Name: investigating von willebrand factor pathophysiology using a flow chamber model of von willebrand factor-platelet string formation
Uploaded: 2017-08-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation at JoVE.com

ميشيل أليسون مستلم فردريك بانتنغ و "تشارلز أفضل كندا منحة الخريجين" من المعاهد الكندية للبحوث الصحية (استوفوا). لورا ل. سويستون هو زمالة استوفوا المستلم. ليليكراب ديفيد هو المستفيد من "كرسي أبحاث كندا" في "الأرقاء الجزيئية". تم تمويل هذه الدراسة في الجزء من استوفوا التشغيل منحة (اجتماع-97849).

ووافقت هذه الدراسات جامعة في كندا "بحوث أخلاقيات المجلس للملكة".
1. تنشيط الخلية بطانية
<ol><li>
الكولاجين-معطف طبق استنبات الأنسجة 6-جيدا.
	<ol>
<li>24 ساعة مقدما، معطف طبق استنبات الأنسجة 6-جيدا في 37 درجة مئوية مع 1 مل الكولاجين المخزن المؤقت (50 ميكروغرام/مل الفئران الذيل ال?...

بينما الفسيولوجية أهمية الصفائح الدموية VWF سلاسل تظل مثيرة للجدل بسبب انحلالها السريع حضور حوزتي ناهضة VWF ADAMTS13، هي بمثابة نموذج قابلة للقياس في المختبر للتوظيف الصفائح الدموية التي فوف إلى موقع في قد تشكل خثرة حضور مترجم زيادات في مستويات هيستون5. وعلاوة على ذلك، في الأم?...

تجلط الدم هو سبب الرئيسي للوفيات في جميع أنحاء العالم1 ويمكن أن تتطور في الاستجابة توديسريجولاتيد الصفائح الدموية التنشيط وثرومبين جيل في الشرايين فينساند على حد سواء. مستويات البلازما VWF منظم رئيسي تخثر الدم، ومستويات منخفضة حيث (< 50%) يؤدي إلى اضطراب النزيف المعروف باسم فون ويليبراند المرض (VWD)2 ومستويات عالية (> 150%) ترتبط بزيادة خطر وريدي3 و تجلط الدم الشرياني4 .
فوف بروتين سكري مولتيميريك توليفها من قبل ميجاكاريوسيتيس وخلايا بطانية وتخزينها في الصفيحات α-حبيبات و WPBs، على التوالي. عند التحدي مرقئ، يمكن إصدار VWF من WPBs بطانية إلى حبل الصفائح الدموية المتداولة لتنشيط خلايا بطانية5 أو الكولاجين المكشوفة في جدار السفينة6. لقد ثبت رسو من فوف إلى خلايا بطانية أن توسط سيليكتين ف7 وانتغرين αvβ38. إطلاق سراح اللاحقة من مخازن α-الحبيبية الصفائح الدموية يمكن زيادة تركيزات VWF المترجمة استقرار التفاعلات الصفائح الدموية-الصفائح الدموية للصفائح الدموية تكوين التوصيل، سقالة اللازمة لنشر تتالي التخثر وفيبرينوجين الترسب. وينظم نشاط الصفائح الدموية-ربط VWF هيكلها مولتيميريك، مع مولتيميرس الوزن الجزيئي العالية التي تمتلك أكبر نشاط مرقئ9،10. في الدورة الدموية، فوف أيضا بمثابة ناقل لعامل تخثر الدم الثامن.
إجهاد القص السائل منظم أساسي لفسيولوجيا VWF. نظراً لغياب إجهاد القص، يوجد VWF في شكل كروي، إخفاء المجالات الملزمة للصفيحات بروتين سكري Ib التصاق11. عند وجود إجهاد القص، يتعرض موقع الانقسام ميتالوبروتيسي، ديسينتيجرين وميتالوبروتيسي مع ثرومبوسبوندين عزر (ADAMTS13)،. ADAMTS13 كليفس سلاسل VWF عارية وزينت الصفائح الدموية لتنظيم حجم مولتيمير، مما يقلل من نشاط مرقئ به12.
فوف بروتين المرحلة الحادة، ومحفزات عديدة، بما في ذلك نقص13وإصابة14السيتوكينات proinflammatory، قد ثبت للتوسط من أجل الإفراج عن فوف من خلايا بطانية. مماثلة إلى أخرى التحريضية وكلاء، histones خارج الخلية قد أظهرت أيضا للحث على إطلاق سراح VWF النظمية في الفئران15،16 وتنشيط الصفائح الدموية في المختبر17،18، 19. هذا تبين أن يتوقف على نوع فرعي هستون، كالاختلافات في يسين ومحتوى ارجينين قد تؤثر على وظيفة15. لدينا أهداف الدراسة إلى إنشاء دائرة لتدفق نموذج للتحقيق في تأثير يسين-الغنية (هونج كونج) والمخططات هستون (HR) الغنية ارجينين و secretagogues على إطلاق سراح VWF بطانية والصفائح الدموية في الوقت الحقيقي التقاط، الأحداث المبكرة المحتملة في تجلط الدم الناجم عن التهاب.
ويجمل هذه المنهجية الدائرة تدفق في فيفو التفاعلات بين الكولاجين سوبيندوثيليال وخلايا بطانية، فوف، والصفائح الدموية في المختبر نظام البصرية واستنساخه، وقابلة للقياس. أنها تسمح للتقييم في الوقت الحقيقي لجميع جوانب المسار الذي ينظم التفاعلات VWF-الصفائح الدموية، بما في ذلك إفراز WPB وتنشيط الصفائح الدموية وبروتيوليسيس فوف. استخدمت الدراسات VWF تحت ظروف الإجهاد القص الخاضعة للرقابة لتقييم VWD الطفرات التي تضر بالإفراج عن فوف و وظيفة الصفائح الدموية-ملزمة20، WPB فسيولوجيا21، والانقسام فوف ADAMTS135. ونحن نستخدم هذه المنهجية للتحديد الكمي لتشكيل سلسلة VWF-الصفائح الدموية نتيجة حافز تحريضية: histones خارج الخلية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Calf-thymus unfractionated histones (UH)</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>HLY</td>
			<td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf-thymus lysine-rich histones (HK)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H5505</td>
			<td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf-thymus arginine-rich histones (HR)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4830</td>
			<td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td>Reconstituted in DMSO (20 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7125-1G</td>
			<td>Reconstituted in water (50 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39; Dihexyloxacarbocyanine Iodide (DiOC6)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D273</td>
			<td>Reconstituted in methanol (20 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-VWF Coating Antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0082</td>
			<td>For VWF ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-VWF Detection Antibody, HRP conjugated</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>P0026</td>
			<td>For VWF ELISA and histone-VWF binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MaxiSorp flat-bottom 96-well microplates</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>44-2404-21</td>
			<td>For histone-VWF binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immulon 4 HBX Flat Bottom Microtiter 96-Well Plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3855</td>
			<td>For VWF ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humate-P</td>
			<td>CSL Behring</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plasma-derived human von Willebrand factor/factor VIII complex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Reference Plasma</td>
			<td>Precision BioLogic</td>
			<td>CCNRP-05</td>
			<td>For VWF ELISA standard curve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD) reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8287</td>
			<td>Equivalent product available through ThermoFisher Scientific (Catalogue Number: 34006)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>For culturing and initial seeding of BOEC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat-tail Collagen Type 1</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td>For endothelial cell stimulations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>METAMORPH Microscopy Automation and Image Analysis Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Blood Collection Tubes, No Additive</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>366703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide III 0.1 (flow chambers)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td></td>
			<td>This product has been discontinued. We suggest using &#181;-Slide VI 0.1 (#80661) or 0.4 (# 80601) and recalculating flow rate and platelet volume needed to maintain a shear stress of 4.45 dyn/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Tubing 1.6 mm ID: 5 m, sterilized</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock Connector Female: natural Polypropylene, sterilized</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elbow Luer Connector Male: white Polypropylene, sterilized</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunted 18G Needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quorum WaveFX- 4X1 spinning disk microscope</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating von willebrand factor pathophysiology using a flow chamber model of von willebrand factor-platelet string formation

عامل فون ويليبراند (فوف) عامل تخثر بروتين سكري مولتيميريك الذي يتوسط التصاق الصفائح الدموية وتجميعها في مواقع الضرر بطانية وأن يحمل العامل الثامن في الدورة الدموية. فوف يتم تصنيعه من قبل خلايا بطانية وهو أما تطلق مؤثرا في البلازما أو المخزنة في العضيات المتخصصة، ودعا الهيئات بلادي ويبيل (WPBs)، للإفراج على الطلب استجابة للتحدي مرقئ. سرعة يمكن أن يستحث المحفزات بروكواجولانت و proinflammatory WPB الرقابة وإطلاق سراح فوف. غالبية VWF صدر عن خلايا بطانية يدور في البلازما؛ ومع ذلك، يرتكز نسبة فوف إلى سطح الخلية البطانية. يمكن ربط VWF غشائي مرتبط تحت ظروف فسيولوجية القص، الصفائح الدموية، تشكيل سلسلة VWF-الصفائح الدموية التي قد تمثل nidus تكوين خثرة. يمكن استخدام نظام دائرة تدفق بصريا مراقبة الإفراج عن فوف من خلايا بطانية والصفائح الدموية اللاحقة القبض بطريقة استنساخه وذا صلة الفسيولوجيا المرضية لتكوين خثرة VWF بوساطة. باستخدام هذه المنهجية، خلايا بطانية تربى في حجرة تدفق وتحفز في وقت لاحق مع secretagogues للحث على الرقابة WPB. ثم هي perfused الصفائح غسلها عبر البطانة المنشط. الصفائح الدموية يتم تفعيلها، وبعد ذلك ربط سلاسل VWF ممدود في اتجاه تدفق السائل. استخدام histones خارج الخلية كحافز بروكواجولانت و proinflammatory، لاحظنا زيادة تشكيل سلسلة VWF-الصفائح الدموية في خلايا بطانية تعامل هيستون مقارنة بخلايا بطانية غير المعالجة. ويصف هذا البروتوكول إجراء تقييم كمي والبصرية في الوقت الحقيقي لتنشيط التفاعلات VWF-الصفائح الدموية في نماذج تجلط الدم والارقاء.

لتقييم تأثير هيستونيس على الإصدار فوف من خلايا بطانية مباشرة، نتعرض بوكس المتلاقية لسلطة النقد الفلسطينية التي تحتوي على المتوسط خالية من المصل (مراقبة إيجابية)، آه، الموارد البشرية، ودولار هونج كونج ح 2. لقد أظهرنا أن هونج كونج الناجم عن زيادة إضعاف نسبة بروتين فوف (VWF:Ag)...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation at JoVE.com

Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation

في هذه الورقة، ويصف لنا طريقة لتقييم غشائي فون ويليبراند الإفراج عن عامل والصفائح الدموية اللاحقة التقاط إجهاد القص السوائل في الاستجابة للمحفزات التحريضية باستخدام نظام دائرة تدفق في المختبر .

التحقيق فون "ويليبراند عامل الفيزيولوجيا المرضية باستخدام" نموذج دائرة تدفق فون ويليبراند عامل-الصفائح الدموية "تشكيل سلسلة"

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation

وظيفية تقييم الحركة المعوية والتهاب الأمعاء الجدار في القوارض: التحليلات في نموذج موحد من التلاعب المعوية

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common reason for a variety of human diseases. Animal research models are critical in investigating the ...

Orthotopic Small Bowel Transplantation in Rats

زرع مثلي الأمعاء الصغيرة في الفئران

Small  bowel transplantation has become an accepted clinical option for patients with  short gut syndrome and failure of parenteral nutrition ...

The Rabbit Blood-shunt Model for the Study of Acute and Late Sequelae of Subarachnoid Hemorrhage: Technical Aspects

الأرنب نموذج الدم تحويلة لدراسة الحاد وعقابيل في وقت متأخر نزيف تحت العنكبوتية: الجوانب التقنية

Early brain injury and delayed cerebral vasospasm both contribute to unfavorable outcomes after subarachnoid hemorrhage (SAH). Reproducible and ...

Mouse Model of Alloimmune-induced Vascular Rejection and Transplant Arteriosclerosis

نموذج الفأر من منيع للمستضد الخيفي الناجم عن رفض الأوعية الدموية وزراعة تصلب الشرايين

Vascular rejection that leads to transplant arteriosclerosis (TA) is the leading representation of chronic heart transplant failure. In TA, the immune ...

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

الاستراتيجية غشائي أنبوب خلية تشكيل الفحص: مقارنة خارج الخلية مصفوفة وعامل نمو مخفض خارج الخلية مصفوفة

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

Micro-dissection of Enamel Organ from Mandibular Incisor of Rats Exposed to Environmental Toxicants

الصغير-تشريح الجهاز المينا من الفك السفلي القاطعة للفئران المعرضة إلى سميات البيئية

Enamel defects resulting from environmental conditions and ways of life are public health concerns because of their high prevalence. These defects result ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

متساوي القياس كونتراكتيليتي القياس الشريان المساريقي العلوي الماوس باستخدام أسلاك ميوجرافي

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Vagus Nerve Stimulation As an Adjunctive Neurostimulation Tool in Treatment-resistant Depression

تحفيز العصب المبهم كأداة نيوروستيموليشن مرافقة في الاكتئاب المقاوم للعلاج

Vagus nerve stimulation (VNS) is an approved neurostimulation therapy. The purpose of the method is to treat patients with therapy-resistant depression ...

An In Vitro Hemodynamic Loop Model to Investigate the Hemocytocompatibility and Host Cell Activation of Vascular Medical Devices

نموذج حلقة الدم في المختبرية للتحقيق في التوافق الهيموسيتوفية وتنشيط الخلية المضيفة للأجهزة الطبية الوعائية

In this study, the hemocompatibility of tubes with an inner diameter of 5 mm made of polyvinyl chloride (PVC) and coated with different bioactive ...

Surfactant Depletion Combined with Injurious Ventilation Results in a Reproducible Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS)

Surfactant Depletion Combined with Injurious Ventilation Results in a Reproducible Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome ARDS

استنفاد السطحي جنبا إلى جنب مع نتائج التهوية الضارة في نموذج قابل للاستنساخ من متلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS)

Various animal models exist to study the complex pathomechanisms of the acute respiratory distress syndrome (ARDS). These models include pulmo-arterial ...