L of water and mix them. Add 200&#956;L, do alicuots of 45&#956;L and Store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">DMSO</td>
			<td style="width:277px;">Sigma</td>
			<td style="width:229px;">D4540</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:392px;">FBS</td>
			<td style="width:277px;">Life technologies</td>
			<td style="width:229px;">10270106</td>
			<td style="width:480px;">Heat-inactivate at 56&#176;C during 30 minutes, do aliquots and freeze down. Warm in 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">MEM-&#945;</td>
			<td style="width:277px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:229px;">32571-028</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4&#176;C. Warm in 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Myelocult H5100</td>
			<td style="width:277px;">corning</td>
			<td style="width:229px;">5100</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4&#176;C. Warm in 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">199</td>
			<td style="width:277px;">Gibco</td>
			<td style="width:229px;">41150-020</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4&#176;C. Warm in 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:392px;">hMSC-FBS, Heat-inactivated</td>
			<td style="width:277px;">Gibco</td>
			<td style="width:229px;">12662-029</td>
			<td style="width:480px;">Store at -20&#176;C. Warm in 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">P/S</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:229px;">P0781</td>
			<td style="width:480px;">Store at -20&#176;C. Warm in 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">ECGS</td>
			<td style="width:277px;">Millipore</td>
			<td style="width:229px;">02-102</td>
			<td style="width:480px;">Dilute in culture media and use 0.22 mm filter.</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:392px;">HEPES</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:229px;">S1558-50ML</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Heparin</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:229px;">H3149</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Glutamine</td>
			<td style="width:277px;">Gibco</td>
			<td style="width:229px;">25030</td>
			<td style="width:480px;">Store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Collagen 1 coated cell culture plate</td>
			<td style="width:277px;">corning</td>
			<td style="width:229px;">354505</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:277px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:229px;">25200056</td>
			<td style="width:480px;">Store at -20&#176;C. Warm in 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:392px;">hMSC</td>
			<td style="width:277px;">Lonza</td>
			<td style="width:229px;">PT-2501</td>
			<td style="width:480px;">Alternatively, hMSCs we also kindly provided by Dr. Dosquet (University Paris Diderot, Paris) from human bone marrow obtained during orthopaedic surgery under ethical approval 10-038 from IRB00006477.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">VeraVec HUVEC endothelial cells</td>
			<td style="width:277px;">Angiocrine bioscience</td>
			<td style="width:229px;">hVera101</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:392px;">Human hematopoietic cells</td>
			<td style="width:277px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:480px;">Umbilical Cord blood or primary Acute Myeloid Leukemia (AML) samples were obtained from the Royal London Hospital (London, UK) after informed consent and protocol of use was approved by the East London Ethical Committee and carried out in accordance with the Declaration of Helsinki.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:392px;">Gelfoam, Size 12-7mm</td>
			<td style="width:277px;">Pfizer</td>
			<td style="width:229px;">00009-0315-08</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">PBS</td>
			<td style="width:277px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:229px;">10010023</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Surgical material</td>
			<td style="width:277px;">Multiple</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:480px;">Sterile forceps, tweezers and sharp scissors.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Sterile tissues</td>
			<td style="width:277px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:480px;">Heat-sterilize paper tissues.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">1 ml Syringe with needle of 25G</td>
			<td style="width:277px;">Terumo</td>
			<td style="width:229px;">SS+01H25161</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:392px;">Ultra Low Attachment Multiple Well Plates</td>
			<td style="width:277px;">Corning</td>
			<td style="width:229px;">3473 or 3471</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">BMP2</td>
			<td style="width:277px;">Noricum</td>
			<td style="width:229px;">rhBMP-2</td>
			<td style="width:480px;">Dilute at 5 mg/ml in acetic acid 50 mM and store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:392px;">Thrombin</td>
			<td style="width:277px;">Sigma</td>
			<td style="width:229px;">T9010</td>
			<td style="width:480px;">Dilute in CaCl2 2%, 500 mL per vial, and store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:392px;">Fibrinogen</td>
			<td style="width:277px;">Sigma</td>
			<td style="width:229px;">F3879</td>
			<td style="width:480px;">Dilute at 4 mg/100 mL in PBS. Store at -20C. Warm before use.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:392px;">Tissue-culture dishes 35 mm x 10 mm</td>
			<td style="width:277px;">Falcon</td>
			<td style="width:229px;">353001</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:392px;">U-Botton 96 well plate</td>
			<td style="width:277px;">Falcon</td>
			<td style="width:229px;">353077</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:392px;">NSG mice</td>
			<td style="width:277px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:229px;">5557</td>
			<td style="width:480px;">NSG mice were a kind gift from Dr Leonard Shultz (The Jackson Laboratory).</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Chlorhexidine</td>
			<td style="width:277px;">G9</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:480px;">Dilute 1:10 before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Carprofen</td>
			<td style="width:277px;">Pfizer</td>
			<td style="width:229px;">Rimadyl</td>
			<td style="width:480px;">5 mg/g of mouse</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Buprenorphine</td>
			<td style="width:277px;">Alstoe</td>
			<td style="width:229px;">Vetergesic</td>
			<td style="width:480px;">0.1 mg/g of mouse body weight</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:277px;">Abbott</td>
			<td style="width:229px;">B506</td>
			<td style="width:480px;">Induction of anaesthesia 2%, maintenance 1%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Trimmer</td>
			<td style="width:277px;">Wella</td>
			<td style="width:229px;">Contura HS61</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Surgical glue</td>
			<td style="width:277px;">3M</td>
			<td style="width:229px;">Vetbond</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">carbomer (polyacrylic acid)&#160; as Ophthalmic gel</td>
			<td style="width:277px;">Novartis</td>
			<td style="width:229px;">Viscotears Liquid Gel</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:392px;">Human Normal Immunoglobulin</td>
			<td style="width:277px;">Gammaplex</td>
			<td style="width:229px;">10g vial</td>
			<td style="width:480px;">100 ml/mouse intravenously, 30 min before infusion of specific antibody.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:392px;">NT-QTracker</td>
			<td style="width:277px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:229px;">Q21021MP</td>
			<td style="width:480px;">Vessel-pooling agent. Administrate 15 ml/mouse intravenously 5 min before imaging.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">AF488-hCD45</td>
			<td style="width:277px;">Biolegend</td>
			<td style="width:229px;">304017</td>
			<td style="width:480px;">100 ml/mouse intravenously, 30 min before imaging.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">FITC-hCD31</td>
			<td style="width:277px;">BD Pharmigen</td>
			<td style="width:229px;">555445</td>
			<td style="width:480px;">100 ml/mouse intravenously, 30 min before imaging.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Super glue</td>
			<td style="width:277px;">Loctite&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Super Glue</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Micro-Drill Kit</td>
			<td style="width:277px;">IDEAL - Fisher Scientific</td>
			<td style="width:229px;">NC9010016</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microsurgical microscope</td>
			<td style="width:277px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:480px;">No specific brand/company is adviced.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:392px;">LSM 710 NLO</td>
			<td style="width:277px;">Zeiss</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:480px;">Upright confocal microscope with motorized stage, two-photon laser and 20x 1.0 NA water immersion lens. Alternatively, a microscope with similar specifications could be used.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:392px;">MaiTai &#8220;High Performance&#8221; fully automated 1-box 517 mode-locked Ti:Sapphire laser with DeepSee dispersion compensation</td>
			<td style="width:277px;">&#160;Spectra-Physics</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%&#160;</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:229px;">HT501128</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Ethanol</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:229px;">32294</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Osteosoft</td>
			<td style="width:277px;">Millipore</td>
			<td style="width:229px;">1.01728.1000</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Polysine slices</td>
			<td style="width:277px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:229px;">J2800AMNZ</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:392px;">Antigen unmasking solution</td>
			<td style="width:277px;">Vector</td>
			<td style="width:229px;">H-3300</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C. Dilute 1:100 in H2O for working solution.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Triton 100x</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:229px;">T9284</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:229px;">A96470</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Normal Goat serum (NGS)</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:229px;">G9023</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Endomucin Antibody</td>
			<td style="width:277px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:229px;">sc-65495</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">hVimentin antibody</td>
			<td style="width:277px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:229px;">sc-6260</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">hCD31 antibody</td>
			<td style="width:277px;">DAKO</td>
			<td style="width:229px;">M0823</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">hCD45 antibody</td>
			<td style="width:277px;">DAKO</td>
			<td style="width:229px;">M0701</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">ADRP (Perilipin2)</td>
			<td style="width:277px;">antibodies-online</td>
			<td style="width:229px;">ABIN283918</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="59" style="height:59px;width:392px;">Goat anti mouse secondary antibodies</td>
			<td style="width:277px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:229px;">A11029 or A11005</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:392px;">Goat anti Rabbit secondary antibodies</td>
			<td style="width:277px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:229px;">A11037 or A11008</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Goat anti Rat secondary antibodies</td>
			<td style="width:277px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:229px;">A11007 or A21247</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:392px;">Sudan Black</td>
			<td style="width:277px;">Sigma</td>
			<td style="width:229px;">S2380</td>
			<td style="width:480px;">Prepare a stock of 1% sudan black in ethanol 70%. Store at RT. Prepare working solution of 0.1% sudan black in ethanol 70% and filter using filter-paper before use.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:392px;">DAPI</td>
			<td style="width:277px;">Sigma</td>
			<td style="width:229px;">D8417</td>
			<td style="width:480px;">Prepare stock in H20 at 100 mg/mg. Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Fluorescent mounting media</td>
			<td style="width:277px;">Dako</td>
			<td style="width:229px;">S3023</td>
			<td style="width:480px;">Add DAPI before use (1:400 from DAPI stock).</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Cover glass</td>
			<td style="width:277px;">VWR</td>
			<td style="width:229px;">631-0147</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioengineering of humanized bone marrow microenvironments in mouse and their visualization by live imaging

Humane hæmatopoietiske stamceller (HSCs) befinder sig i knoglemarv (BM) niche, et indviklet multifaktorialt netværk af komponenter, der producerer cytokiner, vækstfaktorer og ekstracellulær matrix. HSCs evne til at forblive hvilende, selvfornyende eller differentiere og erhverve mutationer og blive maligne afhænger af de komplekse interaktioner, de etablerer med forskellige stromale komponenter. For at observere crosstalk mellem humane HSC&#39;er og den humane BM niche i fysiologiske og patologiske forhold, designet vi en protokol til ektopisk model og billedet en humaniseret BM niche i immunodeficiente mus. Vi viser, at brugen af ​​forskellige cellulære komponenter muliggør dannelsen af ​​humaniserede strukturer og muligheden for at opretholde langvarig humant hæmatopoietisk engraftment. Ved brug af to-foton mikroskopi kan vi live-image disse strukturer in situ ved single-cell-opløsningen, hvilket giver et kraftigt nyt værktøj til den funktionelle karakterisering af den humane BM mMikrovirksomhed og dets rolle i reguleringen af ​​normal og malign hæmatopoiesis.

I figur 1 er repræsentative billeder af stilladscellens såning og implantationsprocesser vist. I figur 1C bemærkes, at celler injiceres direkte i stilladset. I figur 1G bemærkes, at der er lavet et snit på bagsiden af ​​musen, hvor den subkutane lomme opstår, og stilladset er implanteret. Figur 2 viser brutto morfologi af forskellige stilladser implanteret i NSG-mus og hentet efter 8 uger. Bemærk den lille vaskularisering i hMSC-podede stilladser ( Figur 2A ). Samsædningen af ​​humane EC&#39;er med hMSC&#39;er i stilladset muliggør dannelsen af ​​mere relevant vaskulatur i stilladser ( figur 2B ). Endelig inducerer tilstedeværelsen af ​​rhBMP-2 knogledannelse. De hentede stilladser er større i dette tilfælde, og de udgøres afKnoglelignende hårdt væv. Figur 3 viser konfigurationen af ​​kanalkonfigurationen på mikroskopet til live-imaging med NDD (detaljer i figurlegenden). Figur 4 og Video 1 viser humane hæmatopoietiske celler i hMSC-coatede stilladser. Stilladser blev eksplanteret 8 uger efter implantation og efter intravenøs inokulation af AF488-hCD45 antistof og 655-VPA. Denne procedure muliggør visualisering af implanterede humane hæmatopoietiske celler og den vaskulære struktur ved to-foton-konfokal mikroskopi. I dette tilfælde viser billederne blodkar (655-VPA) i stilladser og den langsigtede engraftment af humane hæmatopoietiske celler (AF488-hCD45) i stilladsparenchymen. Figur 5 og Video 2 svarer til menneskelige stilladser podet med hEC&#39;er og hMSC&#39;er. 8 uger efter operationen blev stilladser eksplanteret efter intravenOus inokulation af FITC-hCD31 antistof og 655-VPA, og billeder blev erhvervet med et to-foton-konfokalt mikroskop som tidligere nævnt. Billeder viser deltagelse af hEC&#39;er i skibsdannelse i stilladset, hvilket resulterer i en murin-human kimær vaskulatur. Figur 6A viser repræsentative data af fremgangsmåden anvendt til at stimulere knogledannelse i MSC-stilladser. I lighed med tidligere figurer, 8 uger efter implantering, blev den intravenøse inokulering af 655-VPA udført, stilladser blev hentet, og billeder blev erhvervet med tofoton-konfokalmikroskopi. RhBMP-2-stimulerede stilladser fremkalder dannelsen af ​​knoglevæv, hvilket kunne visualiseres på grund af SHG (cyan farve i billederne) tilvejebragt af calcium i benet. De tilvejebragte billeder viser også dannelsen af ​​hulrum og vaskulariseret endostale væv, som meget ligner BM endostealvævet. I figur 6B </sTrong&gt; og video 3 blev hEC&#39;er co-implanteret med hMSC&#39;er. Stilladser blev hentet efter intravenøs inokulation af FITC-hCD31-antistof og 655-VPA, og to-foton-konfokale mikroskopi-billeder viser deltagelse af hEC&#39;er i neovaskularisering i et knogledannende stillads. Figur 7 viser repræsentative billeder af histologi, en procedure udført for at bekræfte tidligere beskrevne resultater. Immunfluorescerende billeder viser musekirurgi, hEC&#39;er, hMSC&#39;er og langvarige indviklede humane hæmatopoietiske celler i stilladsstrukturerne. Stilladser hentet fra mus blev fikset og anvendt til immunofluorescens. I rhBMP-2-bærerbendannende stilladser ( Figur 7D- F ) bemærkes vævets morfologi, der ligner modent knoglemarv med fedtvæv. I denne knogleformende stillads viser vi, at hMSC&#39;er er fibroblaster, hvilket vil indikere tHat de bidrager til nyligt dannet væv som stromaceller. Vi viser også humant adipocytmarkørekspression, hvilket vil indikere, at hMSC&#39;er også bidrager til dannelse af fedtvæv. <img alt="figur 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig1.jpg" /> Figur 1. Repræsentative billeder af cellesædnings- og implantationsprocesserne. A) Initial stillads og dens skæremetode ved hjælp af en skalpel. B) 24 stykker opnået fra den indledende stillads. C) Stillads cellesædsmetode ved hjælp af en sprøjte. D) Cell-podede stilladser med dyrkningsmedium, klar til at blive implanteret. EF) Specifikke trin for benformende stilladser: E) Stillads overføres til en 96-brønd, u-bundplade og F) repræsentativt billede af metoden anvendt til at tilføje rhBMP2, thrombin og fibrinogen til stilladset. GJ) Surgi<html> Cal implantation procedure under generel anæstesi: G) sår skabt i huden og stilladsimplantation, H) implanteringsmetode og IJ) sårlukningsprocedure ved anvendelse af kirurgisk lim. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a> <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig2.jpg" /> Figur 2. Forskellige stilladser hentet fra mus. Repræsentative billeder af MSC stilladser (til venstre), MSC + EC stilladser (midterste) og MSC + EC + BMP stilladser (højre). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a> 4 / 55914fig3.jpg &quot;/&gt; Figur 3. Kanalkonfiguration. Mikroskopfilteropsætningen vises. A) Der er fire NDD detektormoduler: I det første modul er der to filterkasser; Det andet og tredje modul har hver filterkube hver; Og det sidste modul har ingen terning (ikke brugt). Det første fotomultiplikatorrør (PMT) er til den fjernrøde kanal (640 - 690 nm), der afspejler de lavere bølgelængder; De følgende er 380 - 485 nm, 500 - 550 nm og 555 - 625 nm (ordren er altid fra den nedre til den højere bølgelængde). B) Fluorofore-emissionerne detekterbare med ovennævnte konfigurationer (farvekodet). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a> <img alt="Figur 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig4.jpg" /> Figur 4. MSC stillads<html> S Tillade til dannelse af en niche for humane hæmatopoietiske celler. A) og B) 3D rekonstruktioner af Z-stabler taget efter eksplantering efter intravenøs inokulation med AF488-hCD45 (grøn) til mærkning af humane hæmatopoietiske celler og 655-VPA (magenta) m til mærkning af vaskulatur. Skalestænger repræsenterer 20 μm i A og B (øvre paneler) og 5 μm i B (nederste paneler). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a> <img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/55914/55914video1.jpg" /> Video 1. MSC stilladser tillader dannelse af en niche for humane hæmatopoietiske celler . 3D rekonstruktion af humane hæmatopoietiske celler (AF488-hCD45) associeret med vaskulaturen (655-VPA) i MSC-stilladset (kollagenstrukturer: SHG, cyan). Hver stak måler 140 x 140 μm.Ef = &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914video1.mov&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.) <img alt="Figur 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig5.jpg" /> Figur 5. Menneskelige EC&#39;er deltager i dannelsen af ​​humaniserede fartøjer i MSC-stilladser. 3D rekonstruktion af vaskulatur (655-VPA) foret med ECs af human oprindelse (FITC-hCD31) i MSC + EC stilladser. Skalestænger repræsenterer 20 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig5large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a> <img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/55914/55914video2.jpg" /> Video 2. Human ECs deltager i dannelsen af ​​humaniserede fartøjer i MSC stilladser. 3D rekonstruktion af human ECs (FITC-hCD31), der ligger på vaen<html> Sculature (655-VPA) i MSC + EC stilladser. Hver stak måler 240 x 240 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914video2.mov" target="_blank">Klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)</a> <img alt="Figur 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig6.jpg" /> Figur 6. rhBMP-2 Carrier Stilladser har benflader og humaniseret vaskulatur svarende til knoglemarven. A) 3D rekonstruktion af MSC + BMP stilladser, der viser dannelsen af ​​knogle strukturer (SHG-cyan) og vaskulatur (655-VPA). Skalestænger repræsenterer 100 μm (venstre), 70 μm (mellem) og 50 μm (højre). B) 3D rekonstruktion af MSC + EC + BMP stilladser, der viser humaniserede fartøjer (655-VPA) foret med human ECs (FITC-hCD31). Skalestænger repræsenterer 50 μm (venstre) og 30 μm (midten og højre).14 / 55914fig6large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Venligst klik her for at se en større version af denne figur. <img alt="Video 3" src="/files/ftp_upload/55914/55914video3.jpg" /> Video 3. rhBMP-2 Carrier Stilladser har benflader og humaniseret vaskulatur svarende til knoglemarven. 3D rekonstruktion af MSC + VERA + BMP stillads (ben: SHG; fartøjer: 655-VPA; human ECs: FITC-hCD31). Hver stak måler 600 x 600 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914video3.mov" target="_blank">Klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)</a> <img alt="Figur 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig7.jpg" /> Figur 7. Repræsentative billeder af immunfluorescens udført på faste stilladser. AF) Immunofluorescensundersøgelser udført for lokalisering af humane celler implanteret iN stilladser. AC) Stilladser implanteret med hEC&#39;er, hMSC&#39;er og hHSC&#39;er. DF) Benformede stilladser implanteret med hEC&#39;er, hMSC&#39;er og hHSC&#39;er. Farvekanalerne er som følger: AD) human EC (hCD31) og musvaskulær struktur (endomucin, ENDOM), BE) hMSCs (hVimentin, hVIM) og muscelleceller (endomucin, ENDOM), C) humane hæmatopoietiske celler (hCD45) Og musvaskulatur (endomucin, ENDOM) og F) humant adipodedifferentieringsrelateret protein (hADRP) og musvaskulatur (endomucin, ENDOM). Skalestænger repræsenterer 10 μm (A og C), 20 μm (B og E) og 40 (D og F) μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig7large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging at JoVE.com

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

En metode til at skabe og levende billede forskellige humaniserede knoglemarv niske i mus er præsenteret. Baseret på den støttende niche, der er skabt af humane mesenkymceller, frembringer tilsætningen af ​​humane endotelceller dannelsen af ​​humane fartøjer, mens tilsætningen af ​​rhBMP-2 inducerer dannelsen af ​​humant mu kimært modent knoglevæv.

Bioengineering af humaniserede knoglemarv mikro miljøer i mus og deres visualisering ved Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix

Isolering af humane mesenchymale stamceller, og deres dyrkning på det porøse Bone Matrix

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific ...

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells (MPCs) from Human Bone Marrow

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells MPCs from Human Bone Marrow

Isolering Mesangiogenic progenitorceller (MPCS) fra human knoglemarv

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel ...

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

In vitro Differentiering af Ældre -myofibre til Live Imaging

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Lev Konfokal Imaging af Udvikling Arabidopsis Blomster

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Identifikation af erythromyeloidprogenitorer og deres afkom i musembryoen ved flowcytometri

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule dyrkning for Live-celle Imaging af Zygote polarisering og Embryo mønstre i Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

En RANKL-baserede osteoklast kultur Assay af musen knoglemarven til at undersøge rollen, som mTORC1 i osteoklast dannelse

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Isolation, kultur og differentiering af knoglemarven stromale celler og osteoklast ophav fra mus

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Levende celle billeddannelse af kromosom Segregation under mitosen

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...