Name: a protocol for multiple gene knockout in mouse small intestinal organoids using a crispr-concatemer
Uploaded: 2017-07-12T15:00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer at JoVE.com

نشكر كريستوفر هيندلي على القراءة الحرجة للمخطوطة. آم مدعوم من ونتساب (ماري كوري إتن)، آ-R. بدعم من مجلس البحوث الطبية (مرك)، و بك. و آرإم بدعم من زمالة السير هنري ديل من ويلكوم ترست والجمعية الملكية [101241 / Z / 13 / Z] والحصول على الدعم من خلال منحة أساسية من ويلكوم ترست ومركز موارد المهاجرين إلى ويلكوم الثقة - مرك كامبريدج الخلايا الجذعية معهد .

<ol>
	<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Guided+Human+Genome+Engineering+via+Cas9.">RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. -. P., Velasco-Herrera, M. D. C., Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+recessive+genetic+screening+in+mammalian+cells+with+a+lentiviral+CRISPR-guide+RNA+library.">Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library.</a> Nat Biotech. 32 (3), 267-273 (2014).</li><li>Bassett, A. R., Kong, L., Liu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genome-Wide+CRISPR+Library+for+High-Throughput+Genetic+Screening+in+Drosophila+Cells.">A Genome-Wide CRISPR Library for High-Throughput Genetic Screening in Drosophila Cells.</a> J Genet Genomics. 42 (6), 301-309 (2015).</li><li>Diss, G., Ascencio, D., DeLuna, A., Landry, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+paralogous+compensation+and+the+robustness+of+cellular+networks.">Molecular mechanisms of paralogous compensation and the robustness of cellular networks.</a> J Exp Zool B Mol Dev Evol. 322 (7), 488-499 (2014).</li><li>Andersson-Rolf, A., Merenda, A., Mustata, R. C., Li, T., Dietmann, S., Koo, B. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+paralogue+knockout+using+a+CRISPR-concatemer+in+mouse+small+intestinal+organoids.">Simultaneous paralogue knockout using a CRISPR-concatemer in mouse small intestinal organoids.</a> Dev Biol. 420 (2), 1-7 (2016).</li><li>Ran, F. A., Hsu, P. P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golden+gate+shuffling:+A+one-pot+DNA+shuffling+method+based+on+type+IIs+restriction+enzymes.">Golden gate shuffling: A one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes.</a> PLoS ONE. 4 (5), (2009).</li><li>Sakuma, T., Nishikawa, A., Kume, S., Chayama, K., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+in+human+cells+using+all-in-one+CRISPR/Cas9+vector+system.">Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9 vector system.</a> Sci Rep. 4 (5), 5400 (2014).</li><li>Kabadi, A. M., Ousterout, D. G., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+CRISPR/Cas9-based+genome+engineering+from+a+single+lentiviral+vector.">Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector.</a> Nucleic Acids Res. 42 (19), 1-11 (2014).</li><li>Yin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Conditional+Mutagenesis+Using+Transgenic+Expression+of+Cas9+and+sgRNAs.">Multiplex Conditional Mutagenesis Using Transgenic Expression of Cas9 and sgRNAs.</a> Genetics. 200 (2), 431-441 (2015).</li><li>Cress, B. F., Toparlak, O. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPathBrick:+Modular+Combinatorial+Assembly+of+Type+II-A+CRISPR+Arrays+for+dCas9-Mediated+Multiplex+Transcriptional+Repression+in+E.+coli.">CRISPathBrick: Modular Combinatorial Assembly of Type II-A CRISPR Arrays for dCas9-Mediated Multiplex Transcriptional Repression in E. coli.</a> ACS Synth Biol. 4 (9), 987-1000 (2015).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method.">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> J Vis Exp. (6), e253 (2007).</li><li>Zimmermann, J., Voss, H., Schwager, C., Stegemann, J., Ansorge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Sanger+dideoxy+sequencing+reaction+protocol.">Automated Sanger dideoxy sequencing reaction protocol.</a> FEBS Letters. 233 (2), 432-436 (1988).</li><li>Fujii, M., Matano, M., Nanki, K., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genetic+engineering+of+human+intestinal+organoids+using+electroporation.">Efficient genetic engineering of human intestinal organoids using electroporation.</a> Nat. Protoc. 10 (10), 1474-1485 (2015).</li><li>Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+video+protocol+of+retroviral+infection+in+primary+intestinal+organoid+culture.">A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture.</a> J Vis Exp. (90), e51765 (2014).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف. المؤلفين لا تضارب المصالح المعلن عنها.

في هذا البروتوكول، ونحن بالتفصيل جميع الخطوات اللازمة لتوليد كريسبر-كونكاتيمرز وتطبيق كريسبر-كونكاتيمرز في أورغانويدس الأمعاء الماوس من أجل ضرب في وقت واحد من جينات متعددة. وكما ذكر سابقا، فإن لهذه الاستراتيجية عدة مزايا، مثل سرعتها وكفاءتها العالية وفعاليتها من حيث التكلفة. من أجل تنفيذ الإجراء بأكمله بنجاح، وهناك عدد قليل من الجوانب الهامة للنظر فيها. أولا، من الضروري أن جميع أوليغوس الحمض الريبي النووي النقال هي صلبة بشكل صحيح وفوسفهوريلاتد، لأنها تمثل المواد انطلاق لاستنساخ بس الأول استنساخ أنه في حد ذاته هو فعال جدا. ثانيا، عندما إليكتروبوراتينغ أورغانويدز، والمزيد من الخلايا المستخدمة في حالة، وارتفاع كفاءة ترنسفكأيشن أقصى قدر ممكن. وبالإضافة إلى ذلك، فمن المهم أيضا أنه بعد تفكك الخلية، وتغلب مجموعات الخلايا الصغيرة على خلايا واحدة. ومع ذلك، فمن الممكن أن تواجه المهنيةيمس عند محاولة إما الاستنساخ أو ترنسفكأيشن للمرة الأولى. في حالة وجود مشاكل أثناء الاستنساخ غرنا، فمن المستحسن لمضاعفة التحقق من تسلسل أولي غرنا، وإذا كان ذلك صحيحا، حدد المستعمرات البكتيرية إضافية للفحص تقييد الهضم. إذا كفاءة ترنسفكأيشن وبقاء الخلية منخفضة بعد إليكتروبوراتيون، ثم فإنه من المستحسن لتكرار بروتوكول باستخدام المزيد من الخلايا في حالة والحد من الوقت من تفكك الخلية إلى 3 دقائق. على الرغم من أن توليد كريسبر-كونكاتيمرز هو رخيصة نسبيا وسهلة، وأداء شاشات وراثية أكبر نطاقا في أورغانويدس ليس، كما هو مقيد من حيث التكاليف المرتبطة الثقافة العضوية وطبيعة كثيفة العمالة. ومن الجدير بالذكر في هذه الحالة أن طريقة كريسبر-كونكاتيمر هي أيضا متوافقة مع خطوط الخلايا، مثل HEK293 والخلايا الجذعية الجنينية الماوس. بغض النظر عن النظام الخلوي، عيب محتمل آخر من هذا sتراجي يمكن أن تصادف عندما تهدف إلى خروج المغلوب في وقت واحد من ثلاثة أو أربعة جينات مختلفة. على سبيل المثال، سيكون لكل غرنا كفاءة استهداف مختلفة، والتغيرات في ضرب جميع الجينات في نفس الوقت يمكن أن تكون منخفضة نسبيا، لهذا السبب، فإنه من المستحسن لتوظيف نظام كونكاتيمر لتوجيه أكثر من غرنا واحد ضد نفس الجين. وقد اقترحت استراتيجيات بديلة على أساس مماثل على غولدن غيت خلط على مر السنين لتوليد ناقلات الحمض الريبي النووي النقال متعددة 7 ، 8 . ومع ذلك، في طريقة لدينا فمن الممكن لتجميع مباشرة غرناس متعددة في ناقلات فيروسات واحدة في جولة واحدة من الاستنساخ، مما يجعلها مناسبة لتوليد المكتبات غرنا لاستهداف المعادلات. لدينا كريسبر-كونكاتيمر بنيت في مسكف العمود الفقري ناقلات الفيروس العكسي. وهكذا، يمكن أن تستخدم الحمض النووي الريبي التي تحتوي على الموروث الفيروسي لتوليد خطوط الخلايا مستقرة أن أوفيركسريس غرناس. عندما يقترن نظام Cas9 محرض، يمكن للمرء أن يؤدي محرضات قاضات المحاكاة باستخدام نظامنا. باختصار، هنا نحن تصف كيفية استنساخ ما يصل إلى أربعة غرناس مختلفة في نفس ناقلات في خطوة واحدة وكيفية تطبيق هذه الاستراتيجية لثقافة عضوي مع كفاءة ترنسفكأيشن عالية. وعلاوة على ذلك، ونحن نقدم اقتراحات مفيدة لتحقيق أقصى قدر من فرص النجاح في جميع أنحاء الإجراء بأكمله.

نهج الوراثة العكسي هو طريقة تستخدم على نطاق واسع للتحقيق في وظيفة الجين. على وجه الخصوص، وفقدان وظيفة الدالات، حيث ان تعطيل الجينات يسبب التغيرات المظهرية، تلعب دورا رئيسيا في بناء فهمنا للعمليات البيولوجية. تمثل الطريقة كريسبر / Cas9 أحدث التطورات في تكنولوجيا هندسة الجينوم، وقد أحدثت ثورة في الممارسة الحالية لعلم الوراثة في الخلايا والكائنات الحية. Cas9 هو إندوكلياز الموجهة من الحمض النووي الريبي الذي يربط تسلسل الحمض النووي محددة مكملة ل غرنا ويولد كسر مزدوج حبلا (دسب). هذا دسب المجندين آلات إصلاح الحمض النووي أنه في غياب قالب الحمض النووي لإعادة التركيب مثلي، وإعادة ليغات حبلا الحمض النووي خفض عن طريق الخطأ المعرضة غير متماثلة نهاية الانضمام، والتي يمكن أن تؤدي بالتالي إلى إدراج أو حذف النوكليوتيدات (ق) مما تسبب الطفرات فرمشيفت 1 . سهولة كبيرة وبراعة من كريسبر / Cas9 أبرأوتش جعلت أداة جذابة للغاية لشاشات خروج المغلوب الجينوم على نطاق واسع تهدف إلى كشف وظائف الجينات غير معروف 2 ، 3 . ومع ذلك، فإن نهج خروج المغلوب الجيني واحد من استخدام محدود إذا بارالوغس متعددة مع وجود وظائف زائدة عن الحاجة. وهكذا، قد لا يكون تخثر جين واحد كافيا لتحديد وظيفة هذا الجين نظرا لتعويض ممكن من قبل بارالوغوز مما أدى إلى القليل أو عدم وجود تغيير المظهري 4 . ولذلك فمن المهم أن تدق المعادلات بالتوازي من خلال تقديم ناقلات الحمض النووي الريبي متعددة تستهدف مختلف الجينات بارالوغوس من أجل التغلب على تأثير التعويض الجيني. لتوسيع استخدام كريسبر / Cas9 إلى خروج المغلوب الجيني خوارزمية، قمنا مؤخرا بتطوير طريقة استنساخ سريعة، من خطوة واحدة لاستنساخ ما يصل إلى أربعة غرناس قبل صلب إلى ناقلات الفيروس الوعائي واحد 5 . العمود الفقري، واسمه كريسبر-كونكاتيمر، ويستندعلى البلازميد مسف ريتروفيرال تحتوي على تكرار غرنا أشرطة الكاسيت. كل كاسيت يحتوي على اثنين من مواقع الاعتراف مقلوب من نوع إيس انزيم تقييد بس الأول، والتي يمكن استبدالها بشكل لا رجعة فيه من قبل غرنا صلب أوليغو مع المتراكمة مطابقة باستخدام غولدن غيت خلط خلط رد فعل في أنبوب واحد 6 . وتتكون طريقة الاستنساخ هذه من دورات متكررة من الهضم والربط التي تسمح بالتجمع المتزامن لشظايا الحمض النووي المتعددة من خلال استغلال تسلسل متراكمة مختلفة ولدت من قبل بس I. تفرد هذا الإنزيم هو، على سبيل المثال، القدرة على إجراء تخفيضات غير المتماثلة خارج الاعتراف بها تسلسل؛ وبالتالي، يمكن لكل كاسيت يكون تسلسل مختلف مع يتدلى مخصصة المرافقة الموقع الأساسية BBS الأول وبهذه الطريقة، كل gRNA يمكن استنساخ في وضع واتجاه محدد من ناقلات متسلسل. وكدليل على المبدأ، أثبتنا استخدام هذه الاستراتيجية فيالماوس أورغانويدز المعوية عن طريق تعطيل في وقت واحد اثنين من أزواج من المنظمين السلبية بارالوغوس من مسار ونت من قبل جولة واحدة من إليكتروبوراتيون 5 . خلال السنوات القليلة الماضية، وضعت العديد من المجموعات الأخرى استراتيجيات مماثلة على أساس متعددة ناقلات التعبير الحمض النووي الريبي التي شيدت باستخدام البوابة الذهبية خلط 7 لتحقيق خروج المغلوب متعددة الجينات في أنظمة نموذجية مختلفة، مثل خطوط الخلايا البشرية 8 ، 9 ، الزرد 10 والإشريكية القولونية 11 - في البروتوكولات الخاصة بهم، يتم استنساخ غرناس أولا في ناقلات وسيطة الفردية ومن ثم تجميعها معا في منتج نهائي واحد. على النقيض من ذلك، فإن الميزة الرئيسية لاستراتيجيتنا كريسبر-كونكاتيمر هو راحة واحدة بس الأول خلط، خطوة الاستنساخ. مثل غيرها من المراسلات غرنا، طريقة لدينا يجعل ممكنا إما خروج المغلوب في وقت واحد لمدة تصل إلى أربعةوجينات مختلفة أو زيادة كريسر خروج المغلوب كفاءة بعد استهداف واحد أو اثنين من الجينات مع غرناس متعددة ( الشكل 1 ). في هذا البروتوكول، ونحن تصف بالتفصيل كل خطوة في توليد ناقلات كريسبر-كونكاتيمر، من تصميم غرنا إلى رد فعل غولدن غيت وتأكيد الاستنساخ الناجح. ونحن نقدم أيضا بروتوكول كفاءة عالية لترنسفكأيشن من كريسبر-كونكاتيمرز في الماوس أورغانويدس الأمعاء الصغيرة عن طريق إليكتروبوراتيون والتجارب انسحاب عامل النمو اللاحق.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="976">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Optimized CRISPR Design Tool</td>
			<td style="width:183px;">Feng Zhang group</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:395px;">CRISPR gRNA design tool; http://crispr.mit.edu/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Webcutter 2.0</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>restriction mapping tool; http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">T4 PNK (Polynucleotide Kinase)</td>
			<td style="width:183px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0201L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">T4 DNA ligase buffer</td>
			<td style="width:183px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">T7 DNA Ligase</td>
			<td style="width:183px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0318L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">DTT (dithiothreitol)</td>
			<td style="width:183px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">P1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">ATP (adenosine triphosphate)</td>
			<td style="width:183px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">P0756S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">FastDigest BbsI (BpiI)</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">FD1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:281px;">Tango buffer (BSA-containing restriction enzyme buffer)</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BY5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">BglII</td>
			<td style="width:183px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">EcoRI</td>
			<td style="width:183px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Plasmid-safe exonuclease</td>
			<td style="width:183px;">Cambio</td>
			<td style="width:119px;">E3101K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Thermal cycler</td>
			<td style="width:183px;">Applied biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4359659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">10G competent E. coli bacteria</td>
			<td style="width:183px;">Cambridge Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">60108-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Plasmid mini kit</td>
			<td style="width:183px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">12125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Table top microcentrifuge</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">UY-02580-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Inoculating loops</td>
			<td style="width:183px;">Microspec</td>
			<td style="width:119px;">PLS5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Bacteria incubator</td>
			<td style="width:183px;">Sanyo</td>
			<td style="width:119px;">MIR-262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Luria-Bertani broth (LB)</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L3522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Agarose</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A4718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Agarose gel electrophoresis apparatus</td>
			<td style="width:183px;">Bioneer</td>
			<td style="width:119px;">A-7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:281px;">Advanced DMEM/F12(cell culture medium)</td>
			<td style="width:183px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12634-034</td>
			<td style="width:395px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:281px;">Glutamax (L-Glutamine) 100x</td>
			<td style="width:183px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">35050-068</td>
			<td style="width:395px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:281px;">HEPES 1 M (buffering agent)</td>
			<td style="width:183px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15630-056</td>
			<td style="width:395px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:281px;">Penicillin-streptomycin 100x</td>
			<td style="width:183px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td style="width:395px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:281px;">B27 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 50x</td>
			<td style="width:183px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">17504-044</td>
			<td style="width:395px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:281px;">N2 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 100x</td>
			<td style="width:183px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">17502-048</td>
			<td style="width:395px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:281px;">n-Acetylcysteine 500 mM</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A9165-5G</td>
			<td style="width:395px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:281px;">Mouse EGF 500 &#181;g/mL</td>
			<td style="width:183px;">Invitrogen Biosource</td>
			<td style="width:119px;">PMG8043</td>
			<td style="width:395px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:281px;">Mouse Noggin 100 &#181;g/mL</td>
			<td style="width:183px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">250-38</td>
			<td style="width:395px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:281px;">Nicotinamide 1 M</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:281px;">R-Spondin conditioned medium</td>
			<td style="width:183px;">n.a.</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td style="width:395px;">Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:70px;width:281px;">Wnt conditioned medium</td>
			<td style="width:183px;">n.a.</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td style="width:395px;">Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:281px;">Y-27632 10 &#181;M</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Y0503-1MG</td>
			<td style="width:395px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Standard BD Matrigel matrix</td>
			<td style="width:183px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">48-well Plate</td>
			<td style="width:183px;">Greiner Bio One</td>
			<td style="width:119px;">677980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:281px;">CHIR99021</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3734-1MG</td>
			<td style="width:395px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">IWP-2</td>
			<td style="width:183px;">Cell Guidance Systems</td>
			<td style="width:119px;">SM39-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">TrypLE (recombinant protease)</td>
			<td style="width:183px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Opti-MEM (reduced serum medium )</td>
			<td style="width:183px;">Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">51985-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Electroporation Cuvettes 2mm gap</td>
			<td style="width:183px;">NepaGene</td>
			<td style="width:119px;">EC-002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Low binding 15 mL tubes</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">CLS430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">B&#252;rker&#8217;s chamber</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">BR719520-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">NEPA21 Super Electroporator</td>
			<td style="width:183px;">NepaGene</td>
			<td style="width:119px;">contact supplier</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Protein LoBind tubes low binding</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">10708704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">BTXpress electroporation buffer</td>
			<td style="width:183px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:119px;">45-0805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td style="width:183px;">AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A3672</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a protocol for multiple gene knockout in mouse small intestinal organoids using a crispr-concatemer

وقد تحسنت التكنولوجيا كريسبر / Cas9 إلى حد كبير جدوى وسرعة الدراسات فقدان وظيفة التي هي أساسية في فهم وظيفة الجينات. في حقيقيات حقيقيات أعلى، يمكن للجينات بارالوغوس أن تخفي النمط الظاهري المحتمل عن طريق تعويض فقدان الجين، مما يحد من المعلومات التي يمكن الحصول عليها من الدراسات الجينية التي تعتمد على الجينات المفردة الجينية واحدة. قمنا بتطوير رواية، طريقة الاستنساخ السريع لالمرنا الحمض النووي الريبي (غرنا) كونكاتيمرز من أجل خلق متعددة الجينات خروج المغلوب بعد جولة واحدة من ترنسفكأيشن في الماوس أورغانويدس الأمعاء الصغيرة. استراتيجيتنا تسمح ل كونكاتيمريزاتيون تصل إلى أربعة غرناس الفردية في ناقلات واحدة عن طريق إجراء واحد غولدن غيت خلط رد فعل مع أوليغوس الحمض الريبي النووي الذواب صلب وناقلات ريتروفيرال مصممة مسبقا. وهذا يسمح إما خروج المغلوب في وقت واحد لمدة تصل إلى أربعة جينات مختلفة، أو زيادة كفاءة خروج المغلوب بعد استهداف الجين واحد من قبل غرناز متعددة. في هذا البروتوكول، نعرض بالتفصيلكيفية استنساخ بكفاءة متعددة غرناس في ناقل الفيروس كريسبر-كونكاتيمر ريتروفيرال وكيفية تحقيق إليكتروبوراتيون كفاءة عالية في أورغانويدز المعوية. على سبيل المثال، نبين أن خروج المغلوب في وقت واحد من اثنين من أزواج من الجينات ترميز المنظمين السلبي من مسار الإشارات ونت (Axin1 / 2 و Rnf43 / Znrf3) يجعل أورغانويدات الأمعاء مقاومة لانسحاب عوامل النمو الرئيسية.

من أجل تأكيد وجود العدد الصحيح من إدراج الحمض الريبي النووي النقال في ناقلات كونكاتيمر، يتم تنفيذ تقييد الهضم مع الإنزيمات ( إكور I + بغل الثاني) يرافق كل غرنا معربا عن أشرطة (كل حجم كاسيت هو ~ 400 نقطة أساس، الشكل 1 ). على سبيل المثال، عند إنشاء 4 غرنا- ناقل متزامن، وحجم المتوقع من الفرقة السفلى في هلام الاغاروز حوالي 1.6 كيلوبايت. أي الفرقة أقل من هذا يشير إلى أن ليس كل من 4 أشرطة غرنا يتم إدراجها في ناقلات ( الشكل 2A ). وبالإضافة إلى ذلك، فمن المستحسن دائما للتحقق من أن جميع بس اعترفت مواقع الاعتراف I والانزيم لا قطع ناقلات ( الشكل 2B ). مرة واحدة وقد تم تأكيد يبني، ويمكن تسليمها إلى أورغانويدس الأمعاء الماوس عن طريق إليكتروبوراتيون لتحقيق أوبتيمالتر مستويات كفاءة ترنسفكأيشن (تصل إلى 70٪)، كما هو مبين من قبل السيطرة غفب ( الشكل 3 ). وأخيرا، لاختبار وظيفيا كفاءة هذه الاستراتيجية، تم تربيتها أورغانويدز المعوية ترانزفكتد مع Cas9 وناقلات كونكوماتر ضد Axin1 / 2 و Rnf43 / Znrf3 في إن (R- سبوندين الانسحاب) و إن + IWP2 (R- سبوندين و ونت الانسحاب، IWP2 : مثبط النيص، 2.5 ميكرومتر) وسائل الإعلام لمدة لا تقل عن 3 مقاطع ( الشكل 4 ). في حين مات أورغانويدز وت ترانزفكتد تحت كلا الظروف، نجا Axin1 / 2 عضلات المغلوب خروج المغلوب في كلاهما بسبب تفعيل المصب من مسار ونت؛ بالإضافة إلى ذلك، Rnf43 / Znrf3 متحولة أورغانويدز البقاء على قيد الحياة في غياب R- سبوندين ولكن لا يمكن البقاء على قيد الحياة في وجود IWP2، والذي يسبب نضوب ونت أن ينشط المسار. مجتمعة، هذه الملاحظات تبين أن خروج المغلوب من هذه أزواج من بارالوغوز ممكن من خلال توليد روقال انه يتوقع النمط الظاهري عضوي. وقد نشرت تفاصيل هذه النتائج في علم الأحياء التنموي 5 . <img alt="شكل 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55916/55916fig1.jpg" /> الشكل 1: التمثيل التخطيطي لل كريسبر-كونكاتيمر مع 4 كاسيت. مخطط من 4 غرنا-متناظرة ناقلات مع كل 400 بب الكاسيت التي تحتوي على المروج U6، واثنين من مقلوب المتكررة بس I المواقع (كما أشار بب) وسقالة غرنا في هذا النظام. خلال رد فعل خلط، يتم استبدال المواقع BBS I بشظايا gRNA مع مطابقة يتدلى، وبالتالي فقدت. يتم عرض مواقع ملزمة من الاشعال التسلسل للتحقق من الإدراج الصحيح من أوليغوس الحمض الريبي النووي النقال من قبل الأسهم الزرقاء. فود = التمهيدي إلى الأمام، ريف = التمهيدي العكسي، وصلة 1/2/3 = مناطق رابط 1/2/3. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55916/55916fig1large.jpg" target="_blank">يرجى ج</a>لعق هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الشكل 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55916/55916fig2.jpg" /> الشكل 2: أنماط الهضم ممثل المتجهات كونكاتموتر. ( A ) الهضم المزدوج من 3 و 4 ناقلات غنا-كونكاتيمر مع إكور الأول و بغل الثاني. يتم وضع علامة على نمط الهضم الصحيح من قبل علامة خضراء، في حين يتم وضع علامة على ناقلات مع 1 أو 2 غرنا الإدراج عن طريق الصليب الأحمر. حارة 1 يظهر الهضم من 4 غرنا-كونكاتيمر ناقلات الوالدين تستخدم السيطرة الإيجابية (ملحوظ ب &quot;+&quot;)؛ وبالمثل، يظهر حارة 5 الهضم من 3 غرنا-كونكاتيمر ناقلات الوالدين، تميزت ب &quot;+&quot;. ( B ) الهضم مع بس الأول، والتي تبين الحجم الصحيح من ناقلات كوناكاتيمر عسر الهضم (المشار إليها من قبل القراد الأخضر). يتم استخدام الهضم من ناقلات المتزامنة التي تحتوي على الحمض النووي الريبي التي فقدت بس I المواقع باعتبارها السيطرة الإيجابية<html> d تم وضع علامة &quot;+&quot;. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55916/55916fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55916/55916fig3.jpg" /> الشكل 3: صورة الممثل من أورغانويدس المعوية إليكتروبوراتد بنجاح. ترنسفكأيشن من البلازميد غفب هو مفيد لتقييم كفاءة ترنسفكأيشن. ما يقرب من 24 ساعة بعد إليكتروبوراتيون، أورغانويدز تحتوي على عدد قليل من الخلايا مرئية بالفعل، وإذا كان الإجراء إليكتروبوراتيون ناجحة، وتصل إلى 70٪ منهم يعرض مضان الأخضر. بف = حقل مشرق، غفب = البروتين الفلورسنت الأخضر. شريط مقياس = 2000 ميكرون. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55916/55916fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <html> ether.within الصفحات = &quot;1&quot;&gt; <img alt="الشكل 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55916/55916fig4.jpg" /> الشكل 4: صور الممثل من أورغانويدس الأمعاء متحولة. خروج المغلوب من المنظمين السلبية للمسار ونت Axin1 و Rnf43، جنبا إلى جنب مع بارالوغوز، يجعل أورغانويدز الأمعاء مقاومة للحرمان عامل النمو. على وجه الخصوص، أكسين 1/2 عضلات المغلوب خروج المغلوب (Axin1 / 2 كو) يمكن أن تنمو في غياب كل من R- سبوندين (إن: إغف + نوجين) و ونت (إن + IWP2: إن + النيص الشيوع)، في حين أن Rnf43 / Znrf3 متحولة العضوية (R &amp; Z كو) يمكن البقاء على قيد الحياة إلا في غياب R- سبوندين (بالإنكليزية). في المقابل، يمكن أورغانويدز وت البقاء على قيد الحياة فقط في حالة ثقافة السيطرة، وينر + نيك (ونت + إغف + نوجين + R- سبوندين + نيكوتيناميد). مقياس الحانات = 1،000 ميكرون. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55916/55916fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-</html style=";text-align:right;direction:rtl">بادج = &quot;1&quot; فو: كيب-ويث-next.within-بادج = &quot;ألويس&quot;&gt; <tbody><tr><td> الوسط القاعدي </td><td></td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> تخزين في 4 درجات مئوية لمدة 4 أسابيع </td><td></td><td></td></tr><tr><td> وسط زراعة الخلايا </td><td> 500 مل </td><td> انظر جدول المواد </td></tr><tr><td> L- الجلوتامين 100X </td><td> 5 مل </td><td></td></tr><tr><td> وكيل التخزين المؤقت 1 M </td><td> 5 مل </td><td> انظر جدول المواد </td></tr><tr><td> البنسلين الستربتومايسين 100x </td><td> 5 مل </td><td></td></tr><tr><td> وينر + نيك (ونت + إغف + نوجين + R-سبوندين + نيكوتيناميد) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> تخزين في 4 درجات مئوية لمدة 2 أسابيع </td><td></td><td></td></tr><tr><td> الوسط القاعدي </td><td> تصل إلى 50 مل </td><td></td></tr><tr><td> الملحق الخلايا العصبية خالية من مصل (50X) </td><td> 1 مل </td><td> انظر جدول مااستنباط مواد </td></tr><tr><td> الملحق الخلايا العصبية خالية من مصل (100x) </td><td> 500 ميكرولتر </td><td> انظر جدول المواد </td></tr><tr><td> n-أسيتيلسيستين (500 ملي) </td><td> 125 ميكرولتر </td><td></td></tr><tr><td> الماوس إغف (100 ميكروغرام / مل) </td><td> 25 ميكرولتر </td><td></td></tr><tr><td> ماوس نوجين (100 ميكروغرام / مل) </td><td> 50 ميكرولتر </td><td></td></tr><tr><td> R-سبوندين مكيفة المتوسطة </td><td> 5 مل </td><td></td></tr><tr><td> Wnt3a مكيفة المتوسطة </td><td> 25 مل </td><td></td></tr><tr><td> نيكوتيناميد (1 م) </td><td> 250 ميكرولتر </td><td></td></tr><tr><td> إن + تشير + Y-27632 (إغف + نوجين + تشير + Y-27632) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> تخزين في 4 درجات مئوية لمدة 2 أسابيع </td><td></td><td></td></tr><tr><td> بسال المتوسط ​​ث / س البنسلين الستربتومايسين </td><td> تصل إلى 20 مل </td><td></td></tr><tr><td>الملحق الخلايا العصبية خالية من مصل (50X) </td><td> 400 ميكرولتر </td><td> انظر جدول المواد </td></tr><tr><td> الملحق الخلايا العصبية خالية من مصل (100x) </td><td> 200 ميكرولتر </td><td> انظر جدول المواد </td></tr><tr><td> n-أسيتيلسيستين (500 ملي) </td><td> 50 ميكرولتر </td><td></td></tr><tr><td> الماوس إغف (100 ميكروغرام / مل) </td><td> 10 ميكرولتر </td><td></td></tr><tr><td> ماوس نوجين (100 ميكروغرام / مل) </td><td> 20 ميكرولتر </td><td></td></tr><tr><td> Y-27632 (10 ميكرومتر) </td><td> 20 ميكرولتر </td><td></td></tr><tr><td> CHIR99021 (8 ميكرومتر) </td><td> 10 ميكرولتر </td><td></td></tr><tr><td> إن (إغف + نوجين) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> تخزين في 4 درجات مئوية لمدة 4 أسابيع </td><td></td><td></td></tr><tr><td> الوسط القاعدي </td><td> تصل إلى 50 مل </td><td></td></tr><tr><td> الملحق الخلايا العصبية خالية من مصل (50X) </td><td&gt; 1 مل </td><td> انظر جدول المواد </td></tr><tr><td> الملحق الخلايا العصبية خالية من مصل (100x) </td><td> 500 ميكرولتر </td><td> انظر جدول المواد </td></tr><tr><td> n-أسيتيلسيستين (500 ملي) </td><td> 125 ميكرولتر </td><td></td></tr><tr><td> الماوس إغف (100 ميكروغرام / مل) </td><td> 25 ميكرولتر </td><td></td></tr><tr><td> ماوس نوجين (100 ميكروغرام / مل) </td><td> 50 ميكرولتر </td><td></td></tr></tbody></table> الجدول 2: تكوين وسائل الاعلام العضوي.

Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer at JoVE.com

A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer

يصف هذا البروتوكول خطوات لاستنساخ متعددة رنا دليل واحد في دليل واحد ناقلات الحمض النووي الريبي المتجهات، والتي هي ذات فائدة خاصة في خلق ضربات قاضية متعددة الجينات باستخدام تقنية كريسبر / Cas9. ويظهر توليد ضربات قاضية مزدوجة في أورغانويدز الأمعاء باعتبارها تطبيق محتمل لهذه الطريقة.

بروتوكول لعدة خروج المغلوب الجيني في ماوس الأورغانويدات المعوية الصغيرة باستخدام كريسبر-كونكاتيمر

CRISPR/Cas9 technology has greatly improved the feasibility and speed of loss-of-function studies that are essential in understanding gene function. In ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

تصنيع أجهزة الاستشعار الكهروكيميائية الدنا للكشف Reagentless من الأحماض النووية والبروتينات والجزيئات الصغيرة

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

إنشاء ثنائي الأبعاد ركائز منقوشة على الحبس البروتين والخلايا

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

الخلوية لاستخراج الدهن المستهدفة التخفيف النظائر المستقرة تحليل السائل الطيف اللوني القداس

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

جهاز ميكروفلويديك لدراسة سلالات متميزة متعددة

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

باستخدام Tomoauto: بروتوكول لإنتاجية عالية الآلي البرد الإلكترون التصوير المقطعي

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

رصد في الوقت الحقيقي من بين الخلايا الصفراء حمض حيوية باستخدام حمض الصفراء الاستشعار القائمة على الحنق ترميز وراثيا

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

بروتوكول ديسيلولاريزينج كوكليا الماوس لهندسة الأنسجة الإذن الداخلية

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

الكشف عن الأحماض النووية متعددة في صفيف شعرية البصرية

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

قمع النسخ الجيني قبل إعادة توجيه الأجهزة الخلوية مع المعدلات جينية الكيميائية

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

إجراء وسائط تصوير متعددة مع واحد Fluorescence المجهر

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...