Name: investigating von willebrand factor pathophysiology using a flow chamber model of von willebrand factor-platelet string formation
Uploaded: 2017-08-14T14:00:00
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Alison Michels est un destinataire de Frederick Banting et Charles Best Canada Bourse d’études supérieures de l’instituts de recherche en santé du Canada (IRSC). Laura L. Swystun a reçu une bourse des IRSC. David Lillicrap est le récipiendaire d’une Chaire de recherche du Canada en hémostase moléculaire. Cette étude a été financée en partie par une subvention (MOP-97849) de fonctionnement des IRSC.

Ces études ont été approuvées par University, au Canada Research Ethics Board de la Reine.
1. endothélial Stimulation
<ol><li>
Collagène-manteau une plaque 6 puits culture de tissus.
	<ol>
<li>24h à l’avance, manteau une plaque 6 puits tissue culture à 37 ° C avec 1 mL de collagène de la mémoire tampon (50 µg/mL rat queue du collagène de type 1 avec l’acide acétique glacial 0,02 M).</li>
		<li>Laver les puits deux fois avec 2 mL de Hank Balanced Salt Soluti...

Alors que la pertinence physiologique de VWF-plaquettes cordes reste controversé en raison de leur dissolution rapide en présence de la protéase clivant de VWF ADAMTS13, ils servent de modèle quantifiables in vitro du recrutement de plaquettes de VWF vers un site au qui un thrombus peut former en présence de localisé des augmentations histone niveaux5. En outre, dans les pathologies dénuées d’ADAMTS13 telle activité comme le purpura thrombotique thrombocytopénique (PTT) - ou d...

La thrombose est des principales causes de mortalité dans le monde1 et peut se développer en réponse todysregulated plaquettaire d’activation et de thrombine génération dans les deux artères veinsand. Des niveaux de plasma de VWF sont un régulateur clé de coagulation du sang, auquel cas les niveaux bas (< 50 %) causer le trouble de la coagulation dite von Willebrand disease (maladie de von Willebrand)2 et niveaux élevés (> 150 %) sont associés à un risque accru de veineux3 et thrombose artérielle4 .
VWF est une glycoprotéine multimère synthétisée par les cellules endothéliales et les mégacaryocytes et stockées dans les granules α plaquettaire et WPBs, respectivement. Après provocation hémostatique, VWF peut être libéré de WPBs endothéliales pour attacher des plaquettes circulantes des cellules endothéliales activées5 ou collagène exposée sur le mur de navire6. Ancrage du VWF aux cellules endothéliales s’est avéré être médiée par la P-sélectine7 et intégrine αvβ38. La libération subséquente de plaquettes granules α magasins pouvez encore accroître les concentrations de VWF localisées pour stabiliser les interactions plaquettes plaquettes pour la formation de bouchon plaquettaire, l’échafaudage nécessaire pour la propagation de la cascade de coagulation et de la fibrine dépôts. L’activité de liaison plaquettaire du VWF est régie par sa structure multimériques, avec multimères de poids moléculaire élevé possédant une plus grande activité hémostatique9,10. En circulation, le VWF agit également comme un support pour le facteur VIII de coagulation.
Fluide de cisaillement est un régulateur essentiel de la physiologie VWF. En l’absence de contrainte de cisaillement, VWF existe sous une forme globulaire, dissimulant des domaines de liaison pour la glycoprotéine plaquettaire Ib adhérence11. Lorsque la contrainte de cisaillement est présente, le site de clivage pour une métalloprotéase, un disintegrin et métalloprotéase avec motif thrombospondine (ADAMTS13), est exposé. ADAMTS13 Clive chaînes VWF nues et décorés en plaquettes pour réguler la taille des multimères, réduisant ainsi son activité hémostatique12.
VWF est une protéine de phase aiguë, et de nombreux stimuli, notamment hypoxie13infection14et des cytokines pro-inflammatoires, auraient dû être divulgués à la médiation de sortie VWF des cellules endothéliales. Semblable à d’autres agents inflammatoires, histones extracellulaires ont également montrés pour induire la libération systémique de VWF souris15,16 et l’activation des plaquettes in vitro17,18, 19. cela a été montré à dépendre de sous-type d’histone, que les différences en lysine et teneur en arginine peut influencer la fonction15. Notre étude vise à établir une chambre à flux modèle pour étudier l’influence des riches en lysine (HK) et riches en arginine sous-types d’histone (HR) et sécrétagogues sur des rejets VWF endothéliales et des plaquettes en temps réel de capture, éventuels événements précoces l’inflammation induite par la thrombose.
Cette méthodologie de chambre de flux récapitule en vivo interactions entre collagène sous-endothélial, cellules endothéliales, du VWF et plaquettes dans un système in vitro qui est visuel, reproductible et quantifiables. Il permet l’évaluation en temps réel de tous les aspects de la voie qui régule les interactions du VWF-plaquettes, dont la sécrétion WPB, l’activation plaquettaire et protéolyse VWF. Études de VWF dans des conditions contrôlées de cisaillement ont été utilisés pour évaluer les mutations VWD qui nuisent communiqué de VWF et plaquettes-liaison fonction20, WPB physiologie21et clivage VWF par ADAMTS135. Nous utilisons cette méthode pour quantifier la formation de chaîne de VWF-plaquettes suite à un stimulus inflammatoire : histones extracellulaires.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Calf-thymus unfractionated histones (UH)</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>HLY</td>
			<td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf-thymus lysine-rich histones (HK)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H5505</td>
			<td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf-thymus arginine-rich histones (HR)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4830</td>
			<td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td>Reconstituted in DMSO (20 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7125-1G</td>
			<td>Reconstituted in water (50 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39; Dihexyloxacarbocyanine Iodide (DiOC6)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D273</td>
			<td>Reconstituted in methanol (20 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-VWF Coating Antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0082</td>
			<td>For VWF ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-VWF Detection Antibody, HRP conjugated</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>P0026</td>
			<td>For VWF ELISA and histone-VWF binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MaxiSorp flat-bottom 96-well microplates</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>44-2404-21</td>
			<td>For histone-VWF binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immulon 4 HBX Flat Bottom Microtiter 96-Well Plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3855</td>
			<td>For VWF ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humate-P</td>
			<td>CSL Behring</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plasma-derived human von Willebrand factor/factor VIII complex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Reference Plasma</td>
			<td>Precision BioLogic</td>
			<td>CCNRP-05</td>
			<td>For VWF ELISA standard curve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD) reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8287</td>
			<td>Equivalent product available through ThermoFisher Scientific (Catalogue Number: 34006)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>For culturing and initial seeding of BOEC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat-tail Collagen Type 1</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td>For endothelial cell stimulations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>METAMORPH Microscopy Automation and Image Analysis Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Blood Collection Tubes, No Additive</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>366703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide III 0.1 (flow chambers)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td></td>
			<td>This product has been discontinued. We suggest using &#181;-Slide VI 0.1 (#80661) or 0.4 (# 80601) and recalculating flow rate and platelet volume needed to maintain a shear stress of 4.45 dyn/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Tubing 1.6 mm ID: 5 m, sterilized</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock Connector Female: natural Polypropylene, sterilized</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elbow Luer Connector Male: white Polypropylene, sterilized</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunted 18G Needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quorum WaveFX- 4X1 spinning disk microscope</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating von willebrand factor pathophysiology using a flow chamber model of von willebrand factor-platelet string formation

Le facteur von Willebrand (VWF) est un facteur de coagulation de glycoprotéine multimère qui intervient dans l’adhésion des plaquettes et agrégation sur les sites des lésions endothéliales et qui transporte le facteur VIII dans la circulation. VWF est synthétisé par les cellules endothéliales et est libéré soit constitutivement dans le plasma ou est stocké dans des organites spécialisés, appelés corps de Weibel-Palade (WPBs), à la demande de libération en réponse au défi hémostatique. Procoagulant et pro-inflammatoires des stimuli peuvent induire rapidement l’exocytose WPB et libération VWF. La majorité du VWF libéré par les cellules endothéliales circule dans le plasma ; Toutefois, une proportion de VWF est ancrée à la surface des cellules endothéliales. Dans des conditions de cisaillement physiologique, endothéliales ancrées VWF peut lier aux plaquettes, formant une chaîne de VWF-plaquettaire qui peut-être représenter le nidus de la formation du thrombus. Un système de chambre de flux permet d’observer visuellement la libération de VWF des cellules endothéliales et les plaquettes ultérieures capturer de manière reproductible et adaptée à la physiopathologie de la formation du thrombus par l’intermédiaire du VWF. En utilisant cette méthode, les cellules endothéliales sont cultivés dans une chambre à flux et sont stimulés par la suite avec les sécrétagogues induire l’exocytose WPB. Plaquettes lavées sont ensuite perfusés sur l’endothélium activé. Les plaquettes sont activés et par la suite se lient à des chaînes de VWF allongées dans le sens d’écoulement du fluide. Utilisant des histones extracellulaires comme un stimulus procoagulant et pro-inflammatoires, nous avons observé de formation de chaîne de VWF-plaquettes accrue sur les cellules endothéliales histone traités par rapport aux cellules endothéliales non traitées. Ce protocole décrit une évaluation quantitative et visuelle en temps réel de l’activation des interactions de VWF-plaquettes dans des modèles de thrombose et hémostase.

Pour évaluer directement l’effet des histones sur la libération VWF de cellules endothéliales, nous avons exposé BOECs anastomosés au milieu sans sérum contenant PMA (contrôle positif), UH, RH et HK pendant 2 h. Nous avons montré que HK a induit une augmentation de 2 fois en protéines VWF (VWF:Ag) au milieu des cellules endothéliales traitées (Figure 1). Fait intéressant, lorsque BOECs sont stimulées avec UH et RH, il a été moins VWF:Ag déte...

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Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation

Dans cet article, nous décrivons une méthode pour évaluer endothéliales von Willebrand libération du facteur et les plaquettes suivantes de saisie sous la contrainte de cisaillement fluide en réponse à des stimuli inflammatoires à l’aide d’un système de chambre in vitro flux.

Enquêter sur von Willebrand facteur physiopathologie en utilisant un modèle de chambre d’écoulement de von Willebrand Factor-plaquettes String Formation

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage ...

Research

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