Name: investigating von willebrand factor pathophysiology using a flow chamber model of von willebrand factor-platelet string formation
Uploaded: 2017-08-14T14:00:00
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एलिसन मिशेल स्वास्थ्य अनुसंधान (CIHR) के कनाडाई संस्थानों से एक फ्रेडरिक बंटिंग और चार्ल्स सर्वश्रेष्ठ कनाडा स्नातक छात्रवृत्ति के एक प्राप्तकर्ता है । लौरा एल Swystun प्राप्तकर्ता एक CIHR फैलोशिप है । डेविड Lillicrap आणविक रक्तस्तम्भन में कनाडा के एक शोध कुर्सी के प्राप्तकर्ता है । इस अध्ययन के हिस्से में एक CIHR ऑपरेटिंग अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया (९७८४९) ।

इन अध्ययनों को महारानी की यूनिवर्सिटी, कनाडा के रिसर्च एथिक्स बोर्ड ने मंजूरी दी थी ।
1. Endothelial कोशिका उत्तेजना
<ol><li>
कोलेजन-कोट एक 6-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति की थाली ।
	<ol>
<li>अग्रिम में 24 एच, को?...

जबकि VWF-प्लेटलेट तार की शारीरिक प्रासंगिकता VWF की उपस्थिति में उनके तेजी से विघटन के कारण विवादास्पद रहता है-सट चिढ़ा ADAMTS13, वे एक quantifiable के रूप में सेवा इन विट्रो में एक साइट के लिए VWF द्वारा प्लेटलेट भर्ती...

घनास्त्रता दुनिया भर में मृत्यु का एक प्रमुख कारण है1 और दोनों veinsand धमनियों में प्लेटलेट सक्रियण और thrombin उत्पादन में प्रतिक्रिया todysregulated विकसित कर सकते हैं । VWF के प्लाज्मा स्तर रक्त जमावट के एक प्रमुख नियामक हैं, जिससे निम्न स्तर (< 50%) वॉन Willebrand रोग (VWD) के रूप में जाना जाता है खून बह रहा विकार में परिणाम2 और उच्च स्तर (> 150%) शिरापरक3 का एक बढ़ा जोखिम के साथ जुड़े रहे हैं और धमनी४ घनास्त्रता.
VWF एक multimeric ग्लाइकोप्रोटीन megakaryocytes और endothelial कोशिकाओं द्वारा संश्लेषित और प्लेटलेट α-granules और WPBs, क्रमशः में संग्रहित है । hemostatic चैलेंज पर, VWF endothelial WPBs से जारी किया जा सकता है प्लेटलेट्स घूम तार करने के लिए endothelial कोशिकाओं को सक्रिय करने के लिए5 या उजागर कोलेजन पोत दीवार6पर । endothelial कोशिकाओं को VWF के एंकरिंग को पी-selectin7 और integrin αvβ38द्वारा मध्यस्थता करने के लिए दिखाया गया है । प्लेटलेट α-granules भंडार के बाद जारी प्लेटलेट प्लग गठन, जमावट झरना और फाइब्रिन के प्रचार प्रसार के लिए आवश्यक पाड़ के लिए और अधिक, प्लेटलेट प्लेटलेट बातचीत को स्थिर करने के लिए स्थानीयकृत VWF सांद्रता में वृद्धि कर सकते है साठा. VWF की प्लेटलेट बाध्यकारी गतिविधि अपने multimeric संरचना द्वारा विनियमित है, उच्च आणविक वजन multimers अधिक hemostatic गतिविधि9,10रखने के साथ । संचलन में, VWF भी जमावट कारक आठवीं के लिए एक वाहक के रूप में कार्य करता है ।
द्रव कतरनी तनाव VWF फिजियोलॉजी का एक आवश्यक नियामक है । कतरनी तनाव के अभाव में, VWF एक गोलाकार रूप में मौजूद है, प्लेटलेट ग्लाइकोप्रोटीन आईबी आसंजन11के लिए बाध्यकारी डोमेन छुपा । जब कतरनी तनाव मौजूद है, एक metalloprotease, एक disintegrin और thrombospondin आकृति (ADAMTS13) के साथ metalloprotease के लिए दरार साइट, उजागर है । ADAMTS13 नग्न और प्लेटलेट से सजाया VWF तार सट multimer आकार को विनियमित करने के लिए, जिससे इसके hemostatic गतिविधि को कम करने12।
VWF एक तीव्र चरण प्रोटीन है, और हाइपोक्सिया13, संक्रमण14, और भड़काऊ साइटोकिंस सहित कई उत्तेजनाओं, endothelial कोशिकाओं से VWF रिहाई मध्यस्थता करने के लिए दिखाया गया है । अन्य भड़काऊ एजेंटों के समान, extracellular histones भी चूहों में प्रणालीगत VWF रिलीज के लिए प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है15,16 और इन विट्रो17,18 मेंप्लेटलेट्स की सक्रियण, 19. यह citrullinated उपप्रकार पर निर्भर होना दिखाया गया था, lysine और arginine सामग्री में अंतर के रूप में समारोह15प्रभावित हो सकता है । हमारे अध्ययन के लिए एक प्रवाह चैंबर मॉडल की स्थापना के प्रभाव की जांच करने के लिए lysine-अमीर (एच) और arginine अमीर (मानव संसाधन) citrullinated उपप्रकार और secretagogues पर endothelial VWF रिहाई और वास्तविक समय प्लेटलेट पर कब्जा, संभावित प्रारंभिक घटनाओं में सूजन प्रेरित घनास्त्रता ।
इस फ्लो चैंबर पद्धति vivo में subendothelial कोलेजन, endothelial कोशिकाओं, VWF, और प्लेटलेट्स के बीच बातचीत में recapitulates एक इन विट्रो प्रणाली है कि दृश्य है, प्रतिलिपि, और quantifiable. यह WPB स्राव, प्लेटलेट सक्रियण, और VWF प्रोटियोलिसिस सहित VWF-प्लेटलेट बातचीत को नियंत्रित करता है कि मार्ग के सभी पहलुओं का वास्तविक समय मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है. नियंत्रित कतरनी तनाव की स्थिति के तहत VWF के अध्ययन के लिए VWD उत्परिवर्तनों कि VWF रिलीज और प्लेटलेट बाध्यकारी समारोह20, WPB फिजियोलॉजी21, और VWF दरार ADAMTS13 द्वारा5का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । हम इस पद्धति का उपयोग करने के लिए एक भड़काऊ उत्तेजना का एक परिणाम के रूप में VWF-प्लेटलेट स्ट्रिंग गठन यों तो: extracellular histones ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Calf-thymus unfractionated histones (UH)</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>HLY</td>
			<td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf-thymus lysine-rich histones (HK)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H5505</td>
			<td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf-thymus arginine-rich histones (HR)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4830</td>
			<td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td>Reconstituted in DMSO (20 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7125-1G</td>
			<td>Reconstituted in water (50 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39; Dihexyloxacarbocyanine Iodide (DiOC6)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D273</td>
			<td>Reconstituted in methanol (20 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-VWF Coating Antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0082</td>
			<td>For VWF ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-VWF Detection Antibody, HRP conjugated</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>P0026</td>
			<td>For VWF ELISA and histone-VWF binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MaxiSorp flat-bottom 96-well microplates</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>44-2404-21</td>
			<td>For histone-VWF binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immulon 4 HBX Flat Bottom Microtiter 96-Well Plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3855</td>
			<td>For VWF ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humate-P</td>
			<td>CSL Behring</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plasma-derived human von Willebrand factor/factor VIII complex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Reference Plasma</td>
			<td>Precision BioLogic</td>
			<td>CCNRP-05</td>
			<td>For VWF ELISA standard curve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD) reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8287</td>
			<td>Equivalent product available through ThermoFisher Scientific (Catalogue Number: 34006)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>For culturing and initial seeding of BOEC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat-tail Collagen Type 1</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td>For endothelial cell stimulations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>METAMORPH Microscopy Automation and Image Analysis Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Blood Collection Tubes, No Additive</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>366703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide III 0.1 (flow chambers)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td></td>
			<td>This product has been discontinued. We suggest using &#181;-Slide VI 0.1 (#80661) or 0.4 (# 80601) and recalculating flow rate and platelet volume needed to maintain a shear stress of 4.45 dyn/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Tubing 1.6 mm ID: 5 m, sterilized</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock Connector Female: natural Polypropylene, sterilized</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elbow Luer Connector Male: white Polypropylene, sterilized</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunted 18G Needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quorum WaveFX- 4X1 spinning disk microscope</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating von willebrand factor pathophysiology using a flow chamber model of von willebrand factor-platelet string formation

वॉन Willebrand फैक्टर (VWF) एक multimeric ग्लाइकोप्रोटीन जमावट कारक है कि endothelial नुकसान की साइटों पर प्लेटलेट आसंजन और एकत्रीकरण मध्यस्थता और है कि संचलन में कारक अष्टम किया जाता है । VWF endothelial कोशिकाओं द्वारा संश्लेषित है और या तो प्लाज्मा में constitutively जारी है या विशेष organelles में संग्रहित है, Weibel-Palade शव (WPBs) कहा जाता है, पर मांग के लिए hemostatic चुनौती के जवाब में रिलीज । Procoagulant और भड़काऊ उत्तेजनाओं तेजी से WPB exocytosis और VWF जारी प्रेरित कर सकते हैं । endothelial कोशिकाओं द्वारा जारी VWF के बहुमत प्लाज्मा में परिचालित; हालांकि, VWF के अनुपात endothelial सेल सतह के लिए लंगर डाला है । शारीरिक कतरनी की शर्तों के तहत, endothelial-लंगर VWF प्लेटलेट्स को बाइंड कर सकते हैं, एक VWF-प्लेटलेट स्ट्रिंग बनाने कि थक्का गठन के nidus का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं । एक प्रवाह चैंबर प्रणाली नेत्रहीन endothelial कोशिकाओं और बाद में प्लेटलेट पर कब्जा से VWF की रिहाई का निरीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रतिलिपि और VWF-मध्यस्थता थक्का गठन के pathophysiology के लिए प्रासंगिक है । इस पद्धति का प्रयोग, endothelial कोशिकाओं को एक प्रवाह कक्ष में संस्कृति और बाद में secretagogues के साथ उत्तेजित कर रहे है WPB exocytosis प्रेरित कर रहे हैं । धोकर प्लेटलेट्स फिर सक्रिय endothelium पर perfused हैं । प्लेटलेट्स सक्रिय हो जाते हैं और बाद में द्रव प्रवाह की दिशा में लम्बी VWF स्ट्रिंग्स को बाँध देते हैं. एक procoagulant और भड़काऊ उत्तेजना के रूप में extracellular histones का उपयोग करना, हम अनुपचारित citrullinated कोशिकाओं की तुलना में endothelial-इलाज endothelial कोशिकाओं पर VWF-प्लेटलेट स्ट्रिंग गठन में वृद्धि मनाया । इस प्रोटोकॉल घनास्त्रता और रक्तस्तम्भन के मॉडलों में VWF-प्लेटलेट बातचीत के सक्रियकरण के एक मात्रात्मक, दृश्य, और वास्तविक समय मूल्यांकन का वर्णन करता है ।

endothelial कोशिकाओं से VWF जारी करने पर histones के प्रभाव का सीधे आकलन करने के लिए, हमने धाराप्रवाह BOECs को सीरम रहित माध्यम से अवगत कराया जिसमें पमा (धनात्मक नियंत्रण), उह, HR, और एच के लिए 2 ज. हमें पता चला कि एच...

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Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation

इस पत्र में, हम एक विधि का वर्णन करने के लिए endothelial वॉन Willebrand फैक्टर जारी है और बाद में एक इन विट्रो फ्लो चैंबर प्रणाली का उपयोग भड़काऊ उत्तेजनाओं के जवाब में द्रव कतरनी तनाव के तहत प्लेटलेट पर कब्जा के आकलन के लिए ।

जांच वॉन Willebrand फैक्टर वॉन Willebrand फैक्टर-प्लेटलेट स्ट्रिंग गठन के एक प्रवाह चैंबर मॉडल का उपयोग Pathophysiology

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage ...

Research

JoVE Journal

Medicine

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