Name: bioengineering of humanized bone marrow microenvironments in mouse and their visualization by live imaging
Uploaded: 2017-08-01T15:00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging at JoVE.com

Vi tackar personalen i kärnanläggningarna vid Francis Crick Institute (Biologisk Forskningsfacilitet, In Vivo Imaging and Experimental Histopathology) och Yolanda Saavedra-Torres och Mercedes Sanchez-Garzon, veterinärerna vid Crick och LRI, för deras värdefulla hjälp. Vi är tacksamma för Dr. W. Gray för att kritiskt läsa manuskriptet. DP stöddes av ett icke-kliniskt stipendium från EHA. Detta arbete stöddes av The Francis Crick Institute, som mottar sin kärnfinansiering från Cancer Research UK (FC001045), UK Medical Research Council (FC001045) och Welcome Trust (FC001045).

Alla djurförsök utfördes under PPL 70/8904, godkänd av Storbritanniens hemkontor och i enlighet med Cancer Research UK-riktlinjer. Användningen av humant navelsträngsblod (UCB) och primära humant akut myeloid leukemi (AML) -prover godkändes av den etiska kommittén för östra London efter godkännande och genomfördes i enlighet med Helsingfors deklaration. 1. Bioengineering-kollagenbaserade byggnadsställningar med humana hematopoietiska och stromala celler OBS: Hela protokollet ska utföras i sterila förhållanden och med sterilt material. Cellodlingsmedium 1 motsvarar hMSC-medium (MEM-a, P / S och 10% hMSC-FBS); Cellodlingsmedium 2 motsvarar EC-medium (M199, 20% FBS, P / S, 10 mM HEPES, 50 | ig / ml heparin, 2 mM glutamin och 50 | ig / ml ECGS) och cellodlingsmedium 3 motsvarar hematopoietiskt cellmedium (H5100 Och P / S). <ol><li> Förbered navelsträngsblod mOnonukleära celler (CB-MNC) eller primära AML (benmärg eller perifera blod-MNC) med användning av en Ficoll-Paque densitetsgradient enligt väl etablerade protokoll 53 . <ol><li> För AML, tappa T-cellerna med hjälp av OKT.3-antikroppen. Inkubera 4 μg OKT.3 per 1 x 10 6 AML MNCs i 30 minuter vid rumstemperatur innan tvätten av cellerna i PBS. Om så erfordras cryopreserverar MNC: erna i FBS med 10% DMSO vid 2 x 10 ^ celler per ml. </li></ol></li><li> Förbered hMSC (odlingsmedium 1) och EC (odlingsmedium 2) cellkulturer. Placera hMSC-celler (se Materialetabell ) på vanliga cellodlingskolvar i hMSC-medium. Plate ECs (se materialet ) på kollagen 1-belagda ytor i EC-medium. </li><li> Vid 85-90% cellsammanflöde avlägsna mediet, tvätta två gånger med PBS, och tillsätt trypsin-EDTA-lösning (20 | il per cm 2). <ol><li> Efter 5 min, kontrollera att cellerna är fristående. Återställ cellerna genom att späda 1:3 med cellodlingsmedium. Centrifugera vid 300 xg under 5 min och suspendera i motsvarande medium för varje celltyp och räkna cellerna med en Neubauer-kammare. </li><li> Använd celler vid 2 x 10 6 - 10 7 celler per ml. Om båda celltyperna behöver användas tillsammans, blanda hMSC- och EC-suspensionerna i ett 1: 1-förhållande. </li></ol></li><li> Överför cellsuspensionen till en insulinspruta. </li><li> Med hjälp av en skalpell, skär den inledande ställningen (20 mm x 60 mm x 7 mm) av steriliserad gelatinssvamp ( t.ex. gelfoam) i 24 stycken av liknande storlek (6,6 mm x 7,5 mm x 7 mm, Figur 1A och B ). </li><li> Rekonstituera gelatinställningar genom nedsänkning i PBS (5 min). </li><li> En efter en sätta försiktigt ställningarna på en steril vävnad för att avlägsna överskott av PBS. Överför byggnadsställen till en brunn i en brunn med 24 brunnar (ultralåg fastsättningsyta) och använd sprutan för att injicera 50 μL innehållande 10 5 - 10 6 celler (hMSC alEn eller i kombination med hEC; Figur 1C ). </li><li> Upprepa steg 1.7 med varje byggnadsställning tills alla nödvändiga byggnadsställningar är sådda med stromala celler. </li><li> Inkubera i 1 timme i en cellodlings-inkubator (37 ° C och CO 2 5%). </li><li> Fyll varje brunn med 3 ml cellodlingsmedium 1 ( Figur 1D ) och returnera byggnadsställena till en cellodlings-inkubator (37 ° C och CO 2 5%) för inkubation över natten. Använd cellodlingsmedium 2 om ECs används i ställningarna. </li><li> Tina CB-MNCs och isolera CD34 + -celler från dem efter ett lämpligt CD34 + sektions kit protokoll. Stäng de valda CD34 + -cellerna i medium 3 och räkna dem i en Neubauer-kammare. OBS: Här användes celler i en koncentration av 2 x 106 celler per ml. <ol><li> Om AML-patientavledade primärprover används, tina cellerna, späd dem 1:10 i FBS, centrifugera dem i 5 minuter vid 300Xg, resuspendera cellerna i PBS-2% FBS, tillsätt anti-human CD3-antikropp (2 - 4 μg per 10 6 celler) och inkubera vid rumstemperatur i 30 minuter. Centrifugera i 5 minuter vid 300 xg och resuspendera i hematopoietiskt cellmedium kompletterat med cytokiner (20 ng / ml granulocytkolonistimulerande faktor (G-CSF), 20 ng / ml IL-3 och 20 ng / ml trombopoietin (TPO)) . </li></ol></li><li> Upprepa steg 1,7 - 1,9, men i detta fall frö 1 x 10 5 humana hematopoetiska celler i stället för stromala komponenter, som ovan. <ol><li> Fyll brunnen med 3 ml cellodlingsmedium 3 ( Figur 1D ) och returnera byggnadsställena till en cellodlingsinkubator (37 ° C och CO 2 5%) för inkubation över natten. Använd en 1: 1-blandning av cellodlingsmedia 2 och 3 Om ECs används i ställningarna. </li></ol></li><li> För endast rekombinanta humant benmorfogenetiska protein-2 (rhBMP-2) bärarställningar, lägg försiktigt byggnadsställena en efter en på en steril vävnad för att avlägsna överskott PBS. Överför byggnadsställen till en brunn i en u-bottenplatta med 96 brunnar ( Figur 1E ) och tillsätt 5 μL rhBMP-2, som täcker stallet noggrant. <ol><li> Tillsätt 20 μl trombin följt av 20 μl fibrinogen, täcker noga ställningen varje gång ( Figur 1F ). Upprepa proceduren för varje byggnadsställning tills alla nödvändiga byggnadsställningar behandlas och inkubera sedan i 5 - 10 min vid 37 ° C. Kontrollera om koagulering har lyckats bildas. </li></ol></li></ol> 2. Kirurgisk implantering av bioengineerad byggnadsställningar OBS! Här användes antingen man eller kvinna, 6- till 12 veckor gamla NSG-möss. Eftersom djuren är immunofrekventa bör alla förfaranden göras under sterila betingelser. Steg 2.10 - 2.13 är relaterade till överlevnadsstrategier och postkirurgisk vård. <ol><li> 60 - 120 min före operationen, administrera smärtstillande medel (carprofen, 5 mg / kg kroppsvikt / mus) subkutant.</li><li> Inducera anestesi i en kammare med 0,5% isofluran och 2 L / min O 2. Möss bör övervakas kontinuerligt under proceduren. Överför djuret till operationsområdet i benäget läge för att få lätt åtkomst till ryggen. Hålla djuret under anestesi med användning av en noskon föra 1,5% isofluran och 2 L / min O 2. Håll musen under anestesi under det kirurgiska förfarandet och kontrollera ofta djurtillståndet. </li><li> Medan den är under anestesi, använd ögonhaltig gel i ögon på musen för att förhindra torrhet och håll musen vid 37 ° C. </li><li> Rak bort det kirurgiska området på baksidan av musen med hjälp av en elektrisk trimmer. För att sterilisera huden, doppa en bomullsspets i utspädd clorexidin (utspädd 1:10 i PBS) och använd detta tips för att rengöra hudytan. Upprepa denna procedur två gånger. </li><li> Använd sterila tångar och en skalpell (eller sax), gör en 0,5 till 0,7 cm främre till bakre hela snittet av huden. Använd pincettinställningarnaUnder subkutan vävnad för att göra en ficka. </li><li> Sätt in byggnadsstället subkutant och se till att det är placerat djupt i fickan ( Figur 1G och H ). Stäng snittet med kirurgiskt lim ( Figur 1I och J ). </li><li> För behandling av postkirurgisk smärta, administrera subkutant buprenorfin (0,1 mg / kg kroppsvikt). </li><li> Under återhämtning placerar djuret på sin sida i en förvärmd bur och övervakar återhämtningen tills normalt beteende observeras. </li><li> Späd smärtstillande läkemedel i vatten (carprofen, 0,1 mg / ml vatten) och ge den till djur som dricksvatten i 4 dagar efter operationen. </li><li> Kontrollera djuret och såret ofta under 48 timmar efter operationen för möjliga biverkningar. </li></ol> 3. Musbehandlingar, eutanasi och provhämtning för bildbehandling OBS: Analys av byggnadsställningarna utförs mellan8 och 24 veckor efter implantation. <ol><li> 60 min före bildbehandling, håll den implanterade musen varm i en värmebox vid 37 ° C och administrera 100 μl humant immunoglobulin intravenöst för att blockera ospecificerade ställen. </li><li> 30 min före bildbehandling administrera intravenöst 10 μg (per mus) av specifika antikroppar för att märka cellerna av intresse. </li><li> 5 min före bildbehandling administrera intravenöst 15 μl (utspädd i 100 | il PBS) av 655 nm fluorofärmärkt, kärlpoolningsmedel (655-VPA) för att visualisera vaskulära strukturer. </li><li> Euthanize musen via cervikal dislokation. </li><li> Med en vass sax gör du ett longitudinellt snitt på huden på musens baksida, nära den ursprungliga implantationsplatsen. </li><li> Med hjälp av pincett och sax skar du noga av huden från den subkutana facken där ställningen har implanterats. </li><li> Håll stället med pincett och försiktigt utplanta det från huden genom att skära det kvarvarande membranet aNd vävnad som omger ställningen med hjälp av sax. Se exempel på byggnadsställningar som ska återvinnas i Figur 2 . </li><li> Säkra byggnadsstället med snabbverkande lim på en bildplatta (en 35 mm x 10 mm petriskål) och fyll i saltlösning (PBS) vid rumstemperatur. </li><li> För BMP-byggnadsställningar, före fyllning av plattan med PBS, använd en kirurgisk mikrodrill för att tunna benytan under ett mikrokirurgiskt mikroskop. Detta möjliggör fluoroforevisualisering och bildupptagning med hög upplösning. Använd antingen 1,2 eller 1,6 mm burrar, beroende på byggnadsstorleken. OBS: Användaren kommer att inse hur mycket som ska borras beroende på benets tjocklek. I allmänhet, eftersom BMP-ställningarna är vaskulära, kommer benet något att ändra färg och bli mer röd när den närmar sig rätt tjocklek för bildbehandling. </li><li> Sätt in plattan på scenen av det konfokala mikroskopet. </li></ol> 4. Live-imaging med två-photon Microscopiera OBS! Vid användning av icke-avkodade detektorer (NDD), använd alltid NDD-reglaget för bildbehandling för att rikta fluorescensen till NDD. Mikroskopkonfigurationen tillhandahålls i figur 3 . <ol><li> Slå på mikroskopet och datorn, starta programvaran genom att klicka på &quot;Starta system&quot; och gå till &quot;Acquisition&quot; -läget. </li><li> Markera rutan &quot;Visa manuella verktyg&quot;. I &quot;Laser&quot; -menyn slår du på tvåfotonlasern och låter den värma upp och stabilisera. </li><li> I menyn &quot;Imaging Setup&quot; aktiverar du samtidigt &quot;Channel Mode&quot; och &quot;Switch track every Frame.&quot; På menyn &quot;Light Path&quot; väljer du &quot;Non Descanned&quot; och &quot;Main Beam Splitter MBS 760+.&quot; Markera för att aktivera de fyra NDD: erna och ställ in konfigurationen enligt figur 3 . ANMÄRKNING: Med denna konfiguration kan kollagensignalen från benstrukturer (sekOnd harmonisk generation, SHG) samlas vid 380 - 485 nm, FITC-hCD31 + humana endotelceller och AF488-hCD45 + humana hematopoietiska celler vid 500-550 nm och 655-VPA vid 640-690 nm. </li><li> I menyn &quot;Kanaler&quot; ställer du in &quot;laservåglängden&quot; till 890 nm och effekten till 50%. Ställ in &quot;Gain (Master)&quot; till 500-600, &quot;Digital Offset&quot; till 0 och &quot;Digital Gain&quot; till 15 för varje kanal. Justera dessa värden när förvärvet har börjat. </li><li> I &quot;Acquisition Mode&quot; ställer du in de nödvändiga parametrarna för att få högupplösta bilder utan att skada vävnaden och bleka fluorophorerna. Ställ in skanningsläge till &quot;Frame&quot;, &quot;Frame Size&quot; till &quot;x512 y512,&quot; Line Step &quot;till 1,&quot; Speed ​​&quot;till 9,&quot; Averaging Number &quot;till 8,&quot; Bit Depth &quot;till&quot; 8 Bit &quot; Läge &quot;till&quot; rad, &quot;&quot; Direction &quot;till&quot; bidirectional &quot;och&quot; Method &quot;till&quot; mean. &quot; <ol><li> Ställ in &quot;ZoOm &quot;till 1 för den första skanningen av bilden, och öka den om det behövs för att fokusera på specifika områden. </li></ol></li><li> Placera plattan som innehåller byggnadsställningen på mikroskopsteget under 20X, 1.0 NA vattendämpningslinsen och sänk linsen tills den rör saltlösningen. Ställ in linsens fokus på ställningen med hjälp av mikroskopögon, med hjälp av en lampa som ljuskälla. </li><li> Aktivera &quot;Z-stack&quot; -menyn, välj funktionen &quot;Första / Senast&quot; och ställ in det önskade intervallet mellan två stycken sekvenser ( t.ex. 2-μm Z-stack). Håll intervallet konstant inom Z-stacken. </li><li> Välj &quot;Live&quot; för att bilda en direktsökning av provet och justera &quot;Digital Gain&quot; och &quot;Digital Offset&quot; för optimal exponering. För att visualisera flera kanaler samtidigt, välj &quot;Split&quot; -funktionen. </li><li> I &quot;Stage&quot; -menyn, i &quot;Live&quot; -läget, skanna bilden och &quot;Markera&quot; regionerna i interEst (ROI), såsom placeringen av humana hematopoietiska celler och vaskulära strukturer. När genomsökningen av provet är klar flyttar du till det första avkastningen för att starta bildbehandling. </li><li> I läget &quot;Live&quot; ställer du upp den övre och nedre delen av 3D Z-stacken kring området av intresse med funktionen &quot;Set first&quot; och &quot;Set last&quot;. När du är klar, ställ in mitten, &quot;C.&quot; Börja förvärvet av avkastningen med &quot;start experiment&quot; -knappen. Se exempel på bilder i Figur 4 , Figur 5 och Figur 6 . </li><li> När förvärvet är klart, spara bilden i den angivna mappen. Flytta till nästa avkastning och upprepa steg 4.10. När försöket är klart, ta bort bildplattan från mikroskopet, ta försiktigt av provet från plattan och rengör eventuellt kvarvarande lim. </li><li> Förbered provet för nästa analysteknik. </li></ol> 5. ProvprocessG för histologi och immunförstärkning OBS: Prover bearbetas enligt protokollet som beskrivs i JoVE generella laboratorietekniker 54 som beskriver provfixering, inbäddning och sektionsprocesser. Benformande prover ska behandlas i 7 dagar i ett EDTA-baserat avkalkningsmedel mellan fixerings- och inbäddningsförfarandena. Blockerings / permeabiliseringslösningen är 10 mM PBS pH 7,4 buffert med 1% Triton X-100, 1% bovint serumalbumin (BSA) och 10% normalt get serum (NGS). <ol><li> Sätta skivorna i xylen i 10 min), xylen under 5 min, 100% etanol under 5 min, 70% etanol under 5 min, 50% etanol under 5 min, och H 2 O för 5 min. </li><li> Överför skivorna till en citratbaserad antigenlösningslösning. </li><li> Koka skivorna i 15 minuter och låt dem svalna till rumstemperatur. </li><li> Tvätta skivorna i 10 mM PBS pH 7,4 lösning med 1% Triton X-100 (5 min, 3 gånger). </li><li> Överför samPles till blockerings / permeabiliseringslösningen och inkubera i 30 min. </li><li> Tillsätt primär antikropp utspädd i blockerings / permeabiliseringslösning och inkubera över natten vid 4 ° C. </li><li> Tvätta skivorna i 10 mM PBS pH 7,4 lösning med 1% Triton X-100 (5 min, 3 gånger). </li><li> Tillsätt sekundär antikropp utspädd i blockerande / permeabiliseringslösning under 1 timme i mörkret vid rumstemperatur. </li><li> Tvätta med H 2 O (5 min, 3 gånger). </li><li> För att minska bakgrundsfluorescensen, sänk skivorna i Sudan Black arbetslösning i 10 minuter, i mörkret och vid rumstemperatur. </li><li> Tvätta skivorna i H 2 O (5 min, 3 gånger). </li><li> Montera skivorna med hjälp av fluorescerande monteringsmedium med DAPI (0,5 μg / ml). </li><li> Lagra skivorna vid 4 ° C och kontrollera att monteringsmediet är torrt innan du utför fluorescerande avbildning. Se exempel på bilder i Figur 7 . </li></ol>

Författarna har ingenting att avslöja.

<html> Betydelse med befintliga metoder: I detta protokoll beskrev vi en metod för att generera olika humaniserade mikromiljöer i möss och att visualisera sin arkitektur via tvåfotonmikroskopi och histologi. De angivna representativa uppgifterna visar möjligheten av tillvägagångssättet, med användning av olika stromceller för att manipulera humaniserade vävnader. Protokollet har specifika tillämpningar på studien av humana hematopoietiska celler och benmärgs nisch-härledda celler under normala och patologiska förhållanden. Dessa applikationer innefattar studien av klonal evolution, läkemedelsscreening och crosstalk mellan humana HSC och stromala komponenter. I det framväxande området för vävnadsteknik har flera alternativa tillvägagångssätt föreslagits. Tillvägagångssätt för notering innefattar utvecklingen av 3D humaniserade BM-strukturer in vitro 55 , 56 , 57 ,S = &quot;xref&quot;&gt; 58 , 59 , 60 , 61 , 62 , 63 och det ortopotopiska implantatet av humaniserade BM-byggnadsställningar i möss 64 . Vårt tillvägagångssätt har fördelen att kombinera både komplexiteten hos in vivo- systemet med den lättanatomiska tillgängligheten hos det humaniserade vävnadstransplantatet. Ändringar och felsökning: En variabelkälla i detta protokoll finns i valet av celler som används för att frösta byggnadsställena. I vårt arbete använde vi BM-härledda hMSCs. Mesenkymceller kan emellertid erhållas från flera vävnader, vilka kan uppvisa särskiljande egenskaper beroende på ursprunget. Därför kan användningen av hMSC som härrör från olika organ beaktas. Emellertid bör deras förmåga att bilda benvävnad in vivo testas före användning i denna pRotokoll. Detta protokoll använder en kommersiellt tillgänglig human endotelcellerkälla ( dvs. E4ORF1-transducerad HUVEC). Nyligen har användningen av organspecifika endotelceller för olika ändamål rapporterats 65 , 66 . Vidare kan användningen av primära hEC härledda från BM representera en intressant förbättring av protokollet. Därför kan användningen av olika källor av endotelceller ge olika in vivo- resultat. Vi använde NSG-immunkompromitterade mottagande möss för att gynna implantationen av humaniserade byggnadsställningar och för att undvika vävnadsavstötning. Vi utesluter inte möjligheten att använda detta protokoll för att konstruera ektopiska benmärgsvävnader i andra musstammar. I själva verket kan rhBMP-2 inducera benbildning i olika däggdjursmodeller 47 , 48 , 49 , 50 <sup&gt;, 52 . Däremot kan skillnader i cellleabilitet och långtidstransplantation observeras med olika stammar / modeller. Tidpunkten för byggnadsåterställning kan också vara flexibel, beroende på experimentets slutliga syfte. I det presenterade protokollet återställer vi prover vid 8 - 12 veckor efter implantation för att bedöma långvarig hematopoietisk engraftment. För att studera tidiga steg i den humana BM-nischedningen ( t.ex. osteokondral vävnadsbildning 47 eller vaskulär utveckling) kan olika tidspunkter väljas. Den levande bildteknik som vi beskrivit i detta protokoll är indikerad för kortvarig bildbehandling av explanter. Användningen av en jämviktad kammare för att upprätthålla fysiologisk temperatur, syrspänning och CO 2 -koncentration bör övervägas vid långvarig avbildning, såsom att studera motilitetsbeteenden. Kritisk StEps inom protokollet: Bland de utmaningar som är relaterade till protokollet framhävs de tekniska färdigheter som krävs för några steg. Mesenkymala och endotelceller bör användas vid lågcellspassagerantal; Annars kommer de inte att kunna stödja humant hematopoietisk cell engraftment in vivo eller att delta i de novo vaskulatur och benbildning in vivo . Vi rekommenderar användning av hMSCs och hECs vid passagerna 1 - 5. Förberedelser av städe och cellsåtning kräver grundläggande cellkultur färdigheter och kunskap om egenskaperna hos de specifika celler som används i proceduren. Operationsprotokollet är ganska enkelt men kräver viss övning. Underhåll av en aseptisk miljö för att undvika kontaminering av de implanterade ställningarna i immunoförmögen möss är avgörande för att försökets framgång ska lyckas. Provplanta och levande bildbehandling kräver kirurgisk praxis (speciellt för användning av mikrodrill) och kunskap omMikroskop system. Slutligen kräver provbehandling och histologi grundläggande kunskaper om de tekniker som ska användas. Begränsningar av tekniken: Tillvägagångssättet beskriver vi möjliggör visualisering av levande humana hematopoietiska celler som sårar en humaniserad benmärgsmikro-miljö, med mänskliga endotelceller som bildar vaskulära strukturer och mesenkymceller som bildar ben / benmärgsutrymme. När vävnaden bildas in vivo , kommer den slutgiltiga byggnadsställningen fortfarande att vara chimär (human och murin). Denna fråga bör beaktas, eftersom den chimära vävnaden kanske inte fullständigt efterliknar mänsklig benmärgskomplexitet och miljö. Plåtarna implanterade har en begränsad storlek (vi försökte maximalt 6,6 x 7,5 x 7 mm) och kan därför vara värd för ett begränsat antal celler för xenotransplantation. Det absoluta antalet återvunna celler kommer också att vara begränsat; Således bör antalet implanterade byggnadsställningarBeräknas som en funktion av antalet celler som krävs för experimentet. Den avbildningsapplikation som vi beskrivit är speciellt användbar för att observera stora områden av levande vävnad vid djup 150-200 um från ytan utan att störa arkitekturen och skada cellerna. Därför tillåter det inte visualisering av hela ställningen. Om en fullständig avsökning av vävnaden är nödvändig skulle vanliga immunofluorescensmetoder vara mer lämpliga. Framtida applikationer: Den framtida riktningen för denna biotekniska modell skulle vara att öka komplexiteten hos de humana komponenterna i vävnaden. Kunskapen och karakteriseringen av den mänskliga BM-nischen har utvecklats under de senaste åren 67 och det beskrivna protokollet kan vara en intressant plattform för att studera funktionen hos dessa nya cellulära komponenter och lösliga faktorer, liksom deras roll i att stödja normal / malignAnt HSCs. Vidare ger bildteknik potentialen för intravital bildbehandling av byggnadsställningarna i longitudinella studier, vilket skulle kräva tekniska förbättringar för att avbilda byggnadsställningarna i levande, bedövade möss med återvinning efter kirurgi. Detta tillvägagångssätt skulle kräva ytterligare steg och undersöks för närvarande i laboratoriet.

Cellbeslutsbeslut som observeras i stamcellerna regleras tätt av både inneboende och extrinsiska faktorer. I synnerhet är det nu allmänt erkänt att BM-mikromiljön spelar en grundläggande roll vid styrning av omkopplaren i HSCs från en vila till ett aktivt tillstånd, såväl som i deras självförnyelse eller differentierings ödet 1 . Vidare visar nya fynd att hematologiska maligniteter påverkar BM-mikromiljöns funktion, vilket pekar på förekomsten av aktiv korsning mellan de två facken 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Trots de senaste framstegen kvarstår många viktiga frågor om hur aktiviteten av specifika BM-nischkomponenter bidrar till HSC-beteende och malign transformation. BM mikromiljö är en mycket heterogent<html> Enous och komplex blandning av många olika celltyper, var och en med specialiserade funktioner. Den rikliga endoteliala (EC) och vaskulära komponenten reglerar omsättning av näringsämnen och metaboliter, ingressen och utgången från olika celler till och från BM och flera HSC-funktioner 7 , 8 . Mesenkymala stromceller (MSC), en heterogen population av odifferentierade stamceller och föregångare begåtta genom tre olika linjer ( dvs osteogen, kondrogent, adipogen) är en annan grundläggande del av BM-nischen. Dessa MSC lokaliserar både i centrala områden av BM och i närheten av endosteal regionen. De kan vara associerade med vaskulära strukturer och är inblandade i regleringen av HSC-funktionen 9 , 10 , 11 , 12 , 13 ,&quot;&gt; 14 , 15 . Många rapporter tyder på att HSCs bor i olika definierade platser inom margen och att deras funktion kan bero på deras exakta lokalisering. De flesta av den nuvarande kunskapen om HSCs och deras interaktion med BM mikromiljö härrör från murina studier 1 . Användningen av xenograftmodeller har utökat denna kunskap till humana normala och maligna HSCs, engrafting inom murin BM av immunbristande möss 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . Även om detta representerar en giltig modell, presenterar den fortfarande många utmaningar, såsom behovet att betinga mottagarmusen i de flesta fall för att tillåta humant HSC-homing och engraftment eller cross-species barriären och dess dåligt förstådda inflytande på cell-cell-interaktioner och funktioner. Användningen av neutraliserande antikroppar och genetiskt modifierade möss, tillsammans med xenotransplantation, har bidragit till att markera den komplexa dialog som mänskliga HSCs etablerar med sina mikroenheter. Introduktionen och utvecklingen av intravital två-foton-konfokalmikroskopi har flyttat dessa studier ett steg framåt, vilket möjliggör direkt, högupplösning och dynamisk bildbehandling av benmärgen 19 , 20 , 21 , 22 och ger ett kraftfullt verktyg för funktionell Karakterisering av BM mikromiljö och dess roll vid reglering av HSC-funktionen. För att kringgå några av de problem som uppstår i klassiska xenotransplantationsmodeller har begreppet teknik en humaniserad BM-struktur tagits fram. Sammanslagning av biomaterial och cellimplantationskoncept, rapporter har visat möjligheten att efterlikna humant benmPilmikromiljö i heterotopområdena 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . Detta öppnar möjligheten att använda bioengineering i musmodeller för att studera human normal och malign hematopoiesis 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , tumörgenes och metastaser 40 , 41 , 42 , 43, 44. Baserat på tidigare erfarenhet av benvävnadsteknik och in vivo- bildbehandling 19 , 22 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50 , 51 , 52 beskriver vi ett protokoll till bioengineer och levande bildorganotiska humana BM-vävnader. Dessa strukturer härrör från implanteringen av humana BM-härledda stromaceller till kollagenbaserade ställningar subkutant ympade i immunbristande möss. I en tidigare rapport visade vi att mänskliga MSC säkerställer bildandet av en human mikromiljö som är tillräcklig för engraftment av humana hematopoetiska celler 45 . Dessutom beskriver vi hur samimplantationen av andra humana BM-cellkomponenterS, såsom humana endotelceller (hEC) och / eller cytokiner som är viktiga för benbildning ( t.ex. hBMP2), samarbetar med hMSCs för att generera olika humaniserade mikromiljöer, som kan vara levande avbildade in situ .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1378">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Ficoll-Paque</td>
			<td style="width:277px;">Ge Healthcare</td>
			<td style="width:229px;">17-1440-03</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Cd34 positive selection Kit</td>
			<td style="width:277px;">Stemcell</td>
			<td style="width:229px;">18056</td>
			<td style="width:480px;">Store a 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Magnet</td>
			<td style="width:277px;">Stemcell</td>
			<td style="width:229px;">18000</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Anti-human CD3 antibody, clone OKT-3</td>
			<td style="width:277px;">Bioxcell</td>
			<td style="width:229px;">BE0001-2</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4&#176;C. Used for T cell depletion in primary AML samples.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:392px;">Cytokines (IL3, G-CSF, and TPO)</td>
			<td style="width:277px;">PeproTech</td>
			<td style="width:229px;">200-03, 300-23 and 300-18</td>
			<td style="width:480px;">For doing the stock: Dilute each one of the cytokines in 100&#956;L of water and mix them. Add 200&#956;L, do alicuots of 45&#956;L and Store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">DMSO</td>
			<td style="width:277px;">Sigma</td>
			<td style="width:229px;">D4540</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:392px;">FBS</td>
			<td style="width:277px;">Life technologies</td>
			<td style="width:229px;">10270106</td>
			<td style="width:480px;">Heat-inactivate at 56&#176;C during 30 minutes, do aliquots and freeze down. Warm in 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">MEM-&#945;</td>
			<td style="width:277px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:229px;">32571-028</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4&#176;C. Warm in 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Myelocult H5100</td>
			<td style="width:277px;">corning</td>
			<td style="width:229px;">5100</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4&#176;C. Warm in 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">199</td>
			<td style="width:277px;">Gibco</td>
			<td style="width:229px;">41150-020</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4&#176;C. Warm in 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:392px;">hMSC-FBS, Heat-inactivated</td>
			<td style="width:277px;">Gibco</td>
			<td style="width:229px;">12662-029</td>
			<td style="width:480px;">Store at -20&#176;C. Warm in 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">P/S</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:229px;">P0781</td>
			<td style="width:480px;">Store at -20&#176;C. Warm in 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">ECGS</td>
			<td style="width:277px;">Millipore</td>
			<td style="width:229px;">02-102</td>
			<td style="width:480px;">Dilute in culture media and use 0.22 mm filter.</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:392px;">HEPES</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:229px;">S1558-50ML</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Heparin</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:229px;">H3149</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Glutamine</td>
			<td style="width:277px;">Gibco</td>
			<td style="width:229px;">25030</td>
			<td style="width:480px;">Store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Collagen 1 coated cell culture plate</td>
			<td style="width:277px;">corning</td>
			<td style="width:229px;">354505</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:277px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:229px;">25200056</td>
			<td style="width:480px;">Store at -20&#176;C. Warm in 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:392px;">hMSC</td>
			<td style="width:277px;">Lonza</td>
			<td style="width:229px;">PT-2501</td>
			<td style="width:480px;">Alternatively, hMSCs we also kindly provided by Dr. Dosquet (University Paris Diderot, Paris) from human bone marrow obtained during orthopaedic surgery under ethical approval 10-038 from IRB00006477.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">VeraVec HUVEC endothelial cells</td>
			<td style="width:277px;">Angiocrine bioscience</td>
			<td style="width:229px;">hVera101</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:392px;">Human hematopoietic cells</td>
			<td style="width:277px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:480px;">Umbilical Cord blood or primary Acute Myeloid Leukemia (AML) samples were obtained from the Royal London Hospital (London, UK) after informed consent and protocol of use was approved by the East London Ethical Committee and carried out in accordance with the Declaration of Helsinki.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:392px;">Gelfoam, Size 12-7mm</td>
			<td style="width:277px;">Pfizer</td>
			<td style="width:229px;">00009-0315-08</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">PBS</td>
			<td style="width:277px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:229px;">10010023</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Surgical material</td>
			<td style="width:277px;">Multiple</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:480px;">Sterile forceps, tweezers and sharp scissors.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Sterile tissues</td>
			<td style="width:277px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:480px;">Heat-sterilize paper tissues.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">1 ml Syringe with needle of 25G</td>
			<td style="width:277px;">Terumo</td>
			<td style="width:229px;">SS+01H25161</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:392px;">Ultra Low Attachment Multiple Well Plates</td>
			<td style="width:277px;">Corning</td>
			<td style="width:229px;">3473 or 3471</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">BMP2</td>
			<td style="width:277px;">Noricum</td>
			<td style="width:229px;">rhBMP-2</td>
			<td style="width:480px;">Dilute at 5 mg/ml in acetic acid 50 mM and store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:392px;">Thrombin</td>
			<td style="width:277px;">Sigma</td>
			<td style="width:229px;">T9010</td>
			<td style="width:480px;">Dilute in CaCl2 2%, 500 mL per vial, and store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:392px;">Fibrinogen</td>
			<td style="width:277px;">Sigma</td>
			<td style="width:229px;">F3879</td>
			<td style="width:480px;">Dilute at 4 mg/100 mL in PBS. Store at -20C. Warm before use.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:392px;">Tissue-culture dishes 35 mm x 10 mm</td>
			<td style="width:277px;">Falcon</td>
			<td style="width:229px;">353001</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:392px;">U-Botton 96 well plate</td>
			<td style="width:277px;">Falcon</td>
			<td style="width:229px;">353077</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:392px;">NSG mice</td>
			<td style="width:277px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:229px;">5557</td>
			<td style="width:480px;">NSG mice were a kind gift from Dr Leonard Shultz (The Jackson Laboratory).</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Chlorhexidine</td>
			<td style="width:277px;">G9</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:480px;">Dilute 1:10 before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Carprofen</td>
			<td style="width:277px;">Pfizer</td>
			<td style="width:229px;">Rimadyl</td>
			<td style="width:480px;">5 mg/g of mouse</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Buprenorphine</td>
			<td style="width:277px;">Alstoe</td>
			<td style="width:229px;">Vetergesic</td>
			<td style="width:480px;">0.1 mg/g of mouse body weight</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:277px;">Abbott</td>
			<td style="width:229px;">B506</td>
			<td style="width:480px;">Induction of anaesthesia 2%, maintenance 1%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Trimmer</td>
			<td style="width:277px;">Wella</td>
			<td style="width:229px;">Contura HS61</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Surgical glue</td>
			<td style="width:277px;">3M</td>
			<td style="width:229px;">Vetbond</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">carbomer (polyacrylic acid)&#160; as Ophthalmic gel</td>
			<td style="width:277px;">Novartis</td>
			<td style="width:229px;">Viscotears Liquid Gel</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:392px;">Human Normal Immunoglobulin</td>
			<td style="width:277px;">Gammaplex</td>
			<td style="width:229px;">10g vial</td>
			<td style="width:480px;">100 ml/mouse intravenously, 30 min before infusion of specific antibody.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:392px;">NT-QTracker</td>
			<td style="width:277px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:229px;">Q21021MP</td>
			<td style="width:480px;">Vessel-pooling agent. Administrate 15 ml/mouse intravenously 5 min before imaging.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">AF488-hCD45</td>
			<td style="width:277px;">Biolegend</td>
			<td style="width:229px;">304017</td>
			<td style="width:480px;">100 ml/mouse intravenously, 30 min before imaging.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">FITC-hCD31</td>
			<td style="width:277px;">BD Pharmigen</td>
			<td style="width:229px;">555445</td>
			<td style="width:480px;">100 ml/mouse intravenously, 30 min before imaging.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Super glue</td>
			<td style="width:277px;">Loctite&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Super Glue</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Micro-Drill Kit</td>
			<td style="width:277px;">IDEAL - Fisher Scientific</td>
			<td style="width:229px;">NC9010016</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microsurgical microscope</td>
			<td style="width:277px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:480px;">No specific brand/company is adviced.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:392px;">LSM 710 NLO</td>
			<td style="width:277px;">Zeiss</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:480px;">Upright confocal microscope with motorized stage, two-photon laser and 20x 1.0 NA water immersion lens. Alternatively, a microscope with similar specifications could be used.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:392px;">MaiTai &#8220;High Performance&#8221; fully automated 1-box 517 mode-locked Ti:Sapphire laser with DeepSee dispersion compensation</td>
			<td style="width:277px;">&#160;Spectra-Physics</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%&#160;</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:229px;">HT501128</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Ethanol</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:229px;">32294</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Osteosoft</td>
			<td style="width:277px;">Millipore</td>
			<td style="width:229px;">1.01728.1000</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Polysine slices</td>
			<td style="width:277px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:229px;">J2800AMNZ</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:392px;">Antigen unmasking solution</td>
			<td style="width:277px;">Vector</td>
			<td style="width:229px;">H-3300</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C. Dilute 1:100 in H2O for working solution.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Triton 100x</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:229px;">T9284</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:229px;">A96470</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Normal Goat serum (NGS)</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:229px;">G9023</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Endomucin Antibody</td>
			<td style="width:277px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:229px;">sc-65495</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">hVimentin antibody</td>
			<td style="width:277px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:229px;">sc-6260</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">hCD31 antibody</td>
			<td style="width:277px;">DAKO</td>
			<td style="width:229px;">M0823</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">hCD45 antibody</td>
			<td style="width:277px;">DAKO</td>
			<td style="width:229px;">M0701</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">ADRP (Perilipin2)</td>
			<td style="width:277px;">antibodies-online</td>
			<td style="width:229px;">ABIN283918</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="59" style="height:59px;width:392px;">Goat anti mouse secondary antibodies</td>
			<td style="width:277px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:229px;">A11029 or A11005</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:392px;">Goat anti Rabbit secondary antibodies</td>
			<td style="width:277px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:229px;">A11037 or A11008</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Goat anti Rat secondary antibodies</td>
			<td style="width:277px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:229px;">A11007 or A21247</td>
			<td style="width:480px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:392px;">Sudan Black</td>
			<td style="width:277px;">Sigma</td>
			<td style="width:229px;">S2380</td>
			<td style="width:480px;">Prepare a stock of 1% sudan black in ethanol 70%. Store at RT. Prepare working solution of 0.1% sudan black in ethanol 70% and filter using filter-paper before use.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:392px;">DAPI</td>
			<td style="width:277px;">Sigma</td>
			<td style="width:229px;">D8417</td>
			<td style="width:480px;">Prepare stock in H20 at 100 mg/mg. Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Fluorescent mounting media</td>
			<td style="width:277px;">Dako</td>
			<td style="width:229px;">S3023</td>
			<td style="width:480px;">Add DAPI before use (1:400 from DAPI stock).</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:392px;">Cover glass</td>
			<td style="width:277px;">VWR</td>
			<td style="width:229px;">631-0147</td>
			<td style="width:480px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioengineering of humanized bone marrow microenvironments in mouse and their visualization by live imaging

Humana hematopoetiska stamceller (HSCs) ligger i benmärgs (BM) nischen, ett invecklat multifaktoriellt nätverk av komponenter som producerar cytokiner, tillväxtfaktorer och extracellulär matris. HSCs förmåga att förbli vilande, självförnya eller differentiera och förvärva mutationer och bli maligna beror på de komplexa interaktioner som de etablerar med olika stromkomponenter. För att observera överensstämmelsen mellan humana HSC och den humana BM-nischen i fysiologiska och patologiska förhållanden, utformade vi ett protokoll för ektopisk modell och bildar en humaniserad BM-nisch i immunofrekventa möss. Vi visar att användningen av olika cellulära komponenter möjliggör bildandet av humaniserade strukturer och möjligheten att bibehålla långvarig humant hematopoietisk engraftment. Med hjälp av tvåfotonmikroskopi kan vi levande bilda dessa strukturer in situ vid encellsupplösningen, vilket ger ett kraftfullt nytt verktyg för den funktionella karakteriseringen av humant BM mMikromiljö och dess roll vid reglering av normal och malign hematopoiesis.

I figur 1 visas representativa bilder av byggnadscells sådd- och implantationsprocesser. I figur 1C noteras att celler injiceras direkt i ställningen. I Figur 1G noteras att ett snitt görs på musens baksida, där den subkutana fickan skapas och ställningen implanteras. Figur 2 visar grossmorfologin för olika byggnadsställningar implanterade i NSG-möss och hämtas efter 8 veckor. Observera den lätta vaskuläriseringen i hMSC-fröformade byggnadsställningar ( Figur 2A ). Samsedningen av mänskliga EC med hMSC i ställningen möjliggör bildandet av mer relevant vaskulatur i byggnadsställningar ( Figur 2B ). Slutligen inducerar närvaron av rhBMP-2 benbildning. De hämtade byggnadsställningarna är större i detta fall och de utgörs avBenliknande hårdvävnad. Figur 3 visar konfigurationen av kanalkonfigurationen på mikroskopet för live-imaging med NDD (detaljer i figurlegenden). Figur 4 och Video 1 visar humana hematopoietiska celler i hMSC-belagda byggnadsställningar. Byggnadsställningar eksplanterades 8 veckor efter implantation och efter intravenös inokulering av AF488-hCD45 antikropp och 655-VPA. Denna procedur möjliggör visualisering av implanterade humana hematopoietiska celler och den vaskulära strukturen genom två-foton-konfokalmikroskopi. I detta fall visar bilderna blodkärl (655-VPA) i byggnadsställningar och den långsiktiga engraftmenten av humana hematopoetiska celler (AF488-hCD45) i ställningsparenchymen. Figur 5 och Video 2 motsvarar mänskliga byggnadsställningar utsäde med hEC och hMSCs. 8 veckor efter operationen utplånade byggnadsställningarna efter intravenOus inokulering av FITC-hCD31 antikropp och 655-VPA, och bilder förvärvades med ett två-foton konfokalmikroskop, som nämnts tidigare. Bilder visar deltagandet av hEC i kärlbildning i ställningen, vilket resulterar i en murin-human kimär vaskulatur. Figur 6A visar representativa data av den metod som användes för att stimulera benbildning i MSC-ställningar. I likhet med tidigare figurer, 8 veckor efter implantation, utfördes intravenös inokulering av 655-VPA, byggnadsställningar hämtades och bilder förvärvades med två-foton konfokalmikroskopi. RhBMP-2-stimulerade byggnadsställningar inducerar bildandet av benvävnad, vilket kan visualiseras på grund av SHG (cyanfärg i bilderna) som tillhandahålls av kalcium i benet. De bildade bilderna visar också bildningen av håligheter och vaskulär endostal vävnad, som mycket liknar BM endosteal vävnaden. I figur 6B </sTrong&gt; och Video 3 , hECs co-implanterades med hMSCs. Byggnadsställningar hämtades efter intravenös inokulering av FITC-hCD31-antikropp och 655-VPA, och tvåfoton-konfokala mikroskopiska bilder visar deltagandet av hEC i neovaskularisering i en benformande ställning. Figur 7 visar representativa bilder av histologi, ett förfarande som utförts för att bekräfta tidigare beskrivna resultat. Immunfluorescerande bilder visar muskärl, hEC, hMSCs och långsiktiga engrafted humana hematopoietiska celler i byggnadsstrukturerna. Byggnadsställningar som hämtats från möss fixerades och användes för immunofluorescens. I rhBMP-2-bärarbenformningsställen ( Figur 7D- F ) noteras morfologin hos vävnaden, som liknar mogen benmärg med fettvävnad. I denna benformande ställning visar vi att hMSCs är fibroblaster, vilket skulle indikera tHatt de bidrar till nybildad vävnad som stromala celler. Vi visar också humant adipocytmarkörsuttryck, vilket skulle indikera att hMSCs också bidrar till bildandet av fettvävnad. <img alt="Figur 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig1.jpg" /> Figur 1. Representativa bilder av cellsåtande och implantationsprocesser. A) Inledande ställning och dess skärmetod med hjälp av en skalpell. B) 24 bitar erhållna från den ursprungliga ställningen. C) Scaffold cell-sådd metod med en spruta. D) Cellsågda byggnadsställningar med odlingsmedium, redo att implanteras. EF) Särskilda steg för benbildande ställningar: E) ställning överförs till en 96-brunn, u-bottenplatta och F) representativ bild av metoden som används för att tillsätta rhBMP2, trombin och fibrinogen till ställningen. GJ) Surgi<html> Cal implantationsförfarande under generell anestesi: G) sår skapat i huden och ställningen implantering, H) implantationsmetod och IJ) sårslutningsförfarande med användning av kirurgiskt lim. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a> <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig2.jpg" /> Figur 2. Olika byggnadsställningar som hämtas från möss. Representativa bilder av MSC-byggnadsställningar (vänster), MSC + EC-byggnadsställningar (mitten) och MSC + EC + BMP-byggnadsställningar (höger). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a> 4 / 55914fig3.jpg &quot;/&gt; Figur 3. Kanalkonfiguration. Mikroskopfilterinställningen visas. A) Det finns fyra NDD-detektormoduler: I den första modulen finns det två filterkubar; Den andra och tredje modulen har en filterkub varje; Och den sista modulen har ingen kub (används inte). Det första fotomultiplikatorröret (PMT) är för fjärrkanalen (640-690 nm), vilket återspeglar de lägre våglängderna; Följande är 380 - 485 nm, 500 - 550 nm och 555 - 625 nm (ordern är alltid från lägre till högre våglängder). B) Fluoroförutsläppen som kan detekteras med ovanstående konfigurationer (färgkodad). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig3large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a> <img alt="Figur 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig4.jpg" /> Figur 4. MSC-ställning<html> S tillåta bildandet av en nisch för humana hematopoietiska celler. A) och B) 3D-rekonstruktioner av Z-stackar som tas efter explant efter intravenös ympning med AF488-hCD45 (grön) för att märka humana hematopoetiska celler och 655-VPA (magenta) m för att märka vaskulatur. Skalstänger representerar 20 μm i A och B (övre paneler) och 5 μm i B (nedre paneler). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig4large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a> <img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/55914/55914video1.jpg" /> Video 1. MSC-byggnadsställningar tillåter bildandet av en nisch för humana hematopoietiska celler . 3D rekonstruktion av humana hematopoetiska celler (AF488-hCD45) associerad med vaskulaturen (655-VPA) i MSC-ställningen (kollagenstrukturer: SHG, cyan). Varje stapel mäter 140 x 140 μm.Ef = &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914video1.mov&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Vänligen klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att ladda ner.) <img alt="Figur 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig5.jpg" /> Figur 5. Mänskliga ECs deltar i bildandet av humaniserade fartyg i MSC-byggnadsställningar. 3D rekonstruktion av kärl (655-VPA) kantad av ECs av mänskligt ursprung (FITC-hCD31) i MSC + EC-ställningar. Skalstänger representerar 20 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig5large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a> <img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/55914/55914video2.jpg" /> Video 2. Mänskliga ECs deltar i bildandet av humaniserade fartyg i MSC-byggnadsställningar. 3D rekonstruktion av mänskliga ECs (FITC-hCD31) som ligger på va<html> Sculature (655-VPA) i MSC + EC-byggnadsställningar. Varje stapel mäter 240 x 240 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914video2.mov" target="_blank">Vänligen klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att ladda ner.)</a> <img alt="Figur 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig6.jpg" /> Figur 6. rhBMP-2 bärarställningar har benytor och humaniserad vasculatur som liknar benmärgen. A) 3D-rekonstruktion av MSC + BMP-ställningar som visar bildandet av benstrukturer (SHG-cyan) och vaskulatur (655-VPA). Skala barer representerar 100 μm (vänster), 70 μm (mitten) och 50 μm (höger). B) 3D-rekonstruktion av MSC + EC + BMP-byggnadsställningar som visar humaniserade kärl (655-VPA) fodrade med humana ECs (FITC-hCD31). Skala barer representerar 50 μm (vänster) och 30 μm (mitten och höger).14 / 55914fig6large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur. <img alt="Video 3" src="/files/ftp_upload/55914/55914video3.jpg" /> Video 3. rhBMP-2 bärarställningar har benytor och humaniserad vasculatur som liknar benmärgen. 3D rekonstruktion av MSC + VERA + BMP ställning (ben: SHG; kärl: 655-VPA; human EC: FITC-hCD31). Varje stapel mäter 600 x 600 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914video3.mov" target="_blank">Vänligen klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att ladda ner.)</a> <img alt="Figur 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55914/55914fig7.jpg" /> Figur 7. Representativa bilder av immunfluorescens utförd på fasta ställningar. AF) Immunofluorescensstudier utförda för lokalisering av humana celler implanterade iN byggnadsställningar. AC) Ställen implanterade med hEC, hMSCs och hHSCs. DF) Benformande byggnadsställningar implanterade med hEC, hMSCs och hHSCs. Färgkanalerna är följande: AD) human EC (hCD31) och musaskaskruktur (endomucin, ENDOM), BE) hMSCs (hVimentin, hVIM) och musaskulceller (endomucin, ENDOM), C) humana hematopoietiska celler (hCD45) Och musaskulatur (endomucin, ENDOM) och F) humant adiposdifferentieringsrelaterat protein (hADRP) och musaskulatur (endomucin, ENDOM). Skalstänger representerar 10 | im (A och C), 20 | im (B och E) och 40 (D och F) | im. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914fig7large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging at JoVE.com

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

En metod för att skapa och levande bild olika humaniserade benmärgsnischer i möss presenteras. Baserat på den stödjande nischen som skapas av humana mesenkymceller inducerar tillsättningen av humana endotelceller bildandet av humana kärl, medan tillsatsen av rhBMP-2 inducerar bildningen av human-mus-chimär mogen benvävnad.

Bioengineering av humaniserade benmärgsmiljöer i mus och deras visualisering genom Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix

Isolering av Human mesenkymala stamceller och deras Odling på Porös Bone Matrix

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific ...

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells (MPCs) from Human Bone Marrow

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells MPCs from Human Bone Marrow

Isolations Mesangiogenic stamceller (MPC) från human benmärg

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel ...

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

In vitro-differentiering av mogna Myofibers för Live Imaging

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Live Confocal Imaging för att utveckla Arabidopsis blommor

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Identifikation av erytromyeloidprogenitorer och deras avkomma i musembryo med flödescytometri

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Fröämnet odling för Live-cell Imaging av zygot polarisering och Embryo mallning i Arabidopsis thaliana.

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

En RANKL-baserade Osteoclast kultur analys av mus benmärgen att undersöka betydelsen av mTORC1 Osteoclast bildandet

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Isolering, kultur och differentiering av benmärgens stromaceller och Osteoclast stamfäder från möss

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Levande cellen avbildning av kromosomsegregering under Mitos

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...