Name: investigating von willebrand factor pathophysiology using a flow chamber model of von willebrand factor-platelet string formation
Uploaded: 2017-08-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation at JoVE.com

אליסון Michels הוא הנמען של פרדריק בנטינג ו צ'ארלס הטוב ביותר בקנדה לתואר שני את המלגה מ קנדי מוסדות של הבריאות מחקר (CIHR). לורה ל' Swystun הוא הנמען מלגת CIHR. דוד Lillicrap הוא מקבל כיסא מחקר קנדה ב Hemostasis מולקולרית. מחקר זה מומן בחלקו על ידי CIHR הפעלה גרנט (פ'-97849).

מחקרים אלה אושרו על-ידי אוניברסיטת, קנדה מחקר אתיקה הלוח של המלכה.
1. גירוי תאי אנדותל
<ol><li>
קולגן-המעיל צלחת תרביות רקמה 6-. טוב.
	<ol>
<li>24 שעות מראש, המעיל צלחת תרביות רקמה 6-ובכן ב 37 ° C עם 1 מ"ל של קולגן מאגר (50 µg/mL עכברוש הזנב קולגן מסוג 1 עם חומצה אצטית מ' 0.02 נקודות).</li>
		<li>...

בעוד הרלוונטיות פיזיולוגיים של VWF-טסיות מיתרים נשאר שנוי במחלוקת עקב פירוק מהיר שלהם בנוכחות פרוטאז VWF ביקוע ADAMTS13, הם לשמש מודל לכימות במבחנה של טסיות הגיוס באמצעות VWF לאתר- אשר כגון שעלולים להיווצר רכוש מקומי העלאות היסטון רמות5. יתר על כן, בפתולוגיות חסר פעילות כל כך ADAMTS13...

פקקת היא הסיבה המובילה לתמותה ברחבי העולם1 , יכולים לפתח תגובה todysregulated טסיות ההפעלה של תרומבין דור שני עורקים veinsand. פלזמה רמות של VWF מווסת מפתח של קרישת הדם, לפיה רמות נמוכות (< 50%) התוצאה הפרעת דימום המכונה Willebrand פון המחלה (VWD)2 ורמות גבוהות (> 150%) הם קשורים לסיכון מוגבר של ורידים3 ו פקקת עורקים4 .
VWF הוא גליקופרוטאין multimeric מסונתז על ידי megakaryocytes ותאי אנדותל ומאוחסנים טסיות α-גרגירים, WPBs, בהתאמה. על אתגר hemostatic, VWF יכול להשתחרר מן WPBs אנדותל לקשור טסיות הדם במחזור תאי אנדותל מופעל5 או קולגן חשוף על קיר הספינה6. עיגון של VWF לתאי אנדותל הוכח להיות מתווכת על-ידי בחירת שמלות P7 ואינטגרין αvβ38. שחרור עוקבות של טסיות α-גרגר חנויות יכולה להמשיך להגדיל ריכוזים VWF לשפות אחרות כדי לייצב טסיות-טסיות האינטראקציות עבור טסיות הכנס היווצרות, לגרדום לצורך התפשטות של קרישת הדם בהתאם להירארכיית הקשרים, פיברין התצהיר. פעילות טסיות-איגוד של VWF מוסדר על ידי המבנה multimeric שלה, עם משקל מולקולרי גבוה multimers בעלי פעילות hemostatic גדול9,10. במחזור, VWF גם משמש כנשא עבור השמיני גורם קרישה.
נוזל גזירה היא הרגולטור חיוני של פיזיולוגיה VWF. בהיעדרו של גזירה, VWF קיימת בטופס הכדוריים, הסתרת מחייב תחומים עבור טסיות גליקופרוטאין ליברות אדהזיה11. כאשר קיים מאמץ גזירה, באתר של המחשוף metalloprotease, disintegrin, ו metalloprotease עם מוטיב thrombospondin (ADAMTS13), נחשפת. ADAMTS13 cleaves מחרוזות VWF עירום, מעוצבים טסיות כדי לווסת את גודל multimer, ובכך מקצר את פעילות hemostatic12.
VWF הוא חלבון שלב חריפה, גירויים רבים, לרבות היפוקסיה13, זיהום14ציטוקינים proinflammatory, הוכחו לתווך שחרור תאי אנדותל VWF. דומה לשני סוכני דלקתיות, שינויים היסטוניים חוץ-תאית יש גם הוכח לזירוז במהדורה VWF מערכתית עכברים15,16 והפעלה של טסיות במבחנה17,18, 19. זה הוצגה להיות תלוי סוג של היסטון, כמו הבדלים ליזין ו ארגינין תוכן עשוי להשפיע על תפקוד15. מטרות המחקר שלנו להקים תא זרימה דגם לחקור את ההשפעה של ליזין-עשיר (HK) וללכוד ארגינין-עשיר (HR) היסטון יחוברו, secretagogues על אנדותל VWF שחרור, טסית דם בזמן אמת, פוטנציאל םיעוריא מוקדם דלקת-induced פקקת.
מתודולוגיה קאמרית זו הזרימה recapitulates ויוו אינטראקציות בין קולגן subendothelial, תאי אנדותל, VWF טסיות הדם במערכת במבחנה הוא חזותי, הדירים לכימות. היא מאפשרת ההערכה בזמן אמת של כל ההיבטים של מסלול המסדירה את האינטראקציות VWF-טסיות, כולל הפרשת WPB, הפעלת טסיות VWF proteolysis. מחקרים של VWF בתנאים מבוקרים גזירה שימשו להערכת מוטציות VWD שפוגעים שחרור VWF, תפקוד טסיות מחייב20, פיזיולוגיה WPB21, VWF המחשוף מאת ADAMTS135. אנו משתמשים מתודולוגיה זו כדי לכמת את היווצרות מחרוזת VWF-טסיות כתוצאה גירוי דלקתי: שינויים היסטוניים חוץ-תאית.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Calf-thymus unfractionated histones (UH)</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>HLY</td>
			<td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf-thymus lysine-rich histones (HK)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H5505</td>
			<td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf-thymus arginine-rich histones (HR)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4830</td>
			<td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td>Reconstituted in DMSO (20 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7125-1G</td>
			<td>Reconstituted in water (50 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39; Dihexyloxacarbocyanine Iodide (DiOC6)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D273</td>
			<td>Reconstituted in methanol (20 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-VWF Coating Antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0082</td>
			<td>For VWF ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-VWF Detection Antibody, HRP conjugated</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>P0026</td>
			<td>For VWF ELISA and histone-VWF binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MaxiSorp flat-bottom 96-well microplates</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>44-2404-21</td>
			<td>For histone-VWF binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immulon 4 HBX Flat Bottom Microtiter 96-Well Plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3855</td>
			<td>For VWF ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humate-P</td>
			<td>CSL Behring</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plasma-derived human von Willebrand factor/factor VIII complex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Reference Plasma</td>
			<td>Precision BioLogic</td>
			<td>CCNRP-05</td>
			<td>For VWF ELISA standard curve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD) reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8287</td>
			<td>Equivalent product available through ThermoFisher Scientific (Catalogue Number: 34006)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>For culturing and initial seeding of BOEC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat-tail Collagen Type 1</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td>For endothelial cell stimulations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>METAMORPH Microscopy Automation and Image Analysis Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Blood Collection Tubes, No Additive</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>366703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide III 0.1 (flow chambers)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td></td>
			<td>This product has been discontinued. We suggest using &#181;-Slide VI 0.1 (#80661) or 0.4 (# 80601) and recalculating flow rate and platelet volume needed to maintain a shear stress of 4.45 dyn/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Tubing 1.6 mm ID: 5 m, sterilized</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock Connector Female: natural Polypropylene, sterilized</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elbow Luer Connector Male: white Polypropylene, sterilized</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunted 18G Needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quorum WaveFX- 4X1 spinning disk microscope</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating von willebrand factor pathophysiology using a flow chamber model of von willebrand factor-platelet string formation

פקטור Willebrand פון (VWF) הוא multimeric גליקופרוטאין קרישה פקטור זה שמתווכת הדבקות טסיות, צבירת באתרים של נזק אנדותל ונושא זה פקטור VIII במחזור. VWF הוא מסונתז על ידי תאי אנדותל משוחרר גם צורונים לתוך הפלזמה או מאוחסן ב- organelles מיוחדים, שנקרא גופות Weibel-Palade (WPBs), לשחרור לפי דרישה, בתגובה אתגר hemostatic. גירויים procoagulant ו- proinflammatory יכול לגרום במהירות WPB אקסוציטוזה ושחרור VWF. רוב שפורסמו על ידי תאי אנדותל VWF מסחררת ב הפלזמה; עם זאת, שיעור של VWF מעוגנת אל פני השטח של תאי אנדותל. בתנאים של הטיה פיזיולוגית, המעוגנת אנדותל VWF יכול לאגד טסיות, ויוצרים מחרוזת VWF-טסיות עשויים לייצג את nidus של כגון היווצרות. מערכת קאמרית זרימה ניתן להתבונן באופן חזותי את שחרורו של VWF מתאי אנדותל, של טסית דם עוקבות ללכוד באופן זה רלוונטי הפתופיזיולוגיה של היווצרות כגון בתיווך VWF הדירים. באמצעות מתודולוגיה זו, תאי אנדותל בתרבית בתוך תא זרימה, מומרץ לאחר מכן עם secretagogues כדי לגרום WPB אקסוציטוזה. טסיות דם שטף הם perfused ואז מעל אנדותל מופעל. טסיות הדם מופעלים, לאחר מכן לאגד מחרוזות VWF מאורכים בכיוון של זרימת נוזלים. באמצעות שינויים היסטוניים חוץ-תאית כמו גירוי procoagulant, proinflammatory, הבחנו היווצרות מחרוזת VWF-טסיות מוגברת על תאי אנדותל שטופלו היסטון בהשוואה לתאי אנדותל ללא טיפול. פרוטוקול זה מתאר הערכה כמותית, חזותי, בזמן אמת של ההפעלה של אינטראקציות VWF-טסיות במודלים של פקקת, hemostasis.

ישירות, כדי להעריך את ההשפעה של שינויים היסטוניים על שחרור תאי אנדותל VWF אנחנו חשופים BOECs confluent בינונית ללא סרום המכיל PMA (בקרה חיובית), אה, בית של HK כבר שעתיים. הראינו כי HK המושרה עלייה 2-fold VWF חלבון (VWF:Ag) בהמדיום של תאי אנדותל שטופלו (איור 1). מעניין, כאשר BOECs היו ...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation at JoVE.com

Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation

בנייר זה, אנו מתארים שיטה להערכת Willebrand פון אנדותל מקדם שחרור, טסית דם עוקבות של לכידת תחת גזירה נוזלים בתגובה לגירויים דלקתיות באמצעות מערכת קאמרית זרימה במבחנה .

חוקרים פון Willebrand גורם פתופסיולוגיה באמצעות מודל קאמרית זרימה של פון Willebrand פקטור-טסיות מחרוזת היווצרות

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation

הערכה תפקודית של תנועתיות מעיים ודלקת דופן מעי במכרסמים: ניתוח בדגם סטנדרטי של מניפולצית מעיים

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common reason for a variety of human diseases. Animal research models are critical in investigating the ...

Orthotopic Small Bowel Transplantation in Rats

השתלות מעי דק orthotopic בחולדות

Small  bowel transplantation has become an accepted clinical option for patients with  short gut syndrome and failure of parenteral nutrition ...

The Rabbit Blood-shunt Model for the Study of Acute and Late Sequelae of Subarachnoid Hemorrhage: Technical Aspects

דגם ארנב דם מחלף לחקר חריף והמאוחר Sequelae של דימום תת עכבישים: היבטים טכניים

Early brain injury and delayed cerebral vasospasm both contribute to unfavorable outcomes after subarachnoid hemorrhage (SAH). Reproducible and ...

Mouse Model of Alloimmune-induced Vascular Rejection and Transplant Arteriosclerosis

עכבר דגם של דחיית כלי דם הנוצרת על-Alloimmune וטרשת עורקים להשתלות

Vascular rejection that leads to transplant arteriosclerosis (TA) is the leading representation of chronic heart transplant failure. In TA, the immune ...

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Assay גיבוש האנדותל תא Tube אסטרטגי: השוואת מטריקס ו- Growth Factor מופחתת מטריקס

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

Micro-dissection of Enamel Organ from Mandibular Incisor of Rats Exposed to Environmental Toxicants

ניתוח מיקרו של איבר אמייל השן החותכת הלסת של חולדות נחשף חשיפה לרעלים סביבתיים

Enamel defects resulting from environmental conditions and ways of life are public health concerns because of their high prevalence. These defects result ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Contractility איזומטרי מדידה של עורק מצע המעי העליון העכבר באמצעות חוט Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Vagus Nerve Stimulation As an Adjunctive Neurostimulation Tool in Treatment-resistant Depression

קוצב וגאלי ככלי בגירוי ניהולה עמיד לטיפול בדיכאון

Vagus nerve stimulation (VNS) is an approved neurostimulation therapy. The purpose of the method is to treat patients with therapy-resistant depression ...

An In Vitro Hemodynamic Loop Model to Investigate the Hemocytocompatibility and Host Cell Activation of Vascular Medical Devices

מודל לולאה המודינמית במבחנה כדי לחקור את תאימות Hemocyto והפעלת תא מארח של מכשירים רפואיים כלי דם

In this study, the hemocompatibility of tubes with an inner diameter of 5 mm made of polyvinyl chloride (PVC) and coated with different bioactive ...

Surfactant Depletion Combined with Injurious Ventilation Results in a Reproducible Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS)

Surfactant Depletion Combined with Injurious Ventilation Results in a Reproducible Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome ARDS

דלדול פעילי שטח בשילוב עם אוורור מזיק גורם למודל רבייה של תסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS)

Various animal models exist to study the complex pathomechanisms of the acute respiratory distress syndrome (ARDS). These models include pulmo-arterial ...