Name: investigating von willebrand factor pathophysiology using a flow chamber model of von willebrand factor-platelet string formation
Uploaded: 2017-08-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation at JoVE.com

Alison Michels is een ontvanger van een Frederick Banting en Charles Best Canada Graduate beurs van de Canadese instituten van gezondheid onderzoek (CIHR). Laura L. Swystun is de ontvanger een CIHR fellowship. David Lillicrap is de ontvanger van de Canada Research Chair in moleculaire hemostase. Deze studie werd gedeeltelijk gefinancierd door een subsidie (MOP-97849) operationele CIHR.

Deze studies werden goedgekeurd door het onderzoek Ethics Board van Queen's University, Canada.
1. endothelial cel stimulatie
<ol><li>
Collageen-vacht een 6-well weefselkweek plaat.
	<ol>
<li>24 h op voorhand, jas een 6-well weefselkweek plaat bij 37 ° C met 1 mL van collageen buffer (50 µg Mo/mL rat staart collageen type 1 met 0,02 M ijsazijn).</li>
		<li>Was de putjes tweemaal met 2 mL van Henks evenwichtig zout oplossing (HBSS). Opmerking: Platen kunnen worden verpak...

Terwijl de fysiologische relevantie van VWF-bloedplaatjes blijft controversieel vanwege hun snelle ontbinding bij de aanwezigheid van de VWF-splijten protease ADAMTS13 snaren, dienen ze als een kwantificeerbare in vitro model van bloedplaatjes rekrutering door VWF naar een website op die een trombose kan vormen in aanwezigheid van gelokaliseerde stijgingen van de Histon niveaus5. Bovendien, in pathologieën ADAMTS13 activiteit die ontbreekt als Trombotische trombocytopenische purpura (TTP...

Trombose is een belangrijke oorzaak van kindersterfte wereldwijd1 en kan ontwikkelen in reactie todysregulated bloedplaatjes activering en trombine generatie in de slagaders van beide veinsand. Plasma niveaus van VWF zijn een belangrijke regulator van de bloedstolling, waarbij lage niveaus (< 50%) resulteren in de bloedende aandoening bekend als von Willebrand (VWD) ziekte2 en een hoog niveau (> 150%) worden geassocieerd met een verhoogd risico op veneuze3 en arteriële4 trombose.
VWF is een glycoproteïne dat multimeric wordt gesynthetiseerd door megakaryocytes en endotheliale cellen en opgeslagen in de bloedplaatjes α-korrels en WPBs, respectievelijk. Bij hemostatische uitdaging, kan VWF vrijgesteld van endothelial WPBs ketting circulerende bloedplaatjes geactiveerd endotheliale cellen5 of blootgestelde collageen op het vaartuig muur6. Verankering van VWF naar endotheliale cellen is aangetoond te worden bemiddeld door P-selectine7 en integrine αvβ38. De volgende release van bloedplaatjes α-submodule winkels kan nog meer gelokaliseerde VWF concentraties om te stabiliseren bloedplaatjes-bloedplaatjes interacties voor de vorming van de plug van bloedplaatjes, de steiger die nodig zijn voor de voortplanting van de stolling cascade en fibrine afzetting. De bloedplaatjes-bindende activiteit van VWF wordt geregeld door de multimeric structuur, met hoog-moleculair gewicht multimeren bezitten meer hemostatische activiteit9,10. In omloop fungeert VWF ook als een drager voor de stolling factor VIII.
Vloeibare schuifspanning is een essentiële regulator van VWF fysiologie. Het ontbreken van shear stress bestaat VWF in een bolvormige vorm, verhulling van bindende domeinen voor bloedplaatjes glycoproteïne Ib hechting11. Wanneer schuifspanning aanwezig is, wordt de breukzijde voor een metalloprotease, een disintegrin en metalloprotease met Thrombospondine motief (ADAMTS13), blootgesteld. ADAMTS13 cleaves naakt en bloedplaatjes versierd VWF tekenreeksen voor het regelen van de grootte van de multimer, waardoor de hemostatische activiteit12.
VWF is een acutefase-eiwit, en talrijke stimuli, zoals hypoxie13, infectie14en proinflammatoire cytokines, is aangetoond dat het bemiddelen van VWF vrijlating uit de endotheliale cellen. Gelijkaardig aan andere inflammatoire agenten, extracellulaire histonen ook is gebleken dat voor het opwekken van systemische VWF versie in muizen15,16 en de activering van trombocyten in vitro17,18, 19. Dit werd getoond te zijn afhankelijk van Histon subtype, zoals verschillen in lysine en arginine inhoud functie15kan beïnvloeden. Onze doelstellingen van de studie om een stroom-kamer model voor het onderzoek naar de invloed van lysine-rijk (HK) en arginine-rijke (HR) Histon subtypen en secretagogues op endotheel VWF release en real-time bloedplaatjes vastleggen, potentiële vroege gebeurtenissen in ontsteking-geïnduceerde trombose.
Deze stroom kamer methodologie recapituleert in vivo interacties tussen subendothelial collageen, endotheliale cellen, VWF en bloedplaatjes in een in vitro -systeem dat is visuele, reproduceerbare en kwantificeerbare. De real-time beoordeling van alle aspecten van het traject dat VWF-bloedplaatjes interacties regelt, met inbegrip van WPB secretie, bloedplaatjes activering en VWF proteolyse voorziet. Studies van VWF onder gecontroleerde shear stress omstandigheden hebben gebruikt om te evalueren van de VWD mutaties die afbreuk doen aan de VWF release en bloedplaatjes-bindende functie20, WPB fysiologie21, en VWF decolleté door ADAMTS135. We gebruiken deze methode om te kwantificeren VWF-bloedplaatjes tekenreeks vorming als gevolg van een inflammatoire stimulans: extracellulaire histonen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Calf-thymus unfractionated histones (UH)</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>HLY</td>
			<td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf-thymus lysine-rich histones (HK)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H5505</td>
			<td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf-thymus arginine-rich histones (HR)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4830</td>
			<td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td>Reconstituted in DMSO (20 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7125-1G</td>
			<td>Reconstituted in water (50 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39; Dihexyloxacarbocyanine Iodide (DiOC6)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D273</td>
			<td>Reconstituted in methanol (20 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-VWF Coating Antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0082</td>
			<td>For VWF ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-VWF Detection Antibody, HRP conjugated</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>P0026</td>
			<td>For VWF ELISA and histone-VWF binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MaxiSorp flat-bottom 96-well microplates</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>44-2404-21</td>
			<td>For histone-VWF binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immulon 4 HBX Flat Bottom Microtiter 96-Well Plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3855</td>
			<td>For VWF ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humate-P</td>
			<td>CSL Behring</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plasma-derived human von Willebrand factor/factor VIII complex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Reference Plasma</td>
			<td>Precision BioLogic</td>
			<td>CCNRP-05</td>
			<td>For VWF ELISA standard curve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD) reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8287</td>
			<td>Equivalent product available through ThermoFisher Scientific (Catalogue Number: 34006)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>For culturing and initial seeding of BOEC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat-tail Collagen Type 1</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td>For endothelial cell stimulations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>METAMORPH Microscopy Automation and Image Analysis Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Blood Collection Tubes, No Additive</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>366703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide III 0.1 (flow chambers)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td></td>
			<td>This product has been discontinued. We suggest using &#181;-Slide VI 0.1 (#80661) or 0.4 (# 80601) and recalculating flow rate and platelet volume needed to maintain a shear stress of 4.45 dyn/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Tubing 1.6 mm ID: 5 m, sterilized</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock Connector Female: natural Polypropylene, sterilized</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elbow Luer Connector Male: white Polypropylene, sterilized</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunted 18G Needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quorum WaveFX- 4X1 spinning disk microscope</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating von willebrand factor pathophysiology using a flow chamber model of von willebrand factor-platelet string formation

Von Willebrand-factor (VWF) is een multimeric glycoproteïne stollingsfactor die bemiddelt adhesie van bloedplaatjes en aggregatie op sites van endothelial schade en dat draagt factor VIII in de omloop. VWF wordt gesynthetiseerd door endotheliale cellen en ofwel constitutively in het plasma wordt vrijgegeven of is opgeslagen in gespecialiseerde organellen, Weibel-Palade instanties (WPBs), genaamd voor op afroep release in antwoord op hemostatische uitdaging. Procoagulatie en proinflammatoire stimuli kunnen snel leiden tot WPB exocytose en VWF release. De meerderheid van de VWF uitgebracht door endotheliale cellen circuleert in het plasma; echter wordt een deel van VWF verankerd aan het endotheel celoppervlak. Onder voorwaarden van fysiologische schuintrekken, kunt endotheel-verankerd VWF binden aan bloedplaatjes, vormen een VWF-bloedplaatjes tekenreeks die de infectiehaard voor de vorming van trombose vertegenwoordigen kan. Een kamer-stroomsysteem kan worden gebruikt om het visueel waarnemen van de vrijlating van VWF uit endotheliale cellen en de daaropvolgende bloedplaatjes vastleggen op een wijze die reproduceerbaar zijn en relevant zijn voor de pathofysiologie van VWF-gemedieerde trombose vorming. Met behulp van deze methode, endotheliale cellen zijn gekweekt in een flow kamer en vervolgens gestimuleerd met secretagogues voor het opwekken van WPB exocytose. Gewassen bloedplaatjes zijn dan geperfundeerd over de geactiveerde endotheel. De bloedplaatjes zijn geactiveerd en vervolgens binden aan de verlengde VWF tekenreeksen in de richting van vloeistofstromen. Met behulp van extracellulaire histonen als een stimulans procoagulatie- en proinflammatoire, waargenomen we verhoogde VWF-bloedplaatjes tekenreeks vorming op Histon behandeld endotheliale cellen ten opzichte van onbehandelde endotheliale cellen. Dit protocol beschrijft een kwantitatieve, visuele en real-time de beoordeling van de activering van VWF-bloedplaatjes interacties in modellen van trombose en hemostase.

Om te beoordelen direct het effect van histones op VWF vrijlating uit de endotheliale cellen, blootgesteld we confluente BOECs serumvrij middellange met PMA (positieve controle), UH, HR en HK gedurende 2 uur. We toonden dat HK een 2-fold stijging van de VWF eiwit (VWF:Ag) in het medium van behandelde endotheliale cellen (Figuur 1 veroorzaakte). Interessant, toen BOECs werden gestimuleerd met UH en HR, er was minder VWF:Ag is gedetecteerd in het medium dan in ...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation at JoVE.com

Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation

In deze paper beschrijven we een methode om te beoordelen endothelial von Willebrand factor release en de daaropvolgende bloedplaatjes vangen onder vloeistof shear stress in reactie op inflammatoire stimuli met behulp van een in vitro kamer-stroomsysteem.

Onderzoeken van von Willebrand Factor pathofysiologie met behulp van een Flow kamer Model van von Willebrand Factor-bloedplaatjes String vorming

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation

Functionele Evaluatie van darmmotiliteit en de darmwand ontsteking in Knaagdieren: Analyses in een gestandaardiseerd model van Intestinal Manipulatie

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common reason for a variety of human diseases. Animal research models are critical in investigating the ...

Orthotopic Small Bowel Transplantation in Rats

Orthotope dunne darm bij ratten

Small  bowel transplantation has become an accepted clinical option for patients with  short gut syndrome and failure of parenteral nutrition ...

The Rabbit Blood-shunt Model for the Study of Acute and Late Sequelae of Subarachnoid Hemorrhage: Technical Aspects

De Rabbit Bloed-shunt model voor de studie van Acute en Late Late gevolgen van subarachnoïdale bloeding: Technische aspecten

Early brain injury and delayed cerebral vasospasm both contribute to unfavorable outcomes after subarachnoid hemorrhage (SAH). Reproducible and ...

Mouse Model of Alloimmune-induced Vascular Rejection and Transplant Arteriosclerosis

Mouse Model van Allo-immuun geïnduceerde Vascular Afwijzing en Transplant Aderverkalking

Vascular rejection that leads to transplant arteriosclerosis (TA) is the leading representation of chronic heart transplant failure. In TA, the immune ...

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Strategische endotheelcellen Tube Formation Assay: Het vergelijken van extracellulaire matrix en Growth Factor Verlaagde extracellulaire matrix

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

Micro-dissection of Enamel Organ from Mandibular Incisor of Rats Exposed to Environmental Toxicants

Micro-dissectie van glazuur orgel van snijtand van ratten blootgesteld aan toxische stoffen in het milieu

Enamel defects resulting from environmental conditions and ways of life are public health concerns because of their high prevalence. These defects result ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Isometrische Contractility meting van de muis mesenterische slagader met behulp van draad Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Vagus Nerve Stimulation As an Adjunctive Neurostimulation Tool in Treatment-resistant Depression

Nervus vagus stimulatie als adjuvante neurostimulatie Tool in behandeling-resistente depressie

Vagus nerve stimulation (VNS) is an approved neurostimulation therapy. The purpose of the method is to treat patients with therapy-resistant depression ...

An In Vitro Hemodynamic Loop Model to Investigate the Hemocytocompatibility and Host Cell Activation of Vascular Medical Devices

Een In Vitro Hemodynamic Loop Model om de hemocytocompatibiliteit en hostcelactivering van vasculaire medische hulpmiddelen te onderzoeken

In this study, the hemocompatibility of tubes with an inner diameter of 5 mm made of polyvinyl chloride (PVC) and coated with different bioactive ...

Surfactant Depletion Combined with Injurious Ventilation Results in a Reproducible Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS)

Surfactant Depletion Combined with Injurious Ventilation Results in a Reproducible Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome ARDS

Oppervlakteactieve depletie in combinatie met schadelijke ventilatie resulteert in een reproduceerbaar model van het Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS)

Various animal models exist to study the complex pathomechanisms of the acute respiratory distress syndrome (ARDS). These models include pulmo-arterial ...