Name: investigating von willebrand factor pathophysiology using a flow chamber model of von willebrand factor-platelet string formation
Uploaded: 2017-08-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation at JoVE.com

Alison Michels er en modtager af en Frederick Banting og Charles Best Canada Graduate stipendium fra canadiske institutter for sundhed Research (CIHR). Laura L. Swystun er modtageren en CIHR fellowship. David Lillicrap er modtageren af en Canada forskning stol i molekylær hæmostase. Denne undersøgelse var delvis finansieret af en CIHR drift tilskud (MOP-97849).

Disse undersøgelser blev godkendt af forskning etik bord på Queen's University, Canada.
1. endotel celle Stimulation
<ol><li>
Kollagen-coat en 6-godt vævskultur plade.
	<ol>
<li>24 timer i forvejen, pels 6-godt vævskultur plade ved 37 ° C med 1 mL af kollagen buffer (50 µg/mL rotte hale kollagen type 1 med 0,02 M iseddike).</li>
		<li>Brøndene vaskes to gange med 2 mL af Hank's Balanced Salt løsning (HBSS). Bemærk: Plader kan være pakket ind i sølvpapir og opbe...

Mens den fysiologiske relevansen af VWF-trombocyttal strygere er fortsat kontroversielt på grund af deres hurtige opløsning i overværelse af VWF holde protease ADAMTS13, tjener de som en kvantificerbar in vitro- model af trombocyt rekruttering af VWF til et websted på som en blodprop kan danne i lokaliseret stigninger i Histon niveau5. Derudover i patologier mangler ADAMTS13 aktivitet-sådan som trombotisk thrombocytopenisk purpura (TTP) - eller i inflammatorisk microenvironments - hv...

Trombose er en førende årsag til dødelighed på verdensplan1 og kan udvikle sig i svar todysregulated trombocyt aktivering og thrombin generation i begge veinsand arterier. Plasmaniveauer af VWF er et centralt regulator af blodets koagulation, hvorved lave niveauer (< 50%) resultere i blødningsforstyrrelse kendt som von Willebrands sygdom (VWD)2 og høje niveauer (> 150%) er forbundet med en øget risiko for venøs3 og arteriel4 trombose.
VWF er en multimeriske glycoprotein syntetiseret af megakaryocytes og endotelceller og gemt i trombocyttal α-granulat og WPBs, henholdsvis. Ved hæmostatisk udfordring, kan VWF frigøres fra endotel WPBs hen til tether cirkulerende blodplader aktiveret endotelceller5 eller eksponerede kollagen på fartøjet væg6. Forankring af VWF i endothelial celler har vist sig at være medieret af P-selectin7 og integrin αvβ38. Den efterfølgende frigivelse af trombocyt α-granul butikker kan yderligere øge lokaliserede VWF koncentrationer for at stabilisere trombocyt-trombocyttal interaktioner for trombocyttal stikket dannelse, skafottet nødvendige for opformering af koagulationskaskaden og fibrin deposition. Trombocyt-bindende aktivitet af VWF er reguleret ved sin multimeriske struktur, med høj-Molekylær vægt multimerer besidder større hæmostatisk aktivitet9,10. I omløb fungerer VWF også som en transportør for koagulation faktor VIII.
Flydende shear stress er en væsentlig regulator af VWF fysiologi. I mangel af shear stress findes VWF i kugleformede form, skjuler bindende domæner for trombocyt glycoprotein Ib vedhæftning11. Når shear stress er til stede, er kavalergang site for en metalloprotease, en disintegrin og metalloprotease med thrombospondin motiv (ADAMTS13), udsat. ADAMTS13 kløver nøgen og trombocyttal-dekoreret VWF strygere for at regulere multimer størrelse, hvorved dens hæmostatisk aktivitet12.
VWF er en akut-fase proteiner, og mange stimuli, herunder hypoxi13, infektion14og proinflammatoriske cytokiner, har vist sig at mægle VWF frigivelse fra endotelceller. Ligner andre inflammatoriske agenter, ekstracellulære histoner har også vist sig at fremkalde systemisk VWF udgivelse i mus15,16 og aktivering af trombocytter i vitro17,18, 19. det viste sig at være afhængig af Histon subtype, som forskelle i Lysin og arginin indhold kan påvirke funktion15. Vores undersøgelse har til formål at etablere et flow kammer model for at undersøge indflydelsen af lysin-rige (HK) og argininog-rige (HR) Histon undertyper og secretagogues på endotel VWF udgivelse og real-time trombocyt fange, potentielle tidlige begivenheder i betændelse-induceret trombose.
Dette flow kammer metode sammenfatter i vivo interaktioner mellem subendothelial kollagen, endotelceller, VWF og blodplader i en in vitro- system, der er visuel, reproducerbare og kvantificerbare. Det giver mulighed for real-time vurdering af alle aspekter af den vej, der regulerer VWF-trombocyttal interaktioner, herunder WPB sekretion, trombocyt aktivering og VWF proteolyse. Undersøgelser af VWF kontrolleret shear stress betingelser har været brugt til at evaluere VWD mutationer, der forringer VWF frigivelse og trombocyttal-bindende funktion20, WPB fysiologi21, VWF spaltning af ADAMTS135. Vi bruger denne metode til at kvantificere VWF-trombocyttal streng dannelse som følge af en inflammatorisk stimulus: ekstracellulære histoner.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Calf-thymus unfractionated histones (UH)</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>HLY</td>
			<td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf-thymus lysine-rich histones (HK)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H5505</td>
			<td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf-thymus arginine-rich histones (HR)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4830</td>
			<td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td>Reconstituted in DMSO (20 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7125-1G</td>
			<td>Reconstituted in water (50 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39; Dihexyloxacarbocyanine Iodide (DiOC6)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D273</td>
			<td>Reconstituted in methanol (20 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-VWF Coating Antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0082</td>
			<td>For VWF ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-VWF Detection Antibody, HRP conjugated</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>P0026</td>
			<td>For VWF ELISA and histone-VWF binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MaxiSorp flat-bottom 96-well microplates</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>44-2404-21</td>
			<td>For histone-VWF binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immulon 4 HBX Flat Bottom Microtiter 96-Well Plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3855</td>
			<td>For VWF ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humate-P</td>
			<td>CSL Behring</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plasma-derived human von Willebrand factor/factor VIII complex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Reference Plasma</td>
			<td>Precision BioLogic</td>
			<td>CCNRP-05</td>
			<td>For VWF ELISA standard curve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD) reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8287</td>
			<td>Equivalent product available through ThermoFisher Scientific (Catalogue Number: 34006)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>For culturing and initial seeding of BOEC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat-tail Collagen Type 1</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td>For endothelial cell stimulations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>METAMORPH Microscopy Automation and Image Analysis Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Blood Collection Tubes, No Additive</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>366703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide III 0.1 (flow chambers)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td></td>
			<td>This product has been discontinued. We suggest using &#181;-Slide VI 0.1 (#80661) or 0.4 (# 80601) and recalculating flow rate and platelet volume needed to maintain a shear stress of 4.45 dyn/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Tubing 1.6 mm ID: 5 m, sterilized</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock Connector Female: natural Polypropylene, sterilized</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elbow Luer Connector Male: white Polypropylene, sterilized</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunted 18G Needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quorum WaveFX- 4X1 spinning disk microscope</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating von willebrand factor pathophysiology using a flow chamber model of von willebrand factor-platelet string formation

Von Willebrands faktor (VWF) er en multimeriske glycoprotein koagulationsfaktor der medierer trombocyt adhæsion og aggregation på websteder i endothelial skader og der bærer faktor VIII i omløb. VWF er syntetiseret af endothelceller og frigives enten constitutively i plasma eller er lagret i specialiserede organelles, kaldet Weibel-Palade organer (WPBs), for on demand release svar på hæmostatisk udfordring. Prokoagulant og proinflammatoriske stimuli kan hurtigt inducerer WPB exocytose og VWF frigivelse. Fleste af VWF udgivet af endothelceller cirkulerer i plasma; dog er en del af VWF forankret i endothelial celleoverfladen. Betingelser for fysiologiske shear kan endotel-forankrede VWF binde til blodplader, danner en VWF-trombocyttal streng, der kan repræsentere nidus af blodprop dannelse. En flow kammer system kan bruges til visuelt observere frigivelsen af VWF fra endotelceller og den efterfølgende trombocyt fange på en måde, der er reproducerbare og relevante for Patofysiologi af VWF-medieret blodprop dannelse. Brug denne metode, endotelceller er kulturperler i et flow kammer og er efterfølgende stimuleret med secretagogues til at fremkalde WPB exocytose. Vasket blodplader er derefter perfunderet over aktiverede endotelet. Blodpladerne er aktiveret og derefter binde til aflange VWF strygere i retning af flydende flow. Ved hjælp af ekstracellulære histoner som en prokoagulant og proinflammatoriske stimulus, observeret vi øget VWF-trombocyttal streng dannelse på Histon-behandlede endotelceller sammenlignet med ubehandlet endotelceller. Denne protokol beskriver en kvantitativ, visuelle og real-time vurdering af aktivering af VWF-trombocyttal interaktioner i modeller for trombose og hæmostase.

For at direkte vurdere effekten af histonerne på VWF frigivelse fra endotelceller, udsættes vi sammenflydende BOECs til serumfrit medium indeholdende PMA (positiv kontrol), UH, HR og HK for 2 h. Vi viste, at HK induceret en 2-fold stigning i VWF protein (VWF:Ag) i medium af behandlede endotelceller (figur 1). Interessant, da BOECs blev stimuleret med UH og HR, blev der mindre VWF:Ag registreret i medium end i ubehandlet tilstand. Vi antager, at fordi histon...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation at JoVE.com

Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation

I dette papir, vi beskriver en metode til at vurdere endotel von Willebrands faktor frigivelse og den efterfølgende trombocyt fange under væske shear stress reaktion på inflammatoriske stimuli ved hjælp af en in vitro- flow kammer system.

Undersøge von Willebrands faktor Patofysiologi bruger en Flow kammer Model af von Willebrand faktor-trombocyttal streng dannelse

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation

Functional Assessment of tarmmotilitet og tarmvæggen Inflammation i Gnavere: Analyser i en standardiseret model af Intestinal Manipulation

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common reason for a variety of human diseases. Animal research models are critical in investigating the ...

Orthotopic Small Bowel Transplantation in Rats

Orthotopisk tyndtarmstransplantation i rotter

Small  bowel transplantation has become an accepted clinical option for patients with  short gut syndrome and failure of parenteral nutrition ...

The Rabbit Blood-shunt Model for the Study of Acute and Late Sequelae of Subarachnoid Hemorrhage: Technical Aspects

The Rabbit Blood-shunt model for studiet af akut og senfølger af subaraknoidalblødning: tekniske forhold

Early brain injury and delayed cerebral vasospasm both contribute to unfavorable outcomes after subarachnoid hemorrhage (SAH). Reproducible and ...

Mouse Model of Alloimmune-induced Vascular Rejection and Transplant Arteriosclerosis

Musemodel for alloimmune-induceret vaskulær Afvisning og Transplant åreforkalkning

Vascular rejection that leads to transplant arteriosclerosis (TA) is the leading representation of chronic heart transplant failure. In TA, the immune ...

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Strategisk endotelcelle Tube Formation Assay: Sammenligning ekstracellulære matrix og vækstfaktor nedsat ekstracellulær matrix

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

Micro-dissection of Enamel Organ from Mandibular Incisor of Rats Exposed to Environmental Toxicants

Mikro-dissektion af emalje orgel fra Mandibular chopper rotter udsat for miljømæssige giftige stoffer

Enamel defects resulting from environmental conditions and ways of life are public health concerns because of their high prevalence. These defects result ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Isometrisk kontraktilitet måling af musen mesenterica arterie ved hjælp af Wire blodkar

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Vagus Nerve Stimulation As an Adjunctive Neurostimulation Tool in Treatment-resistant Depression

Vagus nervestimulation som en tillægsbehandling Neurostimulation redskab til behandling-resistent Depression

Vagus nerve stimulation (VNS) is an approved neurostimulation therapy. The purpose of the method is to treat patients with therapy-resistant depression ...

An In Vitro Hemodynamic Loop Model to Investigate the Hemocytocompatibility and Host Cell Activation of Vascular Medical Devices

En In Vitro Hemodynamic Loop Model til at undersøge Hæmocytocompatibility og Host Cell Aktivering af vaskulære medicinsk udstyr

In this study, the hemocompatibility of tubes with an inner diameter of 5 mm made of polyvinyl chloride (PVC) and coated with different bioactive ...

Surfactant Depletion Combined with Injurious Ventilation Results in a Reproducible Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS)

Surfactant Depletion Combined with Injurious Ventilation Results in a Reproducible Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome ARDS

Udtømning af overfladeaktivt stoffer kombineret med skadelig ventilation resulterer i en reproducerbar model af akut respiratorisk nødsyndrom (ARDS)

Various animal models exist to study the complex pathomechanisms of the acute respiratory distress syndrome (ARDS). These models include pulmo-arterial ...