Name: investigating von willebrand factor pathophysiology using a flow chamber model of von willebrand factor-platelet string formation
Uploaded: 2017-08-14T14:00:00
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Alison Michels è un destinatario di un Frederick Banting e Charles Best Canada Graduate Scholarship da istituti canadesi di ricerca di salute (CIHR). Laura L. Swystun è il destinatario di una borsa di studio CIHR. David Lillicrap è il destinatario di un Canada Research Chair in Hemostasis molecolare. Questo studio è stato finanziato in parte da un CIHR sovvenzione (MOP-97849) di funzionamento.

Questi studi sono stati approvati dalla University, Canada ricerca etica Consiglio della Regina.
1. endothelial delle cellule stimolazione
<ol><li>
Collagene-cappotto una piastra di coltura del tessuto 6 pozzetti.
	<ol>
<li>24 ore in anticipo, cappotto una piastra di coltura del tessuto 6 pozzetti a 37 ° C con 1 mL di collagene (50 µ g/mL del ratto coda collagene di tipo 1 con 0,02 M di acido acetico glaciale) del buffer.</li>
		<li>Lavare i pozzetti due volte con 2 mL di ...

Mentre la rilevanza fisiologica di VWF-piastrine stringhe rimane discutibile a causa della loro rapida dissoluzione in presenza di VWF-fendendo proteasi ADAMTS13, servono come modello quantificabili in vitro di reclutamento della piastrina di VWF un sito all'indirizzo che potrebbe formare un embolo in presenza di localizzato aumenti nei livelli di istone5. Inoltre, nelle patologie carente ADAMTS13 attività-tale come purpura thrombocytopenic thrombotic (TTP) - o in microambienti infiammat...

La trombosi è delle cause principali di mortalità nel mondo1 e può svilupparsi in risposta todysregulated generazione della piastrina attivazione e trombina in entrambe le arterie varicosee. I livelli del plasma di sindrome di Raynaud sono un regolatore chiave della coagulazione del sangue, per cui bassi livelli (< 50%) provocare i disturbi emorragici conosciuto come von Willebrand (VWD) la malattia2 e livelli elevati (> 150%) sono associati con un rischio aumentato di venosa3 e trombosi arteriosa4 .
Sindrome di Raynaud è una glicoproteina multimerica sintetizzato dalle cellule endoteliali e megacariociti e archiviati in α-granuli della piastrina e disfunzione, rispettivamente. Al momento di sfida emostatica, VWF può essere liberato dalla disfunzione endoteliale Tether piastrine circolanti a cellule endoteliali attivate5 o collagene esposto sulla nave parete6. Ancoraggio del VWF alle cellule endoteliali ha dimostrato di essere mediato daP-selectin 7 e integrina αvβ38. Il rilascio successivo di negozi α-granuli delle piastrine può aumentare ulteriormente le concentrazioni localizzate di VWF per stabilizzare le interazioni della piastrina-piastrina per formazione della spina della piastrina, l'impalcatura necessaria per la propagazione della cascata della coagulazione e della fibrina deposizione. L'attività della piastrina-associazione di sindrome di Raynaud è regolata dalla relativa struttura multimerica, con multimeri ad alto peso molecolare che possiede maggiore attività emostatiche9,10. In circolazione, VWF funge anche da un elemento portante per il fattore VIII della coagulazione.
Sollecitazione di taglio fluido è un regolatore essenziale della fisiologia VWF. In assenza di sollecitazione di taglio, VWF esiste in una forma globulare, celando domini di legame per la glicoproteina piastrinica Ib adesione11. Quando la sollecitazione di taglio è presente, il sito di clivaggio per un metalloprotease, un disintegrin e metalloprotease con motivo trombospondina (ADAMTS13), è esposto. ADAMTS13 fende le stringhe VWF nude e decorato della piastrina per regolare la dimensione del multimer, riducendo così la sua attività emostatiche12.
Sindrome di Raynaud è una proteina della fase acuta, e numerosi stimoli, compreso ipossia13, infezione14e citochine proinfiammatorie, sono stati indicati per mediare il rilascio VWF dalle cellule endoteliali. Simile ad altri agenti infiammatori, gli istoni extracellulari inoltre sono stati indicati per indurre il rilascio sistemico di VWF in topi15,16 e l'attivazione delle piastrine in vitro17,18, 19. questo è stato indicato per essere dipendente da sottotipo dell'istone, come differenze di lisina e contenuto di arginina può influenzare la funzione15. Nostro studio si propone di istituire una camera di flusso modello per studiare l'influenza del ricco di lisina (HK) e acquisizione di ricchi di arginina sottotipi dell'istone (HR) e secretagoghi sulla liberazione endoteliale di VWF e piastrine in tempo reale, eventi potenziali precoci in trombosi indotta da infiammazione.
Questa metodologia di camera di flusso ricapitola in vivo interazioni tra collagene subendoteliale, cellule endoteliali, VWF e piastrine in un sistema in vitro che è visivo, riproducibili e quantificabili. Esso consente la valutazione in tempo reale di tutti gli aspetti del pathway che regola l'interazione VWF-piastrine, compreso secrezione WPB, attivazione piastrinica e proteolisi VWF. Studi di sindrome di Raynaud in condizioni di sollecitazione di taglio controllato sono stati utilizzati per valutare le mutazioni di VWD che compromettere il rilascio di sindrome di Raynaud e di funzione della piastrina-associazione20, WPB fisiologia21e scissione VWF di ADAMTS135. Usiamo questa metodologia per quantificare la formazione stringa VWF-piastrine in conseguenza di uno stimolo infiammatorio: istoni extracellulari.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Calf-thymus unfractionated histones (UH)</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>HLY</td>
			<td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf-thymus lysine-rich histones (HK)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H5505</td>
			<td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf-thymus arginine-rich histones (HR)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4830</td>
			<td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td>Reconstituted in DMSO (20 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7125-1G</td>
			<td>Reconstituted in water (50 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39; Dihexyloxacarbocyanine Iodide (DiOC6)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D273</td>
			<td>Reconstituted in methanol (20 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-VWF Coating Antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0082</td>
			<td>For VWF ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-VWF Detection Antibody, HRP conjugated</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>P0026</td>
			<td>For VWF ELISA and histone-VWF binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MaxiSorp flat-bottom 96-well microplates</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>44-2404-21</td>
			<td>For histone-VWF binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immulon 4 HBX Flat Bottom Microtiter 96-Well Plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3855</td>
			<td>For VWF ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humate-P</td>
			<td>CSL Behring</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plasma-derived human von Willebrand factor/factor VIII complex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Reference Plasma</td>
			<td>Precision BioLogic</td>
			<td>CCNRP-05</td>
			<td>For VWF ELISA standard curve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD) reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8287</td>
			<td>Equivalent product available through ThermoFisher Scientific (Catalogue Number: 34006)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>For culturing and initial seeding of BOEC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat-tail Collagen Type 1</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td>For endothelial cell stimulations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>METAMORPH Microscopy Automation and Image Analysis Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Blood Collection Tubes, No Additive</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>366703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide III 0.1 (flow chambers)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td></td>
			<td>This product has been discontinued. We suggest using &#181;-Slide VI 0.1 (#80661) or 0.4 (# 80601) and recalculating flow rate and platelet volume needed to maintain a shear stress of 4.45 dyn/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Tubing 1.6 mm ID: 5 m, sterilized</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock Connector Female: natural Polypropylene, sterilized</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elbow Luer Connector Male: white Polypropylene, sterilized</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunted 18G Needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quorum WaveFX- 4X1 spinning disk microscope</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating von willebrand factor pathophysiology using a flow chamber model of von willebrand factor-platelet string formation

Fattore di von Willebrand (VWF) è un fattore di coagulazione di glicoproteina multimerica che media l'adesione della piastrina e l'aggregazione in siti di danno endoteliale e che trasporta il fattore VIII nella circolazione. VWF è sintetizzato dalle cellule endoteliali e viene rilasciato sia costitutivamente nel plasma o viene memorizzato in organelli specializzati, chiamati corpi di Weibel-Palade (disfunzione), per il rilascio su richiesta in risposta alla sfida emostatica. Stimoli proinfiammatori e procoagulant possono indurre rapidamente WPB esocitosi e rilascio VWF. La maggior parte del VWF rilasciato dalle cellule endoteliali circola nel plasma; Tuttavia, una proporzione di sindrome di Raynaud è ancorata alla superficie delle cellule endoteliali. In condizioni di taglio fisiologico, endoteliali ancorato VWF possibile associare alle piastrine, formando una stringa di VWF-piastrine che può rappresentare il nidus della formazione di trombi. Un sistema dell'alloggiamento di flusso può essere utilizzato per osservare visivamente il rilascio di VWF da cellule endoteliali e la successiva della piastrina catturare in un modo che è riproducibile e pertinenti alla patofisiologia della formazione dell'embolo VWF-mediata. Utilizzando questa metodologia, le cellule endoteliali sono coltivate in una camera di flusso e sono successivamente stimolate con secretagoghi per indurre esocitosi WPB. Piastrine lavate sono perfusi quindi sopra l'endotelio attivato. Le piastrine sono attivate e successivamente associare a stringhe di VWF allungate in direzione di flusso del fluido. Usando gli istoni extracellulari come stimolo procoagulante e proinflammatory, abbiamo osservato formazione aumentata di stringa VWF-piastrine sulle cellule endoteliali istone-trattati rispetto alle cellule endoteliali non trattate. Questo protocollo descrive una valutazione quantitativa, visual e in tempo reale di attivazione dell'interazione VWF-piastrine in modelli di trombosi ed emostasi.

Per valutare direttamente l'effetto degli istoni sul VWF rilascio dalle cellule endoteliali, siamo esposti confluenti BOECs medium privo di siero contenente PMA (controllo positivo), UH, HR e HK per 2 h. Abbiamo mostrato che HK ha indotto un aumento di 2 volte in proteina VWF (FvW: AG) nel mezzo delle cellule endoteliali trattate (Figura 1). È interessante notare che, quando BOECs sono stati stimolati con UH e HR, c'è stato meno FvW: AG rilevato in mezzo pi...

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Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation

In questo articolo, descriviamo un metodo per valutare endoteliale von Willebrand fattore rilascio e la successiva della piastrina catturare sotto sollecitazione di taglio fluido in risposta a stimoli infiammatori, utilizzando un sistema di alloggiamento del flusso in vitro .

Indagando von Willebrand fattore patofisiologia utilizzando un modello di flusso di camera di von Willebrand Factor-PIASTRINOGENESI. String

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage ...

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