Name: a protocol for multiple gene knockout in mouse small intestinal organoids using a crispr-concatemer
Uploaded: 2017-07-12T15:00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer at JoVE.com

Мы благодарим Кристофера Хиндли за критическое чтение рукописи. AM поддерживается Wntsapp (Marie Curie ITN), AA-R. Поддерживается Советом медицинских исследований (MRC) и BK.K. И RM поддерживаются стипендией сэра Генри Дейла из Wellcome Trust и Королевского общества [101241 / Z / 13 / Z] и получают поддержку через основной грант от Wellcome Trust и MRC до Wellcome Trust - MRC Cambridge Stem Cell Institute ,

<ol>
	<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Guided+Human+Genome+Engineering+via+Cas9.">RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. -. P., Velasco-Herrera, M. D. C., Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+recessive+genetic+screening+in+mammalian+cells+with+a+lentiviral+CRISPR-guide+RNA+library.">Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library.</a> Nat Biotech. 32 (3), 267-273 (2014).</li><li>Bassett, A. R., Kong, L., Liu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genome-Wide+CRISPR+Library+for+High-Throughput+Genetic+Screening+in+Drosophila+Cells.">A Genome-Wide CRISPR Library for High-Throughput Genetic Screening in Drosophila Cells.</a> J Genet Genomics. 42 (6), 301-309 (2015).</li><li>Diss, G., Ascencio, D., DeLuna, A., Landry, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+paralogous+compensation+and+the+robustness+of+cellular+networks.">Molecular mechanisms of paralogous compensation and the robustness of cellular networks.</a> J Exp Zool B Mol Dev Evol. 322 (7), 488-499 (2014).</li><li>Andersson-Rolf, A., Merenda, A., Mustata, R. C., Li, T., Dietmann, S., Koo, B. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+paralogue+knockout+using+a+CRISPR-concatemer+in+mouse+small+intestinal+organoids.">Simultaneous paralogue knockout using a CRISPR-concatemer in mouse small intestinal organoids.</a> Dev Biol. 420 (2), 1-7 (2016).</li><li>Ran, F. A., Hsu, P. P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golden+gate+shuffling:+A+one-pot+DNA+shuffling+method+based+on+type+IIs+restriction+enzymes.">Golden gate shuffling: A one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes.</a> PLoS ONE. 4 (5), (2009).</li><li>Sakuma, T., Nishikawa, A., Kume, S., Chayama, K., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+in+human+cells+using+all-in-one+CRISPR/Cas9+vector+system.">Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9 vector system.</a> Sci Rep. 4 (5), 5400 (2014).</li><li>Kabadi, A. M., Ousterout, D. G., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+CRISPR/Cas9-based+genome+engineering+from+a+single+lentiviral+vector.">Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector.</a> Nucleic Acids Res. 42 (19), 1-11 (2014).</li><li>Yin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Conditional+Mutagenesis+Using+Transgenic+Expression+of+Cas9+and+sgRNAs.">Multiplex Conditional Mutagenesis Using Transgenic Expression of Cas9 and sgRNAs.</a> Genetics. 200 (2), 431-441 (2015).</li><li>Cress, B. F., Toparlak, O. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPathBrick:+Modular+Combinatorial+Assembly+of+Type+II-A+CRISPR+Arrays+for+dCas9-Mediated+Multiplex+Transcriptional+Repression+in+E.+coli.">CRISPathBrick: Modular Combinatorial Assembly of Type II-A CRISPR Arrays for dCas9-Mediated Multiplex Transcriptional Repression in E. coli.</a> ACS Synth Biol. 4 (9), 987-1000 (2015).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method.">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> J Vis Exp. (6), e253 (2007).</li><li>Zimmermann, J., Voss, H., Schwager, C., Stegemann, J., Ansorge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Sanger+dideoxy+sequencing+reaction+protocol.">Automated Sanger dideoxy sequencing reaction protocol.</a> FEBS Letters. 233 (2), 432-436 (1988).</li><li>Fujii, M., Matano, M., Nanki, K., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genetic+engineering+of+human+intestinal+organoids+using+electroporation.">Efficient genetic engineering of human intestinal organoids using electroporation.</a> Nat. Protoc. 10 (10), 1474-1485 (2015).</li><li>Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+video+protocol+of+retroviral+infection+in+primary+intestinal+organoid+culture.">A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture.</a> J Vis Exp. (90), e51765 (2014).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать. Заявители не объявили конфликта интересов.

В этом протоколе мы подробно изложим все шаги, необходимые для создания CRISPR-конкатэмеров и применения CRISPR-конкатемеров в органоидах кишечника мыши, чтобы одновременно выбить несколько генов. Как отмечалось ранее, эта стратегия имеет ряд преимуществ, таких как ее скорость, высокая эффективность и экономичность. Чтобы успешно выполнить всю процедуру, необходимо рассмотреть несколько важных аспектов. Во-первых, важно, чтобы все олигоны gRNA были надлежащим образом отожжены и фосфорилированы, поскольку они представляют собой исходный материал для реакции клонирования Bbs I, который сам по себе является очень эффективным. Во-вторых, когда электропорация органоидов, чем больше клеток используется для каждого состояния, тем выше максимальная эффективность трансфекции. Кроме того, важно также, что после диссоциации клеток мелкие клеточные кластеры преобладают над отдельными клетками. Тем не менее, можно встретить технические проблемыЛемы при попытке либо клонирования, либо трансфекции в первый раз; В случае проблем при клонировании гРНК рекомендуется дважды проверить последовательность олигонуклеазы gRNA и, если правильно, выбрать дополнительные колонии бактерий для скрининга с рестрикционным расщеплением. Если эффективность трансфекции и жизнеспособность клеток являются низкими после электропорации, тогда желательно повторить протокол, используя большее количество клеток для каждого состояния и уменьшая время диссоциации клеток до 3 мин. Хотя генерация CRISPR-конкатемеров относительно дешева и легка, использование крупномасштабных генетических экранов в органоидах не является, поскольку масштаб ограничен расходами, связанными с органоидной культурой и ее трудоемким характером. В этом случае стоит упомянуть, что метод CRISPR-concatemer также совместим с клеточными линиями, такими как HEK293 и эмбриональные стволовые клетки мыши. Независимо от сотовой системы, другой потенциальный недостаток этогоTrategy можно встретить при одновременном выбивании трех или четырех разных генов. Например, каждая gRNA будет иметь различную эффективность таргетинга и изменения попадания всех генов в одно и то же время могут быть относительно низкими; По этой причине целесообразно использовать систему конкатэмеров для направления более одной гРНК против одного и того же гена. На протяжении многих лет были предложены альтернативные стратегии, аналогично основанные на перетасовке «Золотых ворот» для генерации мультиплексных векторов gRNA 7 , 8 . Однако в нашем методе можно сразу собрать несколько gRNAs в один ретровирусный вектор за один раунд клонирования, что делает его пригодным для генерации библиотек gRNA для нацеливания на паралоги. Наш CRISPR-конкатэмер построен в ретровирусной векторной магистрали MSCV. Таким образом, gRNA-конкатемпер-содержащий ретровирус может быть использован для генерации стабильных клеточных линий, которые перегружаютRess gRNAs. В сочетании с Cas9-индуцируемой системой можно использовать индуцируемые паралогические нокауты с использованием нашей системы. Вкратце, здесь мы опишем, как клонировать до четырех разных gRNAs в один и тот же вектор за один шаг и как применять эту стратегию к органоидной культуре с высокой эффективностью трансфекции. Кроме того, мы предлагаем полезные предложения, чтобы максимизировать шансы на успех на протяжении всей процедуры.

Обратный генетический подход является широко используемым методом исследования функции гена. В частности, исследования потери функции, в которых разрушение гена вызывает фенотипические изменения, играют ключевую роль в построении нашего понимания биологических процессов. Метод CRISPR / Cas9 представляет собой последнее усовершенствование в технологии технологии генома и революционизировал существующую практику генетики в клетках и организмах. Cas9 представляет собой эндонуклеазу с РНК-направленностью, которая связывается с определенной последовательностью ДНК, комплементарной гРНК, и генерирует двухнитевый разрыв (DSB). Этот DSB рекрутирует устройство для восстановления ДНК, которое в отсутствие шаблона ДНК для гомологичной рекомбинации будет повторно лигировать вырезанную ДНК-цепь с помощью ошибочного гомологичного концевого соединения, что, таким образом, может привести к вставкам или делециям нуклеотидов (нуклеотидов) Вызывая мутации в рамке 1 . Большая легкость и универсальность CRISPR / Cas9 apprOach сделала его очень привлекательным инструментом для экранов с ножом для генома, направленных на распутывание неизвестных функций гена 2 , 3 . Тем не менее, подходы с одним нокаутом генов имеют ограниченное применение, если существуют множественные паралоги с избыточными функциями. Таким образом, удаление одного гена может быть недостаточным для определения функции этого гена при возможной компенсации паралогами, что приводит к незначительному или отсутствующему фенотипическому изменению 4 . Поэтому важно параллельно выбивать параллели, поставляя несколько векторов gRNA, нацеленных на различные паралоговые гены, чтобы преодолеть влияние генетической компенсации. Чтобы расширить использование CRISPR / Cas9 для нокаута паралогого гена, в последнее время мы разработали быстрый способ однократного клонирования для клонирования до четырех предварительно отожженных gRNAs в один ретровирусный вектор 5 . Основа, называемая CRISPR-concatemer, основанаНа ретровирусной плазмиде MSCV, содержащей повторяющиеся кассеты экспрессии gRNA. Каждая кассета содержит два перевернутых участка распознавания рестрикционного фермента типа IIS Bbs I, который может быть необратимо заменен отожженным олигоном gRNA с соответствующими свесами с использованием реакции перетасовки золотых ворот в одной пробирке 6 . Этот метод клонирования состоит из повторяющихся циклов пищеварения и лигирования, которые позволяют одновременную сборку нескольких фрагментов ДНК путем использования различных последовательностей навесов, генерируемых Bbs I. Уникальность этого фермента заключается, например, в возможности выполнять асимметричные срезы за пределами его распознавания последовательность; Поэтому каждая кассета может иметь различную последовательность с индивидуальными выступами, фланкирующими сайт Bbs I, и таким образом, каждая gRNA может быть клонирована в определенном положении и ориентации вектора конкатематора. В качестве доказательства принципа мы продемонстрировали использование этой стратегии вМышечных органоидов кишечника, одновременно разрушая две пары паралогичных отрицательных регуляторов пути Wnt одним кругом электропорации 5 . В течение последних нескольких лет многие другие группы разработали аналогичные стратегии, основанные на множественных векторах экспрессии gRNA, построенных с использованием перетасовки 7 « Золотых ворот», для достижения нокаута нескольких генов в различных модельных системах, таких как клеточные линии 8 , 9 , рыбок данио 10 и Escherichia coli 11 . В своих протоколах gRNAs сначала клонируются в отдельные промежуточные векторы и затем собираются вместе в один конечный продукт. Напротив, основным преимуществом нашей стратегии CRISPR-concatemer является удобство единственного шага по BBS I, клонирование. Как и другие конкатэмеры gRNA, наш метод позволяет либо одновременный нокаут до четырехРазличные гены или повышенную эффективность нокаута CRISPR после нацеливания одного или двух генов с множественными гРНК ( рис. 1 ). В этом протоколе мы подробно описываем каждый шаг в генерации векторов CRISPR-конкатэмера, от проектирования gRNA до реакции «Золотые ворота» и подтверждения успешного клонирования. Мы также предоставляем высокоэффективный протокол для трансфекции CRISPR-конкатемеров в мышиные малые кишечные органоиды путем электропорации и последующих экспериментов по выводу фактора роста.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="976">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Optimized CRISPR Design Tool</td>
			<td style="width:183px;">Feng Zhang group</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:395px;">CRISPR gRNA design tool; http://crispr.mit.edu/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Webcutter 2.0</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>restriction mapping tool; http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">T4 PNK (Polynucleotide Kinase)</td>
			<td style="width:183px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0201L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">T4 DNA ligase buffer</td>
			<td style="width:183px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">T7 DNA Ligase</td>
			<td style="width:183px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0318L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">DTT (dithiothreitol)</td>
			<td style="width:183px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">P1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">ATP (adenosine triphosphate)</td>
			<td style="width:183px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">P0756S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">FastDigest BbsI (BpiI)</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">FD1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:281px;">Tango buffer (BSA-containing restriction enzyme buffer)</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BY5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">BglII</td>
			<td style="width:183px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">EcoRI</td>
			<td style="width:183px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Plasmid-safe exonuclease</td>
			<td style="width:183px;">Cambio</td>
			<td style="width:119px;">E3101K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Thermal cycler</td>
			<td style="width:183px;">Applied biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4359659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">10G competent E. coli bacteria</td>
			<td style="width:183px;">Cambridge Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">60108-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Plasmid mini kit</td>
			<td style="width:183px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">12125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Table top microcentrifuge</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">UY-02580-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Inoculating loops</td>
			<td style="width:183px;">Microspec</td>
			<td style="width:119px;">PLS5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Bacteria incubator</td>
			<td style="width:183px;">Sanyo</td>
			<td style="width:119px;">MIR-262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Luria-Bertani broth (LB)</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L3522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Agarose</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A4718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Agarose gel electrophoresis apparatus</td>
			<td style="width:183px;">Bioneer</td>
			<td style="width:119px;">A-7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:281px;">Advanced DMEM/F12(cell culture medium)</td>
			<td style="width:183px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12634-034</td>
			<td style="width:395px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:281px;">Glutamax (L-Glutamine) 100x</td>
			<td style="width:183px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">35050-068</td>
			<td style="width:395px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:281px;">HEPES 1 M (buffering agent)</td>
			<td style="width:183px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15630-056</td>
			<td style="width:395px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:281px;">Penicillin-streptomycin 100x</td>
			<td style="width:183px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td style="width:395px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:281px;">B27 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 50x</td>
			<td style="width:183px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">17504-044</td>
			<td style="width:395px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:281px;">N2 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 100x</td>
			<td style="width:183px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">17502-048</td>
			<td style="width:395px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:281px;">n-Acetylcysteine 500 mM</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A9165-5G</td>
			<td style="width:395px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:281px;">Mouse EGF 500 &#181;g/mL</td>
			<td style="width:183px;">Invitrogen Biosource</td>
			<td style="width:119px;">PMG8043</td>
			<td style="width:395px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:281px;">Mouse Noggin 100 &#181;g/mL</td>
			<td style="width:183px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">250-38</td>
			<td style="width:395px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:281px;">Nicotinamide 1 M</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:281px;">R-Spondin conditioned medium</td>
			<td style="width:183px;">n.a.</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td style="width:395px;">Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013</td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:70px;width:281px;">Wnt conditioned medium</td>
			<td style="width:183px;">n.a.</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td style="width:395px;">Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:281px;">Y-27632 10 &#181;M</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Y0503-1MG</td>
			<td style="width:395px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Standard BD Matrigel matrix</td>
			<td style="width:183px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">48-well Plate</td>
			<td style="width:183px;">Greiner Bio One</td>
			<td style="width:119px;">677980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:281px;">CHIR99021</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3734-1MG</td>
			<td style="width:395px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">IWP-2</td>
			<td style="width:183px;">Cell Guidance Systems</td>
			<td style="width:119px;">SM39-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">TrypLE (recombinant protease)</td>
			<td style="width:183px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Opti-MEM (reduced serum medium )</td>
			<td style="width:183px;">Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">51985-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Electroporation Cuvettes 2mm gap</td>
			<td style="width:183px;">NepaGene</td>
			<td style="width:119px;">EC-002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Low binding 15 mL tubes</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">CLS430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">B&#252;rker&#8217;s chamber</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">BR719520-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">NEPA21 Super Electroporator</td>
			<td style="width:183px;">NepaGene</td>
			<td style="width:119px;">contact supplier</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Protein LoBind tubes low binding</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">10708704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">BTXpress electroporation buffer</td>
			<td style="width:183px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:119px;">45-0805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td style="width:183px;">AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A3672</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a protocol for multiple gene knockout in mouse small intestinal organoids using a crispr-concatemer

Технология CRISPR / Cas9 значительно улучшила осуществимость и скорость исследований потери функции, которые необходимы для понимания функции генов. У более высоких эукариот паралогичные гены могут маскировать потенциальный фенотип, компенсируя потерю гена, тем самым ограничивая информацию, которая может быть получена из генетических исследований, основанных на выпадениях одного гена. Мы разработали новый метод быстрого клонирования направляющих конъюгатов РНК (gRNA), чтобы создать многоцелевые нокауты после одного раунда трансфекции в небольших органных клетках мыши. Наша стратегия позволяет конкатмеризовать до четырех отдельных gRNAs в один вектор, выполняя одну реакцию Shuffling Golden Gate с отожженными олигонами gRNA и предварительно разработанным ретровирусным вектором. Это позволяет либо одновременный нокаут до четырех разных генов, либо повысить эффективность нокаута после нацеливания одного гена несколькими гРНК. В этом протоколе мы подробно показываемКак эффективно клонировать несколько гРНК в ретровирусный вектор CRISPR-concatemer и как добиться высокоэффективной электропорации в кишечных органоидах. В качестве примера мы показываем, что одновременный нокаут двух пар генов, кодирующих отрицательные регуляторы сигнального пути Wnt (Axin1 / 2 и Rnf43 / Znrf3), делает кишечные органоиды устойчивыми к отмене ключевых факторов роста.

Чтобы подтвердить наличие правильного количества вставок gRNA в векторе конкатенатора , рестрикционное расщепление выполняется ферментами ( EcoR I + Bgl II), фланкирующими все gRNA-экспрессирующие кассеты (каждый размер кассеты составляет ~ 400 п.о., рис. 1 ). Например, при генерации вектора 4 gRNA-concatemer ожидаемый размер нижней полосы в агарозном геле составляет приблизительно 1,6 Kbp; Любая полоса ниже этого указывает на то, что не все 4-граммовые кассеты вставляются в вектор ( рис. 2А ). Кроме того, всегда рекомендуется проверить, что все сайты распознавания Bbs I потеряны, и фермент не разрезает вектор ( рисунок 2B ). Как только конструкции будут подтверждены, они могут быть доставлены в мышиные органоиды кишечника путем электропорации для достижения оптимальныхЛ уровня эффективности трансфекции (до 70%), как показано GFP-контролем ( рис. 3 ). Наконец, чтобы функционально проверить эффективность этой стратегии, кишечные органоиды, трансфецированные векторами Cas9 и concatemer против Axin1 / 2 и Rnf43 / Znrf3, культивировали в EN (вывод R-spondin) и EN + IWP2 (удаление R-spondin и Wnt, IWP2 : Ингибитор возбуждения, 2,5 мкМ) в течение минимум 3 проходов ( рисунок 4 ). В то время как нетрансфицированные органоиды WT умерли в обоих условиях, Axo1 / 2 нокаутированные органоиды выживали как из-за последующей активации Wnt-пути; Кроме того, мутантные органоиды Rnf43 / Znrf3 выживают в отсутствие R-спондина, но не могут выжить в присутствии IWP2, что приводит к истощению Wnt, который активирует путь. Взятые вместе, эти наблюдения показывают, что нокаут этих пар паралоги возможен путем генерации tОн ожидал фенотипа органоида. Подробная информация об этих результатах опубликована в биологии развития 5 . <img alt="Рисунок 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55916/55916fig1.jpg" /> Рисунок 1: Схематическое представление CRISPR-конкатэмера с 4 кассетами. Схема вектора 4 gRNA-concatemer с каждой кассетой 400 bp, содержащей промотор U6, два перевернутых повторяющихся Bbs I-сайта (также обозначенных как BB) и gRNA-эшафоты в этом порядке. Во время реакции перетасовки сайты Bbs I заменяются фрагментами рРНК с соответствующими свесами и, следовательно, теряются. Связывающие участки секвенирующих праймеров для проверки правильности введения олигонов gRNA показаны синими стрелками. Fwd = прямой праймер, Rev = обратный праймер, Link 1/2/3 = области компоновки 1/2/3. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55916/55916fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста с</a>Лизать здесь, чтобы просмотреть большую версию этого рисунка. <img alt="фигура 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55916/55916fig2.jpg" /> Рисунок 2: Репрезентативные схемы вываривания векторов конкатемеров. ( A ) Двойное переваривание 3 и 4 векторов gRNA- конкатэмера с EcoR I и Bgl II. Правильная картина пищеварения отмечена зеленым тиком, тогда как векторы с 1 или 2 гРНК-вставками отмечены красным крестом. Дорожка 1 показывает переваривание родительского вектора 4 гРНК-конкатэмера, используемого в качестве положительного контроля (обозначается «+»); Аналогично, дорожка 5 показывает переваривание родительского вектора 3 гРНК-конкатэмера, обозначенного буквой «+». ( B ) Пищеварение с Bbs I, показывающее правильный размер непереваренных векторов конкатэмера (обозначенных зелеными клещами). Переваривание gRNA-содержащего вектора конкатэмера , которое потеряло сайты Bbs I, используется в качестве положительного контроля иD помечен знаком «+». <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55916/55916fig2large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a> <img alt="Рисунок 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55916/55916fig3.jpg" /> Рисунок 3: Типичное изображение успешно электропористых кишечных органоидов. Трансфекция плазмиды GFP играет важную роль в оценке эффективности трансфекции. Примерно через 24 часа после электропорации органоиды, содержащие небольшое количество клеток, уже видны, и, если процедура электропорации прошла успешно, до 70% из них отображает зеленую флуоресценцию. BF = яркое поле, GFP = зеленый флуоресцентный белок. Шкала шкалы = 2000 мкм. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55916/55916fig3large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a> Рисунок 4: Репрезентативные изображения мутантных кишечных органоидов. Нокаут отрицательных регуляторов Wnt-пути Axin1 и Rnf43 вместе со своими паралогами приводит к тому, что кишечные органоиды устойчивы к лихорадочным факторам роста. В частности, Axin1 / 2 нокаутирующие органоиды (Axin1 / 2 KO) могут расти в отсутствие как R-спондинов (EN: EGF + Noggin), так и Wnt (EN + IWP2: EN + ингибитор пирсипина), тогда как Rnf43 / Znrf3-мутантные органоиды (R &amp; Z KO) может выживать только в отсутствие R-spondin (EN). Напротив, органоиды WT могут выживать только в контрольной культуре, WENR + Nic (Wnt + EGF + Noggin + R-spondin + Nicotinamide). Шкала шкалы = 1000 мкм. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55916/55916fig4large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-Page = &quot;1&quot; fo: keep-with-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> Базальная среда </td><td></td><td> Комментарии </td></tr><tr><td> Хранить при 4 ° C в течение 4 недель </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Культуральная среда для клеток </td><td> 500 мл </td><td> См. Таблицу материалов </td></tr><tr><td> L-глутамин 100x </td><td> 5 мл </td><td></td></tr><tr><td> Буферный агент 1 M </td><td> 5 мл </td><td> См. Таблицу материалов </td></tr><tr><td> Пенициллин стрептомицин 100х </td><td> 5 мл </td><td></td></tr><tr><td> WENR + Nic (Wnt + EGF + Noggin + R-спондин + никотинамид) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Хранить при температуре 4 ° C в течение 2 недель </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Базальная среда </td><td> До 50 мл </td><td></td></tr><tr><td> Нейронная клетка без сыворотки (50x) </td><td> 1 мл </td><td> См. Таблицу materials </td></tr><tr><td> Нейронная клетка без сыворотки (100x) </td><td> 500 мкл </td><td> См. Таблицу материалов </td></tr><tr><td> Н-ацетилцистеин (500 мМ) </td><td> 125 мкл </td><td></td></tr><tr><td> EGF мыши (100 мкг / мл) </td><td> 25 мкл </td><td></td></tr><tr><td> Мышь Noggin (100 мкг / мл) </td><td> 50 мкл </td><td></td></tr><tr><td> Кондиционированная среда R-Spondin </td><td> 5 мл </td><td></td></tr><tr><td> Кондиционированная среда Wnt3a </td><td> 25 мл </td><td></td></tr><tr><td> Никотинамид (1 М) </td><td> 250 мкл </td><td></td></tr><tr><td> EN + CHIR + Y-27632 (EGF + Noggin + CHIR + Y-27632) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Хранить при температуре 4 ° C в течение 2 недель </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Базальная среда без пенициллина Стрептомицин </td><td> До 20 мл </td><td></td></tr><tr><td>Нейронная клетка без сыворотки (50x) </td><td> 400 мкл </td><td> См. Таблицу материалов </td></tr><tr><td> Нейронная клетка без сыворотки (100x) </td><td> 200 мкл </td><td> См. Таблицу материалов </td></tr><tr><td> Н-ацетилцистеин (500 мМ) </td><td> 50 мкл </td><td></td></tr><tr><td> EGF мыши (100 мкг / мл) </td><td> 10 мкл </td><td></td></tr><tr><td> Мышь Noggin (100 мкг / мл) </td><td> 20 мкл </td><td></td></tr><tr><td> Y-27632 (10 мкМ) </td><td> 20 мкл </td><td></td></tr><tr><td> CHIR99021 (8 мкМ) </td><td> 10 мкл </td><td></td></tr><tr><td> EN (EGF + Noggin) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Хранить при 4 ° C в течение 4 недель </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Базальная среда </td><td> До 50 мл </td><td></td></tr><tr><td> Нейронная клетка без сыворотки (50x) </td><td&gt; 1 мл </td><td> См. Таблицу материалов </td></tr><tr><td> Нейронная клетка без сыворотки (100x) </td><td> 500 мкл </td><td> См. Таблицу материалов </td></tr><tr><td> Н-ацетилцистеин (500 мМ) </td><td> 125 мкл </td><td></td></tr><tr><td> EGF мыши (100 мкг / мл) </td><td> 25 мкл </td><td></td></tr><tr><td> Мышь Noggin (100 мкг / мл) </td><td> 50 мкл </td><td></td></tr></tbody></table> Таблица 2: Состав органоидов.

Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer at JoVE.com

A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer

В этом протоколе описаны этапы клонирования нескольких однонаправленных РНК в один направляющий вектор-конкатенатор РНК, который особенно полезен при создании нокаутов с несколькими генами с использованием технологии CRISPR / Cas9. Появление двойных нокаутов в органоидах кишечника показано как возможное применение этого метода.

Протокол для множественного нокаута гена в мышиных органоидах малого кишечника Использование CRISPR-конкатэмера

CRISPR/Cas9 technology has greatly improved the feasibility and speed of loss-of-function studies that are essential in understanding gene function. In ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

Изготовление Электрохимические ДНК-биосенсоры для Безреагентная Обнаружение нуклеиновых кислот, белков и малых молекул

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Создание двумерных рисунком Подложки для конфайнмента белков и клеточных

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

Сотовая Добыча липидов для целевой Стабильный изотопного разбавления жидкостной хроматографии-масс-спектрометрического анализа

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

Микрофлюидных устройство для изучения нескольких различных штаммов

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Использование Tomoauto: протокол для высокой пропускной автоматизированной Cryo-электронной томографии

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Недвижимость Мониторинг Время внутриклеточного желчных кислот Dynamics Использование генетически кодируемых FRET основе желчных кислот датчик

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

Протокол для Decellularizing Cochleae мыши для внутреннего уха тканевая инженерия

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Визуального обнаружения нескольких нуклеиновых кислот в массиве капилляров

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Репрессии транскрипции гена, перенаправив клеточными с химической эпигеномные модификаторы

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Проведение нескольких режимов изображения с одной флуоресцентным микроскопом

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...