Name: bioengineering of humanized bone marrow microenvironments in mouse and their visualization by live imaging
Uploaded: 2017-08-01T15:00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging at JoVE.com

Vi takker de ansatte i kjernefasilitetene ved Francis Crick Institute (Biologisk forskningsfasilitet, In Vivo Imaging and Experimental Histopathology) og Yolanda Saavedra-Torres og Mercedes Sanchez-Garzon, dyrene hos Crick og LRI, for deres verdifulle hjelp. Vi er takknemlige for Dr. W. Gray for kritisk å lese manuskriptet. DP ble støttet av et ikke-klinisk forskningsmiljø fra EHA. Dette arbeidet ble støttet av The Francis Crick Institute, som mottar kjernefinansiering fra Cancer Research UK (FC001045), UK Medical Research Council (FC001045), og Welcome Trust (FC001045).

Alle dyreforsøk ble utført under PPL 70/8904, godkjent av Det britiske hjemmekontor og i samsvar med Cancer Research UK retningslinjer. Bruken av humant navlestrengblod (UCB) og primær humant akutt myeloide leukemi (AML) -prøver ble godkjent av den østlige etiske komiteen etter å ha fått samtykke og ble utført i samsvar med Helsinki-erklæringen. 1. Bioengineering kollagenbaserte stillas med humane hematopoietiske og stromale celler MERK: Hele protokollen skal utføres i sterile forhold og med sterilt materiale. Cellkulturmedium 1 tilsvarer hMSC-medium (MEM-a, P / S og 10% hMSC-FBS); Cellekulturmedium 2 tilsvarer EC-medium (M199, 20% FBS, P / S, 10 mM HEPES, 50 ug / ml heparin, 2 mM glutamin og 50 ug / mL ECGS) og cellekulturmedium 3 tilsvarer hematopoietisk cellemedium (H5100 Og P / S). <ol><li> Klargjør navlestrengsblod mOnonukleære celler (CB-MNC&#39;er) eller primære AML (beinmarg eller perifert blod MNCs) ved bruk av en Ficoll-Paque densitetsgradient i henhold til veletablerte protokoller 53 . <ol><li> For AML, deplete T-cellene ved hjelp av OKT.3-antistoff. Inkubér 4 μg OKT.3 per 1 x 10 6 AML MNCs i 30 minutter ved romtemperatur før vasking av cellene i PBS. Hvis nødvendig, krypreserve MNCene i FBS med 10% DMSO ved 2 x 10 8 celler per ml. </li></ol></li><li> Forbered hMSC (kulturmedium 1) og EC (kulturmedium 2) cellekulturer. Plate hMSC-celler (se Materialetabell ) på vanlige cellekulturflaser i hMSC-medium. Plate ECs (se Materialetabell ) på kollagen 1-belagte overflater i EC-medium. </li><li> Ved 85-90% celleforløp fjerner mediet, vaskes to ganger med PBS, og tilsetter trypsin-EDTA-løsning (20 μL per cm 2 ). <ol><li> Etter 5 minutter, kontroller at cellene er frittliggende. Gjenopprett cellene ved å fortynne 1:3 med cellekulturmedium. Sentrifuger ved 300 xg i 5 minutter og resuspender i tilsvarende medium for hver celletype og teller cellene ved å bruke et Neubauer-kammer. </li><li> Bruk celler ved 2 x 10 6 - 10 7 celler per ml. Hvis begge celletyper skal brukes sammen, blandes hMSC- og EC-suspensjonene i et 1: 1-forhold. </li></ol></li><li> Overfør cellesuspensjonen til en insulin sprøyte. </li><li> Ved hjelp av en skalpell, kutt den steriliserte gelatinsvampen ( f.eks. Gelfoam) første stillas (20 mm x 60 mm x 7 mm) i 24 stykker av tilsvarende størrelse (6,6 mm x 7,5 mm x 7 mm, figur 1A og B ). </li><li> Rekonstituer gelatinestallene ved nedsenkning i PBS (5 min). </li><li> En etter en, forsiktig sette stillasene på et sterilt vev for å fjerne overflødig PBS. Overfør stillasene til en brønn på en brønn med 24 brønner (ultralag festeplate) og bruk sprøyten til å injisere 50 μL inneholdende 10 5 - 10 6 celler (hMSC alEn eller i kombinasjon med hEC; Figur 1C ). </li><li> Gjenta trinn 1.7 med hver stillas til alle nødvendige stillasene er frøet med stromalceller. </li><li> Inkuber i 1 time i en cellekultur-inkubator (37 ° C og CO 2 5%). </li><li> Fyll hver brønn med 3 ml cellekulturmedium 1 ( Figur 1D ) og returner stillasene til en cellekultur-inkubator (37 ° C og CO 2 5%) for inkubasjon over natten. Bruk cellekulturmedium 2 hvis ECs brukes i stillasene. </li><li> Tine CB-MNCs og isolere CD34 + -celler fra dem etter en passende CD34 + -seksjonskontekst. Opphev de valgte CD34 + -cellene i medium 3 og telle dem i et Neubauer-kammer. MERK: Her celler ble anvendt ved en konsentrasjon på 2 x 10 6 celler pr ml. <ol><li> Hvis AML-pasientavledede primære prøver brukes, tine cellene, fortynn dem 1:10 i FBS, sentrifuger dem i 5 minutter ved 300Xg, resuspender cellene i PBS-2% FBS, tilsatt anti-humant CD3-antistoff (2 - 4 μg pr. 10 6 celler) og inkuber ved romtemperatur i 30 minutter. Sentrifuger i 5 minutter ved 300 xg og resuspenderes i hematopoietisk cellemedium suppleret med cytokiner (20 ng / ml granulocyt-kolonistimulerende faktor (G-CSF), 20 ng / ml IL-3 og 20 ng / ml trombopoietin (TPO)) . </li></ol></li><li> Gjenta trinn 1.7 - 1.9, men i dette tilfellet frø 1 x 10 5 humane hematopoietiske celler i stedet for stromale komponenter, som ovenfor. <ol><li> Fyll brønnen med 3 ml cellekulturmedium 3 ( Figur 1D ) og returner stillasene til en cellekulturinkubator (37 ° C og CO 2 5%) for inkubasjon over natten. Bruk en 1: 1 blanding av cellekulturmedier 2 og 3 Hvis ECs brukes i stillasene. </li></ol></li><li> For bare rekombinant humant benmorfogenetisk protein-2 (rhBMP-2) bærer stillasene forsiktig sette stillasene en etter en på et sterilt vev for å fjerne overflødig PBS. Overfør stillasene til en brønn på en bunnplate med 96 mm brønn ( Figur 1E ) og legg til 5 μL rhBMP-2, som dekker plassen grundig. <ol><li> Tilsett 20 μl trombin etterfulgt av 20 μl fibrinogen, og dekk grundig hver dag ( Figur 1F ). Gjenta prosedyren for hver stillas til alle nødvendige stillasene er behandlet og deretter inkuber i 5 - 10 min ved 37 ° C. Sjekk om koagulasjonen har blitt vellykket. </li></ol></li></ol> 2. Kirurgisk implantering av bioenginerte stillas MERK: Her ble enten mannlige eller kvinnelige, 6- til 12 uker gamle NSG-mus brukt. Da dyrene er immundefekte, bør alle prosedyrer gjøres i sterile forhold. Trinn 2.10 - 2.13 er relatert til overlevelsesstrategier og postkirurgisk behandling. <ol><li> 60 - 120 minutter før kirurgi, administrerer smertemedisinering subkutant (karprofen, 5 mg / kg kroppsvekt / mus).</li><li> Indusere anestesi i et kammer med 0,5% isofluran og 2 l / min O 2. Mus bør overvåkes kontinuerlig under prosedyren. Overfør dyret til kirurgisk område i utsatt posisjon for å få enkel tilgang til ryggen. Hold dyret under anestesi ved hjelp av en nesekegle som gir 1,5% isofluran og 2 L / min O 2 . Hold musen under anestesi under den kirurgiske prosedyren og kontroller ofte dyrtilstanden. </li><li> Mens det er under anestesi, bruk oftalmisk gel i øynene til musen for å forhindre tørrhet, og hold musen ved 37 ° C. </li><li> Barber kirurgiområdet på baksiden av musen med en elektrisk trimmer. For å sterilisere huden, dip en bomullsspiss i fortynnet clorexidin (fortynnet 1:10 i PBS) og bruk dette tipset for å rengjøre hudoverflaten. Gjenta denne prosedyren to ganger. </li><li> Ved hjelp av sterile pincett og en skalpell (eller saks), gjør du en 0,5 til 0,7 cm fremre og bakre full snitt av huden. Bruk pinnene satt innUnder subkutan vev for å lage en lomme. </li><li> Sett stillaset subkutant, sørg for at det er plassert dypt inne i lommen ( Figur 1G og H ). Lukk snittet med kirurgisk lim ( figur 1I og J ). </li><li> For å behandle postkirurgisk smerte, administrere subkutant buprenorfin (0,1 mg / kg kroppsvekt). </li><li> Under gjenopprettingen plasseres dyret på sin side i en forvarmet bur og overvåker gjenoppretting til normal oppførsel blir observert. </li><li> Fortynn smerte medisiner i vann (carprofen, 0,1 mg / ml vann) og gi det til dyr som drikkevann i 4 dager etter operasjonen. </li><li> Sjekk dyret og såret ofte i 48-timers etter-kirurgisk periode for mulige bivirkninger. </li></ol> 3. Musebehandlinger, eutanasi og prøvetaking for bildebehandling MERK: Analyse av stillasene utføres mellom8 og 24 uker etter implantasjon. <ol><li> 60 min før avbildning, hold den implanterte musen varm i en oppvarmingskasse ved 37 ° C og administrer 100 μL human immunoglobulin intravenøst ​​for å blokkere uspesifikke steder. </li><li> 30 min før avbildning, administrere intravenøst ​​10 μg (per mus) av spesifikke antistoffer for å merke celler av interesse. </li><li> 5 min før avbildning, administrere intravenøst ​​15 μl (fortynnet i 100 μl PBS) av 655 nm fluorfor-merket, karbonpulveringsmiddel (655-VPA) for å visualisere vaskulære strukturer. </li><li> Euthanize musen via cervikal dislokasjon. </li><li> Ved hjelp av skarpe saks, gjør du et langsgående hudinnsnitt på baksiden av musen, nær det originale implantasjonsstedet. </li><li> Ved hjelp av pincet og saks, skiller huden forsiktig fra den subkutane lommen hvor stillaset er blitt implantert. </li><li> Hold stillaset med pinsett og forsiktig ekspander det fra huden ved å kutte gjenværende membran aNd vev som omgir stillaset med saks. Se eksempler på stillasene som skal gjenvinnes i figur 2 . </li><li> Fest stillaset med hurtigvirkende lim til en bildeplate (en 35 mm x 10 mm petriskål) og fyll opp med saltoppløsning (PBS) ved romtemperatur. </li><li> For BMP stillasene, før du fyller platen med PBS, bruk en kirurgisk mikrodrill for å tynne beinoverflaten under et mikrokirurgisk mikroskop; Dette tillater fluoroforevisualisering og høyoppløselig bildeopptak. Bruk enten 1,2- eller 1,6 mm-burrene, avhengig av stillasets størrelse. MERK: Brukeren vil innse hvor mye å bore avhengig av benets tykkelse. Generelt, ettersom BMP-stillasene er vaskulariserte, vil beinet litt endre farge og bli mer rødt når nærmer seg riktig tykkelse for avbildning. </li><li> Plasser platen på scenen av konfokalmikroskopet. </li></ol> 4. Live-bildebehandling ved bruk av to-foton mikroskopopier MERK: Ved bruk av ikke-avkalkede detektorer (NDD), bruk alltid NDD-glidebryteren for avbildning for å lede fluorescensen til NDD. Mikroskopkonfigurasjonen er gitt i figur 3 . <ol><li> Slå på mikroskopet og datamaskinen, start programmet ved å klikke på &quot;Start system&quot;, og gå til &quot;Oppkjøp&quot; -modus. </li><li> Merk av i boksen &quot;Vis manuelle verktøy&quot;. I &quot;Laser&quot; -menyen slår du på &quot;to&quot; -fotonlaseren og la den varme opp og stabilisere seg. </li><li> I menyen &quot;Imaging Setup&quot; aktiverer du samtidig &quot;Channel Mode&quot; og &quot;Switch track every Frame.&quot; I &quot;Light Path&quot; -menyen, velg &quot;Non Descanned&quot; &quot;og&quot; Main Beam Splitter MBS 760+. &quot; Merk for å aktivere de fire NDDene og sett inn konfigurasjonen som vist på figur 3 . MERK: Med denne konfigurasjonen vil kollagenssignalet fra beinstrukturer (sekOnd harmonisk generasjon, SHG) oppsamles ved 380 - 485 nm, FITC-hCD31 + humane endotelceller og AF488-hCD45 + humane hematopoietiske celler ved 500-550 nm og 655-VPA ved 640-690 nm. </li><li> I &quot;Kanaler&quot; -menyen, still inn &quot;laserbølgelengden&quot; til 890 nm og strømmen til 50%. Sett &quot;Gain (Master)&quot; til 500-600, &quot;Digital Offset&quot; til 0, og &quot;Digital Gain&quot; til 15 for hver kanal. Juster disse verdiene når oppkjøpet har startet. </li><li> I &quot;Oppkjøpsmodus&quot; konfigurerer du de nødvendige parametrene for å oppnå høyoppløselige bilder uten å skade vevet og bleke fluorophorene. Still inn &quot;Skannemodus&quot; til &quot;Ramme&quot;, &quot;Rammeformat&quot; til &quot;x512 y512,&quot; Linjesteg &quot;til 1,&quot; Hastighet &quot;til 9,&quot; Gjennomsnittlig nummer &quot;til 8,&quot; Bitdybde &quot;til&quot; 8 Bit &quot; Modus &quot;til&quot; linje, &quot;&quot; retning &quot;til&quot; toveis, &quot;og&quot; metode &quot;til&quot; bety. &quot; <ol><li> Sett &quot;ZoOm &quot;til 1 for den første skanningen av bildet, og øk den hvis nødvendig for å fokusere på bestemte områder. </li></ol></li><li> Plasser platen som inneholder stillaset på mikroskopetrinnet under 20X, 1,0 NA vanndypingslinsen og senk linsen til den berører saltoppløsningen. Still fokuset på linsen på stillaset ved hjelp av mikroskopobjektene, ved hjelp av en lampe som lyskilde. </li><li> Aktiver &quot;Z-stack&quot; -menyen, velg &quot;Første / Siste&quot; -funksjonen, og sett inn ønsket intervall mellom to sub-sekvensielle skiver ( f.eks. 2-μm Z-stack). Hold intervallene konstant i Z-stabelen. </li><li> Velg &quot;Live&quot; for å vise en levende skanning av prøven og juster &quot;Digital Gain&quot; og &quot;Digital Offset&quot; for optimal eksponering. For å visualisere flere kanaler samtidig, velg &quot;Split&quot; -funksjonen. </li><li> I &quot;Stage&quot; -menyen, i &quot;Live&quot; -modus, skann bildet og &quot;Mark&quot; regionene i interEst (ROI), slik som plasseringen av humane hematopoietiske celler og vaskulære strukturer. Når skanningen av prøven er fullført, flytt til første avkastning for å starte avbildning. </li><li> I &quot;Live&quot; -modus, sett toppen og bunnen av 3D Z-stabelen rundt området av interesse ved å bruke funksjonene &quot;Set first&quot; og &quot;Set last&quot;. Når du er ferdig, setter du senteret, &quot;C.&quot; Start oppkjøpet av avkastningen med &quot;start eksperiment&quot; -knappen. Se eksempler på bilder i figur 4 , figur 5 og figur 6 . </li><li> Når oppkjøpet er fullført, lagre bildet i den angitte mappen. Flytt til neste avkastning og gjenta trinn 4.10. Når forsøket er fullført, fjern bildeskiltet fra mikroskopet, fjern forsiktig prøven fra platen, og rengjør eventuell resterende lim. </li><li> Klargjør prøven for neste analyseteknikk. </li></ol> 5. PrøveprosessG for histologi og immunforsvar MERK: Prøver behandles i henhold til protokollen beskrevet i JoVE-generell laboratorieteknikk 54 som beskriver prøvefiksering, innebygd og snittprosesser. Beindannende prøver skal behandles i 7 dager i et EDTA-basert dekalcifiseringsmiddel mellom fikserings- og innlejringsprosessene. Blokkerings / permeabiliseringsløsningen er 10 mM PBS pH 7,4 buffer med 1% Triton X-100, 1% bovint serumalbumin (BSA) og 10% normalt geit serum (NGS). <ol><li> Sett skivene i xylen i 10 min), xylen i 5 min, 100% etanol i 5 min, 70% etanol i 5 min, 50% etanol i 5 min, og H 2 O i 5 min. </li><li> Overfør stykkene til en citratbasert antigenmaskerende arbeidsløsning. </li><li> Kok skiver i 15 minutter og la dem avkjøles til romtemperatur. </li><li> Vask skivene i 10 mM PBS pH 7,4 løsning med 1% Triton X-100 (5 minutter, 3 ganger). </li><li> Overfør samPles til blokkering / permeabiliseringsoppløsningen og inkuber i 30 minutter. </li><li> Tilsett primær antistoff fortynnet i blokkering / permeabiliseringsløsning og inkuber natten over ved 4 ° C. </li><li> Vask skivene i 10 mM PBS pH 7,4 løsning med 1% Triton X-100 (5 minutter, 3 ganger). </li><li> Tilsett sekundær antistoff fortynnet i blokkering / permeabiliseringsoppløsning i 1 time i mørket ved romtemperatur. </li><li> Vask med H 2 O (5 min, 3 ganger). </li><li> For å redusere bakgrunnsfluorescens, senk skivene i Sudan Black-arbeidsløsningen i 10 minutter, i mørket og ved romtemperatur. </li><li> Vask stykkene i H 2 O (5 min, 3 ganger). </li><li> Monter skiver med fluorescerende monteringsmedium med DAPI (0,5 μg / ml). </li><li> Oppbevar skiver ved 4 ° C og kontroller at monteringsmediet er tørt før du utfører fluorescerende bildebehandling. Se eksempelbilder i Figur 7 . </li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

<html> Betydning med hensyn til eksisterende metoder: I denne protokollen beskrev vi en metode for å generere forskjellige humaniserte mikromiljøer i mus og å visualisere deres arkitektur via tofotonmikroskopi og histologi. De representative dataene som er angitt, viser muligheten for tilnærmingen, ved bruk av forskjellige stromalceller for å konstruere humanisert vev. Protokollen har spesifikke anvendelser til studien av humane hematopoietiske celler og benmargnisjeavledede celler under normale og patologiske forhold. Disse applikasjonene inkluderer studiet av klonal evolusjon, medikamentscreening og krysskala mellom humane HSC og stromale komponenter. I det nye feltet vevsteknikk er det foreslått flere alternative tilnærminger. Tilnærminger til notatet inkluderer utvikling av 3D humaniserte BM strukturer in vitro 55 , 56 , 57 ,S = &quot;xref&quot;&gt; 58 , 59 , 60 , 61 , 62 , 63 og det ortopotopiske implantatet av humaniserte BM stillaser i mus 64 . Vår tilnærming har fordelen av å kombinere både kompleksiteten til in vivo- systemet med den enkle anatomiske tilgjengeligheten til det humaniserte vevtransplantatet. Modifikasjoner og feilsøking: En variasjonskilde i denne protokollen finnes i valget av celler som brukes til å frøstille stillasene. I vårt arbeid brukte vi BM-avledede hMSCs. Imidlertid kan mesenkymceller oppnås fra flere vev, som kan vise karakteristiske egenskaper avhengig av opprinnelsen. Derfor kan bruk av hMSCer avledet fra forskjellige organer vurderes. Imidlertid bør deres evne til å danne bindevev in vivo testes før bruk i denne pRotokoll. Denne protokollen bruker en kommersielt tilgjengelig human endotelcellekilde ( dvs. E4ORF1-transduced HUVEC). Nylig har bruk av organspesifikke endotelceller for forskjellige formål blitt rapportert 65 , 66 . Videre kan bruken av primære hEC som er avledet fra BM, utgjøre en interessant forbedring av protokollen. Derfor kan bruk av forskjellige kilder til endotelceller produsere forskjellige in vivo utfall. Vi brukte NSG-immunokompromitterte mottakermus for å favorisere implantasjonen av humaniserte stillas og for å unngå vevavvisning. Vi utelukker ikke muligheten for å bruke denne protokollen til å konstruere ektopiske knoglemarvvev i andre musestammer. Faktisk kan rhBMP-2 inducere beindannelse i forskjellige pattedyrsmodeller 47 , 48 , 49 , 50 <sup&gt;, 52 . Imidlertid vil forskjeller i celle-levedyktighet og langsiktig transplantasjon sannsynligvis bli observert ved bruk av forskjellige stammer / modeller. Tidspunktet for stillasgjenoppretting kan også være fleksibel, avhengig av det endelige formål med eksperimentet. I den presenterte protokollen gjenfinner vi prøver etter 8 - 12 uker etter implantasjon for å vurdere langsiktig hematopoietisk engraftment. For å studere tidlige trinn i den humane BM nisjeformasjonen ( f.eks. Osteokondral vevdannelse 47 eller vaskulær utvikling), kan forskjellige tidspunkter velges. Live-imaging teknikken vi beskrev i denne protokollen er indikert for kortsiktig bildebehandling av eksplantater. Bruken av et ekvilibrert kammer for å opprettholde fysiologisk temperatur, oksygenspenning og CO 2 -konsentrasjon bør vurderes i tilfeller av langvarig avbildning, for eksempel for å studere motilitetsadferd. Kritisk StEps i protokollen: Blant utfordringene knyttet til protokollen vil vi fremheve de tekniske ferdighetene som kreves for noen trinn. Mesenkymale og endotelceller bør brukes ved lavcellepassasjenumre; Ellers vil de ikke kunne støtte humant hematopoietisk celle engraftment in vivo eller delta i de novo vaskulatur og beindannelse in vivo . Vi anbefaler bruk av hMSCs og hECs i passasjer 1 - 5. Stillas forberedelse og cellesedding trinn krever grunnleggende cellekultur ferdigheter og kunnskap om egenskapene til de spesifikke cellene som brukes i prosedyren. Operasjonsprotokollen er ganske enkel, men krever litt øvelse. Vedlikehold av et aseptisk miljø for å unngå forurensning av de implanterte stillasene i immunfektige mus er avgjørende for å sikre eksperimentets suksess. Eksempeleksplanter og levende bildebehandling krever kirurgisk praksis (spesielt for bruk av mikrodrill) og kunnskap omMikroskopsystem. Endelig krever prøvebehandling og histologi grunnleggende kunnskap om teknikkene som skal brukes. Begrensninger av teknikken: Tilnærmingen vi beskriver muliggjør visualisering av levende humane hematopoietiske celler som sårer et humanisert beinmargsmiljø, mens menneskelige endotelceller danner vaskulære strukturer og mesenkymceller som danner bein / beinmargeplass. Etter hvert som vevet dannes in vivo , vil den endelige konstruerte stillas fortsatt være kimær (human og murin). Dette problemet bør tas i betraktning, da det kimære vevet ikke fullt ut kan etterligne humant knoglemarvskompleksitet og miljø. Stillasene som er implantert, har en begrenset størrelse (vi prøvde maksimalt 6,6 x 7,5 x 7 mm), og de kan derfor være vert for et begrenset antall celler for xenotransplantasjon. Det absolutte antall gjenvunnet celler vil også bli begrenset; Dermed skal antallet implanterte stillaseneBeregnes som en funksjon av antall celler som kreves for eksperimentet. Bildeprogrammet vi beskrev er spesielt nyttig for å observere store områder av levende vev i dyp 150-200 μm fra overflaten uten å forstyrre arkitekturen og skade cellene. Derfor tillater det ikke visualisering av hele stillaset. Hvis en fullstendig skanning av vevet er nødvendig, vil standard immunofluorescens tilnærminger være mer hensiktsmessig. Fremtidige applikasjoner: Fremtidens retning for denne bioengineered-modellen ville være å øke kompleksiteten til de humane komponentene i vevet. Kunnskapen og karakteriseringen av den humane BM-nisje har utviklet seg de siste årene 67 , og den beskrevne protokollen kan være en interessant plattform for å studere funksjonen til disse nye cellekomponenter og løselige faktorer, samt deres rolle i å støtte normal / malignAnt HSCs. Videre gir avbildningsteknikken potensialet for intravital avbildning av stillasene i langsgående studier, noe som vil kreve tekniske forbedringer ved å avdekke stillasene i levende bedøvede mus, med gjenvinning etter kirurgi. Denne tilnærmingen vil kreve ytterligere skritt og er for tiden undersøkt i laboratoriet.

Cell-skjebnebeslutninger som observeres i stamcellefelt er tett regulert av både indre og ekstrinsiske faktorer. Spesielt er det nå allment anerkjent at BM mikromiljøet spiller en grunnleggende rolle i å kontrollere bryteren i HSCs fra en hvilende til en aktiv tilstand, så vel som i deres selvfornyelse eller differensiering skjebne 1 . Videre viser nylige funn at hematologiske maligniteter påvirker funksjonen til BM mikromiljøet, og peker på eksistensen av aktiv krysstal mellom de to rom 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Til tross for de siste fremskrittene, fortsetter mange viktige spørsmål om hvordan aktiviteten til bestemte BM-nisekomponenter bidrar til HSC-adferd og ondartet transformasjon. BM mikromiljøet er svært heterogent<html> Enous og kompleks blanding av mange forskjellige celletyper, hver med spesialiserte funksjoner. Den rikelige endotel (EC) og vaskulær komponent regulerer næringsinnhold og metabolittomsetning, inngangen og utgangen til forskjellige celler til og fra BM, og flere HSC-funksjoner 7 , 8 . Mesenkymale stromalceller (MSCs), en heterogen populasjon av utifferentierte stamceller og stamceller som er begått gjennom tre forskjellige linjer ( dvs. osteogen, kondrogen, en adipogen), er en annen grunnleggende komponent i BM nisje. Disse MSCene lokaliserer seg både i sentrale områder av BM og i nærheten av endosteal regionen. De kan være forbundet med vaskulære strukturer og er involvert i reguleringen av HSC-funksjon 9 , 10 , 11 , 12 , 13 ,&quot;&gt; 14 , 15 . Mange rapporter tyder på at HSCs bor i ulike definerte steder i margen, og at deres funksjon kan avhenge av deres presise lokalisering. Det meste av dagens kunnskap om HSCs og deres interaksjon med BM mikromiljøet kommer fra murine studier 1 . Bruken av xenograftmodeller har utvidet denne kunnskapen til humane normale og ondartede HSCs, engrafting i murine BM av immunodeficiente mus 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . Selv om dette representerer en gyldig modell, presenterer den fremdeles mange utfordringer, for eksempel behovet for å betinge mottakermusen i de fleste tilfeller for å tillate humant HSC-homing og engraftment eller kryssartsparrieren og den dårlig forstått påvirkning av cellecelleinteraksjoner og funksjoner. Bruk av nøytraliserende antistoffer og genetisk modifiserte mus, sammen med xenotransplantasjon, har vært medvirkende til å markere den komplekse dialogen som menneskelige HSCs etablerer med sine mikro-miljøer. Introduksjonen og utviklingen av intravital to-foton-konfokalmikroskopi har flyttet disse studiene et skritt fremover, noe som muliggjør direkte, høyoppløselig og dynamisk avbildning av benmarg 19 , 20 , 21 , 22 og gir et kraftig verktøy for funksjonell Karakterisering av BM mikromiljøet og dets rolle i regulering av HSC-funksjonen. For å kringgå noen av problemene som oppstår i klassiske xenotransplantasjonsmodeller, er begrepet engineering en humanisert BM-struktur tatt i forkant. Sammenslåing av biomaterialer og celleimplantasjonskonsepter, rapporter har vist muligheten til å etterligne den menneskelige benmPil mikromiljø i heterotopområder 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . Dette åpner muligheten for å bruke bioengineering i musemodeller for å studere human normal og ondartet hematopoiesis 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , tumorigenese og metastase 40 , 41 , 42 , 43 , 44 . Basert på tidligere erfaring i beinvevsteknikk og in vivo- bildebehandling 19 , 22 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50 , 51 , 52 , beskriver vi en protokoll for bioengineer og levende bildeorganotiske humane BM-vev. Disse strukturene stammer fra implanteringen av humane BM-avledede stromaceller til kollagenbaserte stillaser subkutant podet i immunodeficiente mus. I en tidligere rapport demonstrerte vi at menneskelige MSCer sikrer dannelsen av et humant mikromiljø som er tilstrekkelig for engraftment av humane hematopoietiske celler 45 . Videre beskriver vi hvordan co-implantering av andre humane BM-cellekomponenterS, slik som humane endotelceller (hEC) og / eller cytokiner som er viktige for beindannelse ( f.eks. HBMP2), samarbeide med hMSCs for å generere forskjellige humaniserte mikro-miljøer, som kan bli levende avbildet in situ .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1378">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Ficoll-Paque</td>
			<td style="width:277px;">Ge Healthcare</td>
			<td style="width:229px;">17-1440-03</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Cd34 positive selection Kit</td>
			<td style="width:277px;">Stemcell</td>
			<td style="width:229px;">18056</td>
			<td style="width:480px;">Store a 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Magnet</td>
			<td style="width:277px;">Stemcell</td>
			<td style="width:229px;">18000</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Anti-human CD3 antibody, clone OKT-3</td>
			<td style="width:277px;">Bioxcell</td>
			<td style="width:229px;">BE0001-2</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4&#176;C. Used for T cell depletion in primary AML samples.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:392px;">Cytokines (IL3, G-CSF, and TPO)</td>
			<td style="width:277px;">PeproTech</td>
			<td style="width:229px;">200-03, 300-23 and 300-18</td>
			<td style="width:480px;">For doing the stock: Dilute each one of the cytokines in 100&#956;L of water and mix them. Add 200&#956;L, do alicuots of 45&#956;L and Store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">DMSO</td>
			<td style="width:277px;">Sigma</td>
			<td style="width:229px;">D4540</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:392px;">FBS</td>
			<td style="width:277px;">Life technologies</td>
			<td style="width:229px;">10270106</td>
			<td style="width:480px;">Heat-inactivate at 56&#176;C during 30 minutes, do aliquots and freeze down. Warm in 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">MEM-&#945;</td>
			<td style="width:277px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:229px;">32571-028</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4&#176;C. Warm in 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Myelocult H5100</td>
			<td style="width:277px;">corning</td>
			<td style="width:229px;">5100</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4&#176;C. Warm in 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">199</td>
			<td style="width:277px;">Gibco</td>
			<td style="width:229px;">41150-020</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4&#176;C. Warm in 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:392px;">hMSC-FBS, Heat-inactivated</td>
			<td style="width:277px;">Gibco</td>
			<td style="width:229px;">12662-029</td>
			<td style="width:480px;">Store at -20&#176;C. Warm in 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">P/S</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:229px;">P0781</td>
			<td style="width:480px;">Store at -20&#176;C. Warm in 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">ECGS</td>
			<td style="width:277px;">Millipore</td>
			<td style="width:229px;">02-102</td>
			<td style="width:480px;">Dilute in culture media and use 0.22 mm filter.</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:392px;">HEPES</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:229px;">S1558-50ML</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Heparin</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:229px;">H3149</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Glutamine</td>
			<td style="width:277px;">Gibco</td>
			<td style="width:229px;">25030</td>
			<td style="width:480px;">Store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Collagen 1 coated cell culture plate</td>
			<td style="width:277px;">corning</td>
			<td style="width:229px;">354505</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:277px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:229px;">25200056</td>
			<td style="width:480px;">Store at -20&#176;C. Warm in 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:392px;">hMSC</td>
			<td style="width:277px;">Lonza</td>
			<td style="width:229px;">PT-2501</td>
			<td style="width:480px;">Alternatively, hMSCs we also kindly provided by Dr. Dosquet (University Paris Diderot, Paris) from human bone marrow obtained during orthopaedic surgery under ethical approval 10-038 from IRB00006477.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">VeraVec HUVEC endothelial cells</td>
			<td style="width:277px;">Angiocrine bioscience</td>
			<td style="width:229px;">hVera101</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:392px;">Human hematopoietic cells</td>
			<td style="width:277px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:480px;">Umbilical Cord blood or primary Acute Myeloid Leukemia (AML) samples were obtained from the Royal London Hospital (London, UK) after informed consent and protocol of use was approved by the East London Ethical Committee and carried out in accordance with the Declaration of Helsinki.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:392px;">Gelfoam, Size 12-7mm</td>
			<td style="width:277px;">Pfizer</td>
			<td style="width:229px;">00009-0315-08</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">PBS</td>
			<td style="width:277px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:229px;">10010023</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Surgical material</td>
			<td style="width:277px;">Multiple</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:480px;">Sterile forceps, tweezers and sharp scissors.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Sterile tissues</td>
			<td style="width:277px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:480px;">Heat-sterilize paper tissues.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">1 ml Syringe with needle of 25G</td>
			<td style="width:277px;">Terumo</td>
			<td style="width:229px;">SS+01H25161</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:392px;">Ultra Low Attachment Multiple Well Plates</td>
			<td style="width:277px;">Corning</td>
			<td style="width:229px;">3473 or 3471</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">BMP2</td>
			<td style="width:277px;">Noricum</td>
			<td style="width:229px;">rhBMP-2</td>
			<td style="width:480px;">Dilute at 5 mg/ml in acetic acid 50 mM and store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:392px;">Thrombin</td>
			<td style="width:277px;">Sigma</td>
			<td style="width:229px;">T9010</td>
			<td style="width:480px;">Dilute in CaCl2 2%, 500 mL per vial, and store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:392px;">Fibrinogen</td>
			<td style="width:277px;">Sigma</td>
			<td style="width:229px;">F3879</td>
			<td style="width:480px;">Dilute at 4 mg/100 mL in PBS. Store at -20C. Warm before use.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:392px;">Tissue-culture dishes 35 mm x 10 mm</td>
			<td style="width:277px;">Falcon</td>
			<td style="width:229px;">353001</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:392px;">U-Botton 96 well plate</td>
			<td style="width:277px;">Falcon</td>
			<td style="width:229px;">353077</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:392px;">NSG mice</td>
			<td style="width:277px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:229px;">5557</td>
			<td style="width:480px;">NSG mice were a kind gift from Dr Leonard Shultz (The Jackson Laboratory).</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Chlorhexidine</td>
			<td style="width:277px;">G9</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:480px;">Dilute 1:10 before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Carprofen</td>
			<td style="width:277px;">Pfizer</td>
			<td style="width:229px;">Rimadyl</td>
			<td style="width:480px;">5 mg/g of mouse</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Buprenorphine</td>
			<td style="width:277px;">Alstoe</td>
			<td style="width:229px;">Vetergesic</td>
			<td style="width:480px;">0.1 mg/g of mouse body weight</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:277px;">Abbott</td>
			<td style="width:229px;">B506</td>
			<td style="width:480px;">Induction of anaesthesia 2%, maintenance 1%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Trimmer</td>
			<td style="width:277px;">Wella</td>
			<td style="width:229px;">Contura HS61</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Surgical glue</td>
			<td style="width:277px;">3M</td>
			<td style="width:229px;">Vetbond</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">carbomer (polyacrylic acid)&#160; as Ophthalmic gel</td>
			<td style="width:277px;">Novartis</td>
			<td style="width:229px;">Viscotears Liquid Gel</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:392px;">Human Normal Immunoglobulin</td>
			<td style="width:277px;">Gammaplex</td>
			<td style="width:229px;">10g vial</td>
			<td style="width:480px;">100 ml/mouse intravenously, 30 min before infusion of specific antibody.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:392px;">NT-QTracker</td>
			<td style="width:277px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:229px;">Q21021MP</td>
			<td style="width:480px;">Vessel-pooling agent. Administrate 15 ml/mouse intravenously 5 min before imaging.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">AF488-hCD45</td>
			<td style="width:277px;">Biolegend</td>
			<td style="width:229px;">304017</td>
			<td style="width:480px;">100 ml/mouse intravenously, 30 min before imaging.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">FITC-hCD31</td>
			<td style="width:277px;">BD Pharmigen</td>
			<td style="width:229px;">555445</td>
			<td style="width:480px;">100 ml/mouse intravenously, 30 min before imaging.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Super glue</td>
			<td style="width:277px;">Loctite&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Super Glue</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Micro-Drill Kit</td>
			<td style="width:277px;">IDEAL - Fisher Scientific</td>
			<td style="width:229px;">NC9010016</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microsurgical microscope</td>
			<td style="width:277px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:480px;">No specific brand/company is adviced.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:392px;">LSM 710 NLO</td>
			<td style="width:277px;">Zeiss</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:480px;">Upright confocal microscope with motorized stage, two-photon laser and 20x 1.0 NA water immersion lens. Alternatively, a microscope with similar specifications could be used.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:392px;">MaiTai &#8220;High Performance&#8221; fully automated 1-box 517 mode-locked Ti:Sapphire laser with DeepSee dispersion compensation</td>
			<td style="width:277px;">&#160;Spectra-Physics</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%&#160;</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:229px;">HT501128</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Ethanol</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:229px;">32294</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Osteosoft</td>
			<td style="width:277px;">Millipore</td>
			<td style="width:229px;">1.01728.1000</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Polysine slices</td>
			<td style="width:277px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:229px;">J2800AMNZ</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:392px;">Antigen unmasking solution</td>
			<td style="width:277px;">Vector</td>
			<td style="width:229px;">H-3300</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C. Dilute 1:100 in H2O for working solution.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Triton 100x</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:229px;">T9284</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:229px;">A96470</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Normal Goat serum (NGS)</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:229px;">G9023</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Endomucin Antibody</td>
			<td style="width:277px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:229px;">sc-65495</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">hVimentin antibody</td>
			<td style="width:277px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:229px;">sc-6260</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">hCD31 antibody</td>
			<td style="width:277px;">DAKO</td>
			<td style="width:229px;">M0823</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">hCD45 antibody</td>
			<td style="width:277px;">DAKO</td>
			<td style="width:229px;">M0701</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">ADRP (Perilipin2)</td>
			<td style="width:277px;">antibodies-online</td>
			<td style="width:229px;">ABIN283918</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="59" style="height:59px;width:392px;">Goat anti mouse secondary antibodies</td>
			<td style="width:277px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:229px;">A11029 or A11005</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:392px;">Goat anti Rabbit secondary antibodies</td>
			<td style="width:277px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:229px;">A11037 or A11008</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Goat anti Rat secondary antibodies</td>
			<td style="width:277px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:229px;">A11007 or A21247</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:392px;">Sudan Black</td>
			<td style="width:277px;">Sigma</td>
			<td style="width:229px;">S2380</td>
			<td style="width:480px;">Prepare a stock of 1% sudan black in ethanol 70%. Store at RT. Prepare working solution of 0.1% sudan black in ethanol 70% and filter using filter-paper before use.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:392px;">DAPI</td>
			<td style="width:277px;">Sigma</td>
			<td style="width:229px;">D8417</td>
			<td style="width:480px;">Prepare stock in H20 at 100 mg/mg. Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Fluorescent mounting media</td>
			<td style="width:277px;">Dako</td>
			<td style="width:229px;">S3023</td>
			<td style="width:480px;">Add DAPI before use (1:400 from DAPI stock).</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Cover glass</td>
			<td style="width:277px;">VWR</td>
			<td style="width:229px;">631-0147</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioengineering of humanized bone marrow microenvironments in mouse and their visualization by live imaging

Humane hematopoietiske stamceller (HSCs) ligger i benmargen (BM) nisje, et intrikat, multifaktorielt nettverk av komponenter som produserer cytokiner, vekstfaktorer og ekstracellulær matrise. HSCs evne til å forbli hvilende, selvfornyelse eller differensiering, og tilegne seg mutasjoner og bli ondartet, avhenger av de komplekse samspillet de etablerer med forskjellige stromale komponenter. For å observere crosstalk mellom humane HSC og den humane BM nisje i fysiologiske og patologiske forhold, utformet vi en protokol for ektopisk modell og bildet en humanisert BM nisje i immunodeficiente mus. Vi viser at bruken av forskjellige cellulære komponenter tillater dannelse av humaniserte strukturer og muligheten til å opprettholde langsiktig human hematopoietisk engraftment. Ved hjelp av tofotonmikroskopi kan vi levebilde disse strukturene på stedet ved enkelcelleoppløsningen, og gi et kraftig nytt verktøy for funksjonell karakterisering av den humane BM mMikromiljø og dets rolle i regulering av normal og ondartet hematopoiesis.

I figur 1 er representative bilder av stillads- og implantasjonsprosessene for stillascellene vist. I figur 1C merk at celler injiseres direkte inn i stillaset. I figur 1G merkes det at et snitt er laget på baksiden av musen, hvor den subkutane lommen er opprettet og stillaset er implantert. Figur 2 viser brutto morfologi av forskjellige stillaser implantert i NSG-mus og hentet etter 8 uker. Legg merke til den svake vaskulariseringen i hMSC-frøplater ( figur 2A ). Samsøing av human ECs med hMSCs i stillaset muliggjør dannelse av mer relevant vaskulatur i stillas ( figur 2B ). Til slutt fremkaller tilstedeværelsen av rhBMP-2 beindannelse. De hentede stillasene er større i dette tilfellet, og de utgjøres avBenlignende hardt vev. Figur 3 viser kanalkonfigurasjonsoppsettet på mikroskopet for live-imaging med NDD (detaljer i figurlegenden). Figur 4 og Video 1 viser humane hematopoietiske celler i hMSC-belagte stillaser. Stillasene ble eksplantert 8 uker etter implantasjon og etter intravenøs inokulering av AF488-hCD45 antistoff og 655-VPA. Denne prosedyren tillater visualisering av implanterte humane hematopoietiske celler og den vaskulære strukturen ved to-foton-konfokalmikroskopi. I dette tilfellet viser bildene blodkar (655-VPA) i stillasene og langsiktig engraftment av humane hematopoietiske celler (AF488-hCD45) i stillasparenchyma. Figur 5 og Video 2 tilsvarer menneskelige stillaser frøet med hEC og hMSCs. 8 uker etter operasjonen ble stillas eksplantert etter intravenøs brukOus inokulering av FITC-hCD31 antistoff og 655-VPA, og bilder ble ervervet med et tofoton konfokalmikroskop, som tidligere nevnt. Bilder viser deltakelsen av hEC i fartøyformasjon i stillaset, noe som resulterer i en murin-menneskelig kimær vaskulatur. Figur 6A viser representative data av tilnærmingen som brukes til å stimulere beindannelse i MSC-stillasene. I likhet med tidligere figurer, 8 uker etter implantasjon, ble intravenøs inokulering av 655-VPA utført, stillas ble hentet, og bilder ble ervervet med tofoton-konfokalmikroskopi. RhBMP-2-stimulerte stillasene induserer dannelsen av beinvev, noe som kan visualiseres på grunn av SHG (cyanfarge i bildene) som er gitt av kalsium i benet. De angitte bildene viser også dannelsen av hulrom og vascularized endosteal vev, som i stor grad ligner BM endosteal vev. På figur 6B </sTrong&gt; og Video 3 , ble hECs co-implantert med hMSCs. Stillasene ble hentet etter intravenøs inokulering av FITC-hCD31 antistoff og 655-VPA, og tofoton-konfokale mikroskopi-bilder viser deltakelsen av hECs i neovaskularisering i et bendannende stillas. Figur 7 viser representative bilder av histologi, en prosedyre utført for å bekrefte tidligere beskrevne resultater. Immunfluorescerende bilder viser musvaskulatur, hECs, hMSCs og langsiktige engrafted humane hematopoietiske celler i stillasstrukturene. Stillaser hentet fra mus ble fikset og brukt for immunofluorescens. I rhBMP-2-bærerbenformende stillasene ( Figur 7D- F ), merk morfologien til vevet, som ligner modent knoglemarv med fettvev. I dette benformede stillaset viser vi at hMSC er fibroblaster, noe som vil indikere tHue de bidrar til nydannet vev som stromaceller. Vi viser også humant adipocytmarkøruttrykk, noe som tilsier at hMSC også bidrar til dannelse av fettvev. <img alt="Figur 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig1.jpg" /> Figur 1. Representative bilder av cellesedings- og implantasjonsprosessene. A) Initial stillas og dens skjæremetode ved hjelp av en skalpell. B) 24 stykker oppnådd fra den første stillas. C) Stillascellesøtningsmetode ved hjelp av en sprøyte. D) Cell-seeded stillas med dyrkningsmedium, klar til å bli implantert. EF) Spesifikke trinn for beinformende stillas: E) Stillas overføres til en 96-brønn, u-bunnplate og F) Representativt bilde av metoden som brukes til å legge til rhBMP2, trombin og fibrinogen til stillaset. GJ) Surgi<html> Cal implantasjonsprosedyre under generell anestesi: G) sår opprettet i hud- og stilladsimplantasjon, H) implanteringsmetode og IJ) sårlukningsprosedyre ved bruk av kirurgisk lim. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a> <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig2.jpg" /> Figur 2. Forskjellige stillaser hentet fra mus. Representative bilder av MSC stillas (til venstre), MSC + EC stillas (midten) og MSC + EC + BMP stillas (høyre). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a> 4 / 55914fig3.jpg &quot;/&gt; Figur 3. Kanalkonfigurasjon. Mikroskopfilteroppsettet vises. A) Det er fire NDD detektormoduler: I den første modulen er det to filterkasser; Den andre og tredje modulen har en filterkube hver; Og den siste modulen har ingen terning (ikke brukt). Det første fotomultiplikatorrøret (PMT) er for den fjernrøde kanalen (640 - 690 nm), som reflekterer de nedre bølgelengder; Følgende er 380 - 485 nm, 500 - 550 nm og 555 - 625 nm (rekkefølgen er alltid fra nedre til høyere bølgelengder). B) Fluoroforeutslippene som kan påvises med de ovennevnte konfigurasjonene (fargekodet). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a> <img alt="Figur 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig4.jpg" /> Figur 4. MSC stillas<html> S tillate for dannelse av en nisje for humane hematopoietiske celler. A) og B) 3D-rekonstruksjoner av Z-stabler tatt etter eksplantering, etter intravenøs inokulering med AF488-hCD45 (grønn), for å merke humane hematopoietiske celler og 655-VPA (magenta) m for å merke vasculatur. Skalestenger representerer 20 μm i A og B (øvre paneler) og 5 μm i B (nedre paneler). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig4large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a> <img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/55914/55914video1.jpg" /> Video 1. MSC stillasene tillater dannelse av en nisje for humane hematopoietiske celler . 3D-rekonstruksjon av humane hematopoietiske celler (AF488-hCD45) assosiert med vaskulaturen (655-VPA) i MSC-stillaset (kollagenstrukturer: SHG, cyan). Hver stabel måler 140 x 140 μm.Ef = &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914video1.mov&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.) <img alt="Figur 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig5.jpg" /> Figur 5. Menneskelige ECs deltar i dannelsen av humaniserte fartøy i MSC stillas. 3D rekonstruksjon av vaskulatur (655-VPA) foret med ECs av human opprinnelse (FITC-hCD31) i MSC + EC stillas. Skalestenger representerer 20 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig5large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a> <img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/55914/55914video2.jpg" /> Video 2. Menneskelige ECs deltar i dannelsen av humaniserte fartøy i MSC stillas. 3D rekonstruksjon av menneskelige ECs (FITC-hCD31) som ligger på vaien<html> Sculature (655-VPA) i MSC + EC stillas. Hver stabel måler 240 x 240 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914video2.mov" target="_blank">Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)</a> <img alt="Figur 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig6.jpg" /> Figur 6. rhBMP-2 Carrier Stillas har benflater og humanisert vaskulatur som ligner på benmarg. A) 3D rekonstruksjon av MSC + BMP stillas som viser dannelsen av benstrukturer (SHG-cyan) og vaskulatur (655-VPA). Skalestenger representerer 100 μm (venstre), 70 μm (midt) og 50 μm (høyre). B) 3D rekonstruksjon av MSC + EC + BMP stillas som viser humaniserte fartøy (655-VPA) foret med human ECs (FITC-hCD31). Skalestenger representerer 50 μm (venstre) og 30 μm (midten og høyre).14 / 55914fig6large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. <img alt="Video 3" src="/files/ftp_upload/55914/55914video3.jpg" /> Video 3. rhBMP-2 Carrier Stillas har benflater og humanisert vaskulatur som ligner på benmarg. 3D rekonstruksjon av MSC + VERA + BMP stillas (bein: SHG; fartøy: 655-VPA; human ECs: FITC-hCD31). Hver stabling måler 600 x 600 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914video3.mov" target="_blank">Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)</a> <img alt="Figur 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig7.jpg" /> Figur 7. Representative bilder av immunfluorescens utført på faste stillaser. AF) Immunofluorescensstudier utført for å lokalisere humane celler implantert iN stillas. AC) Stillaser implantert med hECs, hMSCs og hHSCs. DF) Benformede stillas implantert med hECs, hMSCs og hHSCs. Fargekanalene er som følger: AD) humant EC (hCD31) og mus vaskulær struktur (endomucin, ENDOM), BE) hMSCs (hVimentin, hVIM) og muse vaskulære celler (endomucin, ENDOM), c) humane hematopoietiske celler (hCD45) Og musvaskulatur (endomucin, ENDOM) og F) humant adiposdifferensieringsrelatert protein (hADRP) og musvaskulatur (endomucin, ENDOM). Skalestenger representerer 10 μm (A og C), 20 μm (B og E) og 40 (D og F) μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig7large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging at JoVE.com

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

En metode for å lage og levende bilde forskjellige humaniserte bein-margen nisjer i mus er presentert. Basert på den støttende nisje som er opprettet av humane mesenkymceller, induserer tilsetningen av humane endotelceller dannelsen av humane fartøy, mens tilsetningen av rhBMP-2 inducerer dannelsen av humant mus-kimerisk modent benvev.

Bioengineering av humaniserte benmarg mikromiljøer i mus og deres visualisering av levende bildebehandling

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix

Isolering av menneskelige stamceller og deres Dyrking på Porøse Bone Matrix

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific ...

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells (MPCs) from Human Bone Marrow

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells MPCs from Human Bone Marrow

Isolere Mesangiogenic stamceller (MPCS) fra human benmarg

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel ...

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

In Vitro Differensiering av Eldre Myofibers for Live Imaging

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Lev Confocal Imaging av Developing Arabidopsis blomster

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Identifikasjon av erytromyeloidprogenitorer og deres avkom i musembryoen ved flowcytometri

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule dyrking for Live-celle Imaging av zygoten polarisering og Embryo mønstre Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

En RANKL-baserte Osteoclast kultur analysen av musen benmarg å undersøke rollen som mTORC1 i Osteoclast-formasjonen

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Isolasjon, kultur og differensiering av benmarg Stromal celler og Osteoclast Progenitors fra mus

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Levende celle Imaging av kromosom segregering under mitose

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...