Name: bioengineering of humanized bone marrow microenvironments in mouse and their visualization by live imaging
Uploaded: 2017-08-01T15:00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging at JoVE.com

Мы благодарим сотрудников в основных учреждениях Института Фрэнсиса Крика (Biological Research, In Vivo Imaging и Experimental Histopathology) и Йоланды Сааведра-Торрес и Мерседес Санчес-Гарсон, ветеринары в Крике и LRI, соответственно, за их ценную помощь. Мы благодарны д-ру У. Грей за критическое чтение рукописи. DP поддерживалась неклиническим исследовательским стипендиатом от EHA. Эта работа была поддержана Институтом Фрэнсиса Крика, который получает основное финансирование от Cancer Research UK (FC001045), Британского совета медицинских исследований (FC001045) и Welcome Trust (FC001045).

Авторам нечего раскрывать.

<html> Значение в отношении существующих методов: В этом протоколе мы описали метод генерации различных гуманизированных микросреждений у мышей и визуализации их архитектуры с помощью двухфотонной микроскопии и гистологии. Представленные данные свидетельствуют о возможности подхода, используя различные стромальные клетки для создания гуманизированных тканей. Протокол имеет специфические применения для изучения гемопоэтических клеток человека и клеток, полученных из ниши, костного мозга в нормальных и патологических условиях. Эти приложения включают изучение эволюции клонов, скрининга лекарств и перекрестных помех между человеческими HSC и стромальными компонентами. В новой области тканевой инженерии было предложено несколько альтернативных подходов. Подходы к сведению включают разработку 3D гуманизированных структур BM in vitro 55 , 56 , 57 ,S = «xref»&gt; 58 , 59 , 60 , 61 , 62 , 63 и ортотопический трансплантат гуманизированных каркасов BM у мышей 64 . Преимущество нашего подхода заключается в сочетании как сложной системы in vivo, так и простой анатомической доступности гуманизированного тканевого трансплантата. Модификации и устранение неполадок: Источник изменчивости в этом протоколе можно найти в выборе ячеек, используемых для посева каркасов. В нашей работе мы использовали BMC-hMSC. Однако мезенхимные клетки могут быть получены из нескольких тканей, которые могут проявлять отличительные свойства в зависимости от происхождения. Поэтому можно рассматривать использование hMSC, полученных из разных органов. Однако их способность формировать костную ткань in vivo должна быть проверена до использования в этом pRotocol. В этом протоколе используется коммерчески доступный источник эндотелиальных клеток человека ( т.е. EUORF1-трансдуцированный HUVEC). Недавно было сообщено об использовании органоспецифических эндотелиальных клеток для различных целей 65 , 66 . Более того, использование первичных hEC, полученных из BM, может представлять интересное усовершенствование протокола. Поэтому использование различных источников эндотелиальных клеток может приводить к различным результатам in vivo . Мы использовали мышей с иммунодефицитом NSG с иммунодефицитом, чтобы способствовать имплантации гуманизированных лесов и избежать отторжения тканей. Мы не исключаем возможности использования этого протокола для разработки эктопических тканей костного мозга в других штаммах мыши. Действительно, rhBMP-2 может индуцировать образование костей в разных моделях млекопитающих 47 , 48 , 49 , 50 <sup&gt;, 52 . Однако различия в жизнеспособности клеток и длительной трансплантации, вероятно, будут наблюдаться с использованием разных штаммов / моделей. Время восстановления эшафотов также может быть гибким, в зависимости от конечной цели эксперимента. В представленном протоколе мы возвращаем образцы через 8-12 недель после имплантации для оценки долговременного гемопоэтического приживления. Для изучения ранних стадий формирования нитей человеческого BM ( например, образования остеохондральной ткани 47 или развития сосудов) могут быть выбраны разные моменты времени. Техника визуализации в реальном времени, описанная в этом протоколе, показана для краткосрочной визуализации эксплантов. Использование равновесной камеры для поддержания физиологической температуры, кислородного напряжения и концентрации CO 2 следует рассматривать в случаях долгосрочной визуализации, например, для изучения поведения моторики. КритическийEps в рамках Протокола: Среди проблем, связанных с протоколом, мы хотели бы выделить технические навыки, необходимые для некоторых шагов. Мезенхимальные и эндотелиальные клетки следует использовать при низких числах проходов клеток; В противном случае они не смогут поддерживать приживление гемопоэтических клеток человека in vivo или участвовать в сосудистой сети de novo и формировании костей in vivo . Мы рекомендуем использовать hMSCs и hECs в проходах 1-5. Для подготовки и подготовки ячеек требуется базовые навыки клеточной культуры и знание свойств конкретных клеток, используемых в процедуре. Протокол хирургии довольно прост, но требует некоторой практики. Сохранение асептической среды во избежание заражения имплантированных каркасов у иммунодефицитных мышей имеет решающее значение для обеспечения успеха эксперимента. Эксплантат образца и живое изображение требуют хирургической практики (особенно для использования микротрещины) и знаний оМикроскоп. Наконец, обработка образцов и гистология требуют базового знания методов, которые будут использоваться. Ограничения техники: Подход, который мы описываем, позволяет визуализировать живые человеческие гемопоэтические клетки, высевающие гуманизированный микроокружение костного мозга, с эндотелиальными клетками человека, образующими сосудистые структуры и мезенхимальные клетки, образующие пространство кости / костного мозга. Поскольку ткань образуется in vivo , конечный инженерный эшафот по-прежнему будет химерическим (человеческим и мышиным). Следует учитывать эту проблему, поскольку химерная ткань не может полностью имитировать сложность и среду человеческого костного мозга. Имплантируемые каркасы имеют ограниченный размер (мы пробовали максимум 6,6 х 7,5 х 7 мм), и поэтому они могут размещать ограниченное количество клеток для ксенотрансплантации. Абсолютное количество восстановленных клеток также будет ограничено; Таким образом, количество имплантированных лесов должноРассчитывается как функция количества клеток, необходимых для эксперимента. Прикладное изображение, которое мы описали, особенно полезно для наблюдения больших площадей живых тканей на глубинах 150-200 мкм от поверхности без нарушения архитектуры и повреждения клеток. Поэтому он не позволяет визуализировать весь эшафот. Если требуется полное сканирование ткани, более подходящими являются стандартные подходы к иммунофлюоресценции. Будущие приложения: Будущее направление этой биоинженерной модели будет заключаться в увеличении сложности компонентов человека в ткани. Знания и характеристика человеческой ниши BM развивались в последние годы 67 , и описанный протокол мог бы стать интересной платформой для изучения функции этих новых клеточных компонентов и растворимых факторов, а также их роли в поддержании нормального / злокачественногоAnt HSCs. Кроме того, метод визуализации обеспечивает возможность визуализации изображений в каркасном состоянии в продольных исследованиях, что потребует технических улучшений при визуализации изображений на живых, обезболиваемых мышах, после восстановления после операции. Этот подход потребует дополнительных шагов и в настоящее время находится на стадии расследования в лаборатории.

Решения о клеточной судьбе, наблюдаемые в отделениях стволовых клеток, жестко регулируются как внутренними, так и внешними факторами. В частности, в настоящее время широко признано, что микроокружение BM играет фундаментальную роль в контроле переключения в HSC от покоя до активного состояния, а также в решении 1 самообновления или дифференциации. Более того, недавние данные показывают, что гематологические злокачественные опухоли влияют на функцию микроокружения BM, указывая на существование активных перекрестных помех между двумя отделениями 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Несмотря на недавние достижения, многие ключевые вопросы остаются в отношении того, как активность отдельных компонентов BM-ниши способствует поведению HSC и злокачественной трансформации. Микроокружение BM является очень гетерогенным<html> Энером и сложной смесью многих типов клеток, каждая со специальными функциями. Обильный эндотелий (EC) и сосудистый компонент регулируют оборот питательных веществ и метаболитов, вход и выход различных клеток в BM и из BM и несколько функций HSC 7 , 8 . Мезенхимальные стромальные клетки (MSC), гетерогенная популяция недифференцированных стволовых клеток и предшественников, выделенных тремя различными линиями ( то есть остеогенными, хондрогенными, адипогенными), являются еще одним фундаментальным компонентом ниши BM. Эти MSC локализуются как в центральных областях БМ, так и вблизи эндостиального региона. Они могут быть связаны с сосудистыми структурами и связаны с регуляцией функции HSC 9 , 10 , 11 , 12 , 13 ,&quot;&gt; 14 , 15 . Многие сообщения указывают на то, что HSC находятся на разных определенных участках мозга и что их функция может зависеть от их точной локализации. Большинство существующих знаний о HSC и их взаимодействии с микроокружением BM происходит из исследований на мышах 1 . Использование моделей ксенотрансплантата распространило эти знания на нормальные и злокачественные HSC человека, приживаясь в мышином BM иммунодефицитных мышей 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . Несмотря на то, что это представляет собой приемлемую модель, она по-прежнему представляет собой множество проблем, таких как необходимость усвоения мыши-реципиента в большинстве случаев для обеспечения самонаведения и приживления человеческого HSC или межвидового барьера и его слабо понимаемого влияния на взаимодействия клеток и клеток функции. Использование нейтрализующих антител и генетически модифицированных мышей наряду с ксенотрансплантацией сыграло важную роль в освещении сложного диалога, который человеческие HSC устанавливают с их микросредами. Введение и развитие внутривидовой двухфотонной конфокальной микроскопии продвинуло эти исследования на шаг вперед, позволяя прямое, высокое разрешение и динамическое изображение костного мозга 19 , 20 , 21 , 22 и обеспечивает мощный инструмент для функционального Характеристика микроокружения BM и ее роль в регулировании функции HSC. Чтобы обойти некоторые проблемы, возникающие в классических моделях ксенотрансплантации, концепция интродукции гуманизированной структуры БМ была выдвинута на первый план. Слияние биоматериалов и концепций имплантации клеток, отчеты показали возможность подражания человеческой кости мArrow микроокружение в гетеротопических областях 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . Это открывает возможность использования биоинженерии в моделях мыши для изучения нормального и злокачественного гемопоэза человека 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , опухолеобразования и метастазов 40 , 41 , 42 , 43 , 44 . Основываясь на предыдущем опыте в области инженерии костной ткани и визуализации in vivo 19 , 22 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50 , 51 , 52 , мы описываем протокол биоинженерии и жировых изображений органотипических человеческих BM-тканей. Эти структуры происходят от имплантации стромальных клеток, продуцируемых человеческим BM, в коллагеновые основы, подкожно привитые у иммунодефицитных мышей. В предыдущем докладе мы продемонстрировали, что человеческие MSC обеспечивают образование микроокружения человека, адекватного приживлению человеческих кроветворных клеток 45 . Кроме того, здесь мы описываем, как совместная имплантация другого человеческого клеточного компонента BMS, такие как эндотелиальные клетки человека (hEC) и / или цитокины, важные для формирования костей ( например, hBMP2), сотрудничают с hMSC, чтобы генерировать различные гуманизированные микросреды, которые могут отображаться в реальном времени на месте .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1378">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Ficoll-Paque</td>
			<td style="width:277px;">Ge Healthcare</td>
			<td style="width:229px;">17-1440-03</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Cd34 positive selection Kit</td>
			<td style="width:277px;">Stemcell</td>
			<td style="width:229px;">18056</td>
			<td style="width:480px;">Store a 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Magnet</td>
			<td style="width:277px;">Stemcell</td>
			<td style="width:229px;">18000</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Anti-human CD3 antibody, clone OKT-3</td>
			<td style="width:277px;">Bioxcell</td>
			<td style="width:229px;">BE0001-2</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4&#176;C. Used for T cell depletion in primary AML samples.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:392px;">Cytokines (IL3, G-CSF, and TPO)</td>
			<td style="width:277px;">PeproTech</td>
			<td style="width:229px;">200-03, 300-23 and 300-18</td>
			<td style="width:480px;">For doing the stock: Dilute each one of the cytokines in 100&#956;L of water and mix them. Add 200&#956;L, do alicuots of 45&#956;L and Store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">DMSO</td>
			<td style="width:277px;">Sigma</td>
			<td style="width:229px;">D4540</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:392px;">FBS</td>
			<td style="width:277px;">Life technologies</td>
			<td style="width:229px;">10270106</td>
			<td style="width:480px;">Heat-inactivate at 56&#176;C during 30 minutes, do aliquots and freeze down. Warm in 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">MEM-&#945;</td>
			<td style="width:277px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:229px;">32571-028</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4&#176;C. Warm in 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Myelocult H5100</td>
			<td style="width:277px;">corning</td>
			<td style="width:229px;">5100</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4&#176;C. Warm in 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">199</td>
			<td style="width:277px;">Gibco</td>
			<td style="width:229px;">41150-020</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4&#176;C. Warm in 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:392px;">hMSC-FBS, Heat-inactivated</td>
			<td style="width:277px;">Gibco</td>
			<td style="width:229px;">12662-029</td>
			<td style="width:480px;">Store at -20&#176;C. Warm in 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">P/S</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:229px;">P0781</td>
			<td style="width:480px;">Store at -20&#176;C. Warm in 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">ECGS</td>
			<td style="width:277px;">Millipore</td>
			<td style="width:229px;">02-102</td>
			<td style="width:480px;">Dilute in culture media and use 0.22 mm filter.</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:392px;">HEPES</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:229px;">S1558-50ML</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Heparin</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:229px;">H3149</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Glutamine</td>
			<td style="width:277px;">Gibco</td>
			<td style="width:229px;">25030</td>
			<td style="width:480px;">Store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Collagen 1 coated cell culture plate</td>
			<td style="width:277px;">corning</td>
			<td style="width:229px;">354505</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:277px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:229px;">25200056</td>
			<td style="width:480px;">Store at -20&#176;C. Warm in 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:392px;">hMSC</td>
			<td style="width:277px;">Lonza</td>
			<td style="width:229px;">PT-2501</td>
			<td style="width:480px;">Alternatively, hMSCs we also kindly provided by Dr. Dosquet (University Paris Diderot, Paris) from human bone marrow obtained during orthopaedic surgery under ethical approval 10-038 from IRB00006477.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">VeraVec HUVEC endothelial cells</td>
			<td style="width:277px;">Angiocrine bioscience</td>
			<td style="width:229px;">hVera101</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:392px;">Human hematopoietic cells</td>
			<td style="width:277px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:480px;">Umbilical Cord blood or primary Acute Myeloid Leukemia (AML) samples were obtained from the Royal London Hospital (London, UK) after informed consent and protocol of use was approved by the East London Ethical Committee and carried out in accordance with the Declaration of Helsinki.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:392px;">Gelfoam, Size 12-7mm</td>
			<td style="width:277px;">Pfizer</td>
			<td style="width:229px;">00009-0315-08</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">PBS</td>
			<td style="width:277px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:229px;">10010023</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Surgical material</td>
			<td style="width:277px;">Multiple</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:480px;">Sterile forceps, tweezers and sharp scissors.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Sterile tissues</td>
			<td style="width:277px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:480px;">Heat-sterilize paper tissues.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">1 ml Syringe with needle of 25G</td>
			<td style="width:277px;">Terumo</td>
			<td style="width:229px;">SS+01H25161</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:392px;">Ultra Low Attachment Multiple Well Plates</td>
			<td style="width:277px;">Corning</td>
			<td style="width:229px;">3473 or 3471</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">BMP2</td>
			<td style="width:277px;">Noricum</td>
			<td style="width:229px;">rhBMP-2</td>
			<td style="width:480px;">Dilute at 5 mg/ml in acetic acid 50 mM and store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:392px;">Thrombin</td>
			<td style="width:277px;">Sigma</td>
			<td style="width:229px;">T9010</td>
			<td style="width:480px;">Dilute in CaCl2 2%, 500 mL per vial, and store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:392px;">Fibrinogen</td>
			<td style="width:277px;">Sigma</td>
			<td style="width:229px;">F3879</td>
			<td style="width:480px;">Dilute at 4 mg/100 mL in PBS. Store at -20C. Warm before use.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:392px;">Tissue-culture dishes 35 mm x 10 mm</td>
			<td style="width:277px;">Falcon</td>
			<td style="width:229px;">353001</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:392px;">U-Botton 96 well plate</td>
			<td style="width:277px;">Falcon</td>
			<td style="width:229px;">353077</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:392px;">NSG mice</td>
			<td style="width:277px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:229px;">5557</td>
			<td style="width:480px;">NSG mice were a kind gift from Dr Leonard Shultz (The Jackson Laboratory).</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Chlorhexidine</td>
			<td style="width:277px;">G9</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:480px;">Dilute 1:10 before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Carprofen</td>
			<td style="width:277px;">Pfizer</td>
			<td style="width:229px;">Rimadyl</td>
			<td style="width:480px;">5 mg/g of mouse</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Buprenorphine</td>
			<td style="width:277px;">Alstoe</td>
			<td style="width:229px;">Vetergesic</td>
			<td style="width:480px;">0.1 mg/g of mouse body weight</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:277px;">Abbott</td>
			<td style="width:229px;">B506</td>
			<td style="width:480px;">Induction of anaesthesia 2%, maintenance 1%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Trimmer</td>
			<td style="width:277px;">Wella</td>
			<td style="width:229px;">Contura HS61</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Surgical glue</td>
			<td style="width:277px;">3M</td>
			<td style="width:229px;">Vetbond</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">carbomer (polyacrylic acid)&#160; as Ophthalmic gel</td>
			<td style="width:277px;">Novartis</td>
			<td style="width:229px;">Viscotears Liquid Gel</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:392px;">Human Normal Immunoglobulin</td>
			<td style="width:277px;">Gammaplex</td>
			<td style="width:229px;">10g vial</td>
			<td style="width:480px;">100 ml/mouse intravenously, 30 min before infusion of specific antibody.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:392px;">NT-QTracker</td>
			<td style="width:277px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:229px;">Q21021MP</td>
			<td style="width:480px;">Vessel-pooling agent. Administrate 15 ml/mouse intravenously 5 min before imaging.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">AF488-hCD45</td>
			<td style="width:277px;">Biolegend</td>
			<td style="width:229px;">304017</td>
			<td style="width:480px;">100 ml/mouse intravenously, 30 min before imaging.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">FITC-hCD31</td>
			<td style="width:277px;">BD Pharmigen</td>
			<td style="width:229px;">555445</td>
			<td style="width:480px;">100 ml/mouse intravenously, 30 min before imaging.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Super glue</td>
			<td style="width:277px;">Loctite&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Super Glue</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Micro-Drill Kit</td>
			<td style="width:277px;">IDEAL - Fisher Scientific</td>
			<td style="width:229px;">NC9010016</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microsurgical microscope</td>
			<td style="width:277px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:480px;">No specific brand/company is adviced.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:392px;">LSM 710 NLO</td>
			<td style="width:277px;">Zeiss</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:480px;">Upright confocal microscope with motorized stage, two-photon laser and 20x 1.0 NA water immersion lens. Alternatively, a microscope with similar specifications could be used.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:392px;">MaiTai &#8220;High Performance&#8221; fully automated 1-box 517 mode-locked Ti:Sapphire laser with DeepSee dispersion compensation</td>
			<td style="width:277px;">&#160;Spectra-Physics</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%&#160;</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:229px;">HT501128</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Ethanol</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:229px;">32294</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Osteosoft</td>
			<td style="width:277px;">Millipore</td>
			<td style="width:229px;">1.01728.1000</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Polysine slices</td>
			<td style="width:277px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:229px;">J2800AMNZ</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:392px;">Antigen unmasking solution</td>
			<td style="width:277px;">Vector</td>
			<td style="width:229px;">H-3300</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C. Dilute 1:100 in H2O for working solution.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Triton 100x</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:229px;">T9284</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:229px;">A96470</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Normal Goat serum (NGS)</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:229px;">G9023</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Endomucin Antibody</td>
			<td style="width:277px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:229px;">sc-65495</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">hVimentin antibody</td>
			<td style="width:277px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:229px;">sc-6260</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">hCD31 antibody</td>
			<td style="width:277px;">DAKO</td>
			<td style="width:229px;">M0823</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">hCD45 antibody</td>
			<td style="width:277px;">DAKO</td>
			<td style="width:229px;">M0701</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">ADRP (Perilipin2)</td>
			<td style="width:277px;">antibodies-online</td>
			<td style="width:229px;">ABIN283918</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="59" style="height:59px;width:392px;">Goat anti mouse secondary antibodies</td>
			<td style="width:277px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:229px;">A11029 or A11005</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:392px;">Goat anti Rabbit secondary antibodies</td>
			<td style="width:277px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:229px;">A11037 or A11008</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Goat anti Rat secondary antibodies</td>
			<td style="width:277px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:229px;">A11007 or A21247</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:392px;">Sudan Black</td>
			<td style="width:277px;">Sigma</td>
			<td style="width:229px;">S2380</td>
			<td style="width:480px;">Prepare a stock of 1% sudan black in ethanol 70%. Store at RT. Prepare working solution of 0.1% sudan black in ethanol 70% and filter using filter-paper before use.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:392px;">DAPI</td>
			<td style="width:277px;">Sigma</td>
			<td style="width:229px;">D8417</td>
			<td style="width:480px;">Prepare stock in H20 at 100 mg/mg. Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Fluorescent mounting media</td>
			<td style="width:277px;">Dako</td>
			<td style="width:229px;">S3023</td>
			<td style="width:480px;">Add DAPI before use (1:400 from DAPI stock).</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Cover glass</td>
			<td style="width:277px;">VWR</td>
			<td style="width:229px;">631-0147</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioengineering of humanized bone marrow microenvironments in mouse and their visualization by live imaging

Человеческие гемопоэтические стволовые клетки (HSC) находятся в нише костного мозга (BM), сложной многофакторной сети компонентов, продуцирующих цитокины, факторы роста и внеклеточный матрикс. Способность HSC оставаться спокойным, самовосстанавливаться или дифференцироваться, приобретать мутации и становиться злокачественными, зависит от сложных взаимодействий, которые они устанавливают с различными стромальными компонентами. Чтобы наблюдать перекрестные помехи между человеческими HSC и человеческой нитью человека в физиологических и патологических состояниях, мы разработали протокол для эктопической модели и изображения гуманизированной ниши BM у иммунодефицитных мышей. Мы показываем, что использование различных клеточных компонентов позволяет формировать гуманизированные структуры и возможность поддерживать долгосрочное кроветворное кроветворение человека. Используя двухфотонную микроскопию, мы можем жить-изображать эти структуры in situ при разрешении одной ячейки, обеспечивая мощный новый инструмент для функциональной характеристики человеческого BM mМикроокружение и его роль в регуляции нормального и злокачественного гемопоэза.

На рисунке 1 показаны типичные изображения процессов посева и имплантации ячеистых клеток. На рисунке 1C обратите внимание, что клетки вводятся непосредственно в эшафот. На рисунке 1G обратите внимание, что надрез сделан в задней части мыши, где создается подкожный карман и имплантируется каркас. На рисунке 2 показана общая морфология различных лесов, имплантированных у мышей NSG и полученная через 8 недель. Обратите внимание на небольшую васкуляризацию в посевных лесах hMSC ( рисунок 2A ). Совместное поселение человеческих EC с hMSC на эшафоте позволяет формировать более значимую сосудистую сеть в лесах ( рис. 2B ). Наконец, присутствие rhBMP-2 вызывает образование костей. В этом случае извлекаемые строительные леса больше, и они состоят изКости, напоминающие твердые ткани. На рисунке 3 показана настройка конфигурации канала на микроскопе для прямой видимости с помощью NDD (подробности в легенде). Рисунок 4 и Видео 1 показывают человеческие гемопоэтические клетки в hMSC-покрытых лесах. Леса были эксплантированы через 8 недель после имплантации и после внутривенной инокуляции антитела AF488-hCD45 и 655-VPA. Эта процедура позволяет визуализировать имплантированные гемопоэтические клетки человека и сосудистую структуру с помощью двухфотонной конфокальной микроскопии. В этом случае на изображениях показаны кровеносные сосуды (655-VPA) на каркасах и долгосрочное приживление гемопоэтических клеток человека (AF488-hCD45) в паренхиме лесов. Рисунок 5 и Видео 2 соответствуют человеческим каркасам, засеянным hECs и hMSC. Через 8 недель после операции, каркасы были эксплантированы после внутривенногоИнокуляция антитела FITC-hCD31 и 655-VPA, и изображения были получены с помощью двухфотонного конфокального микроскопа, как упоминалось ранее. Изображения показывают участие hECs в образовании сосудов в эшафоте, что приводит к химерной сосудистой сети мыши. На фиг.6А показаны репрезентативные данные о подходе, используемом для стимуляции образования костей в каркасах MSC. Как и в предыдущих рисунках, через 8 недель после имплантации была проведена внутривенная инокуляция 655-VPA, были извлечены строительные леса, и изображения были получены с помощью двухфотонной конфокальной микроскопии. RhBMP-2-стимулированные леса вызывают образование костной ткани, которая может быть визуализирована из-за SHG (голубой цвет на изображениях), обеспечиваемый кальцием в кости. Представленные изображения также показывают образование полостей и васкуляризированной эндостиальной ткани, которые очень напоминают эндостеалярную ткань BM. На рисунке 6B </sTrong&gt; и Video 3 , hECs были совместно имплантированы hMSC. Леса извлекались после внутривенной инокуляции антитела FITC-hCD31 и 655-VPA, а изображения с двумя фотонными конфокальными микроскопами показывали участие hECs в неоваскуляризации в костно-формирующем лесу. На рисунке 7 показаны репрезентативные изображения гистологии, процедура, выполняемая для подтверждения ранее описанных результатов. Иммунофлуоресцентные изображения показывают мышечную сосудистую сеть, hECs, hMSC и долгосрочные привитые человеческие гемопоэтические клетки в структурах лесов. Леса, полученные от мышей, фиксировали и использовали для иммунофлюоресценции. В каркасно-несущих каркасах rhBMP-2 ( рис. 7D- F ) обратите внимание на морфологию ткани, напоминающую зрелый костный мозг с жировой тканью. В этом костно-формирующем эшафоте мы показываем, что hMSC представляют собой фибробласты, которые указывают на tОни вносят вклад в новообразованную ткань в виде стромальных клеток. Мы также показываем экспрессию маркера человека adipocyte, что указывает на то, что hMSC также способствуют образованию жировой ткани. <img alt="Рисунок 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig1.jpg" /> Рисунок 1. Репрезентативные изображения процессов высева клеток и имплантации. A) Начальный эшафот и его метод резания с использованием скальпеля. B) 24 штуки, полученные на первоначальном эшафоте. C) Метод посева ячеистых клеток с использованием шприца. D) Ячеистые леса с культуральной средой, готовые к имплантации. EF). Конкретные шаги для костно-формирующих лесов: E) каркас переносится на 96-луночный планшет u-bottom и F) репрезентативное изображение метода, используемого для добавления rhchMP2, тромбина и фибриногена к эшафоту. GJ) Сурги<html> Калорийную имплантацию под общей анестезией: G) рану, созданную при имплантации кожи и каркаса, метод имплантации H) и процедуру закрывания раны IJ с использованием хирургического клея. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig1large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a> <img alt="фигура 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig2.jpg" /> Рисунок 2. Различные леса, полученные из мышей. Репрезентативные изображения лесов MSC (слева), лесов MSC + EC (средний) и лесов MSC + EC + BMP (справа). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig2large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a> 4 / 55914fig3.jpg &quot;/&gt; Рисунок 3. Конфигурация канала. Отображается настройка фильтра микроскопа. A) Существует четыре блока детекторов NDD: в первом модуле имеется два куба фильтра; Второй и третий модули имеют по одному кубику фильтра; И последний модуль не имеет куба (не используется). Первая фотоумножитель (PMT) предназначена для дальнего красного канала (640-690 нм), отражающего более низкие длины волн; Следующие - 380 - 485 нм, 500 - 550 нм и 555 - 625 нм (порядок всегда от нижних до более высоких длин волн). B) Выбросы флуорофора, обнаруженные с помощью вышеуказанных конфигураций (с цветовой кодировкой). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig3large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a> <img alt="Рисунок 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig4.jpg" /> Рисунок 4. MSC Scaffold<html> S Позволяют формировать нишу для гематопоэтических клеток человека. A) и B) 3D-реконструкции Z-стеков, взятых после эксплантации, после внутривенной инокуляции AF488-hCD45 (зеленый), для маркировки гемопоэтических клеток человека и 655-VPA (пурпурный) m для маркировки сосудистой сети. Шкалы шкалы представляют собой 20 мкм в A и B (верхние панели) и 5 ​​мкм в B (нижние панели). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig4large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a> <img alt="Видео 1" src="/files/ftp_upload/55914/55914video1.jpg" /> Видео 1. Леса MSC позволяют формировать нишу для гемопоэтических клеток человека . 3D-реконструкция гемопоэтических клеток человека (AF488-hCD45), связанная с сосудистой сеткой (655-VPA) в каркасе MSC (структуры коллагена: SHG, голубой). Каждый стек имеет размер 140 x 140 мкм.Ef = &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914video1.mov&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы загрузить.) <img alt="Рисунок 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig5.jpg" /> Рисунок 5. Участники ЕС участвуют в формировании гуманизированных сосудов в строительных лесах MSC. 3D-реконструкция сосудистой сети (655-VPA), выровненная EC человеческого происхождения (FITC-hCD31) в каркасах MSC + EC. Шкала шкалы составляет 20 мкм. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig5large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a> <img alt="Видео 2" src="/files/ftp_upload/55914/55914video2.jpg" /> Видео 2. EC-участники ЕС участвуют в формировании гуманизированных сосудов в строительных лесов MSC. 3D-реконструкция человеческих EC (FITC-hCD31), выровняющая va<html> Sculature (655-VPA) в каркасах MSC + EC. Каждый стек имеет размер 240 x 240 мкм. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914video2.mov" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы загрузить.)</a> <img alt="Рисунок 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig6.jpg" /> Рисунок 6. Несущие леса rhBMP-2 имеют костные поверхности и гуманизированную сосудистую систему, сходную с костным мозгом. A) 3D-реконструкция каркасов MSC + BMP, показывающих образование костных структур (SHG-голубой) и сосудистой системы (655-VPA). Шкала шкалы составляет 100 мкм (слева), 70 мкм (средняя) и 50 мкм (справа). B) 3D-реконструкция лесов MSC + EC + BMP, показывающих гуманизированные сосуды (655-VPA), выровненные с человеческими EC (FITC-hCD31). Шкала шкалы представляет собой 50 мкм (слева) и 30 мкм (средний и правый).14 / 55914fig6large.jpg «target =&quot; _ blank &quot;&gt; Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. <img alt="Видео 3" src="/files/ftp_upload/55914/55914video3.jpg" /> Видео 3. У несущих каркасов rhBMP-2 есть костяные поверхности и гуманизированная сосудистая сеть, сходная с костным мозгом. 3D-реконструкция каркасов MSC + VERA + BMP (кость: SHG; сосуды: 655-VPA, человеческие EC: FITC-hCD31). Каждый стек имеет размер 600 x 600 мкм. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914video3.mov" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы загрузить.)</a> <img alt="Рисунок 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig7.jpg" /> Рисунок 7. Представительные изображения иммунофлюоресценции, выполненные на неподвижных строительных лесов. AF) Исследования иммунофлуоресценции, проведенные для определения местоположения клеток человека, имплантированных iN строительных лесов. AC) Леса, имплантированные hECs, hMSC и hHSC. DF) Костообразующие леса, имплантированные hECs, hMSC и hHSC. Цветные каналы следующие: AD) человеческий EC (hCD31) и сосудистая структура мыши (эндомуцин, ENDOM), BE) hMSCs (hVimentin, hVIM) и сосудистые клетки мыши (эндомуцин, ENDOM), C) гемопоэтические клетки человека (hCD45) И мышечная сосудистая сеть (эндомуцин, ENDOM) и F) человеческий белок дифференцировки жировой ткани (hADRP) и мышечная сосудистая сеть (эндомуцин, ENDOM). Шкала шкалы представляет собой 10 мкм (A и C), 20 мкм (B и E) и 40 (D и F) мкм. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig7large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging at JoVE.com

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Представлен метод создания и живого изображения различных гуманизированных нитей костного мозга у мышей. Основываясь на поддерживающей нише, созданной человеческими мезенхимальными клетками, добавление эндотелиальных клеток человека индуцирует образование сосудов человека, в то время как добавление rhBMP-2 индуцирует образование мышино-мышиной химерной зрелой костной ткани.

Биоинжиниринг гуманизированных микроуровней костного мозга в мышах и их визуализация с помощью Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix

Выделение мезенхимальных стволовых клеток человека и их культивировании на пористых Bone Matrix

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific ...

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells (MPCs) from Human Bone Marrow

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells MPCs from Human Bone Marrow

Разделительные Mesangiogenic клетки-предшественники (ПДК) из костного мозга человека

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel ...

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

In Vitro дифференциацию зрелых мышечных волокон для живых изображений

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Живой конфокальной визуализации Развития Arabidopsis Цветы

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Идентификация эритромиелоидных прародителей и их потомство в мышечном эмбрионе методом проточной цитометрии

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

В пробирке Выращивания яйцеклетку для Live клеточной Imaging зигота поляризации и кучность эмбриона в проростках Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Живая визуализация мышей

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

На основе RANKL остеокластов культуры Assay из мыши костного расследовать роль mTORC1 в формировании остеокластов

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Изоляция, культура и дифференцировки клеток стромы костного мозга и остеокластов прародителей от мышей

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Живые клетки изображений сегрегации хромосом в процессе митоза

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...