Name: investigating von willebrand factor pathophysiology using a flow chamber model of von willebrand factor-platelet string formation
Uploaded: 2017-08-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation at JoVE.com

アリソン ・ ミッシェルは、フレデリック ・ バンティングとチャールズ ・ ベスト カナダ大学院奨学金から、カナダ研究所の健康研究 (機構) の受信者です。ローラ ・ l ・ Swystun は、機構の交わりの受信者です。デビッド Lillicrap は、分子止血のカナダの研究の椅子の受信者です。本研究は、営業許可 (モップ 97849) 機構によって一部で賄われていた。

これらの研究は、研究倫理委員会の女王の大学、カナダによって承認されました。
1. 血管内皮細胞刺激
<ol><li>
コラーゲン コート 6 ウェル培養プレート。
	<ol>
<li>事前に、コート 1 ml コラーゲンの 37 ° C で 6 も組織培養プレート h 24 バッファー (50 μ G/ml ラット尾コラーゲン タイプ 1 0.02 M 氷酢酸と)。</li>
		<li>2 mL のハンクのバランスの取れた塩ソリューショ...

サイトに VWF によって血小板募集の定量化の in vitroモデルとして仕えるまま VWF 切断プロテアーゼ ADAMTS13 の存在下で急速な分解のために論争は、文字列 VWF 血小板の生理学的な関連性を中血栓の存在下で形作るかもしれないローカライズ ヒストン レベル5の増加です。また、血栓性血小板減少性紫斑病 (TTP) として - または炎症性微小 - ADAMTS13 活性などに欠けている病?...

血栓症は、死亡率世界1の主要な原因で応答 todysregulated 血小板活性化とトロンビン生成両方 veinsand 動脈内で開発することができます。VWF の血漿中濃度は血液凝固の重要な調節因子、という低いレベル (< 50%) フォン Willebrand の病気 (VWD)2および高レベルとして知られている出血障害が発生 (> 150%) 静脈3のリスクの増加に関連付けられていると4動脈血栓症。
VWF はポリコームタンパク糖巨核球や血管内皮細胞により合成、血小板 α 顆粒と WPBs にそれぞれ格納されます。止血の挑戦時に VWF 活性化血管内皮細胞5または容器壁6露出したコラーゲンに血小板を循環をテザーに内皮細胞の WPBs から解放できます。内皮細胞と VWF のアンカーは、P-セレクチン ・ タンパク7とインテグリン αvβ38によって媒介される示されています。血小板 α 顆粒店の後続のリリースはさらに血小板血小板相互作用血小板栓形成、凝固カスケードとフィブリンの伝播に必要な足場を安定させるためにローカライズされた VWF 濃度を増やすことができます。蒸着。VWF の血小板結合活性より止血作用9,10を有する高分子量多量とポリコームタンパク体質によって調整されます。循環、VWF も血液凝固因子の第 VIII のためのキャリアとして機能します。
流体のせん断応力は、VWF の生理学の本質的なレギュレータです。剪断応力がない場合は、VWF は血小板糖蛋白 Ib 接着11の結合ドメインを隠して球状の形で存在します。せん断応力が存在する場合は、メタロプロテアーゼ、disintegrin、トロンボスポンジン モチーフ (ADAMTS13) メタロプロテアーゼの胸の谷間のサイトが公開されます。ADAMTS13 裂く裸と血小板装飾の VWF 文字列多量体のサイズを調節するその止血作用12を減らします。
VWF は急性期蛋白質、低酸素症13、感染症14、炎症性サイトカインなど、多数の刺激は、血管内皮細胞から VWF リリースを仲介する示されています。他に似たような炎症剤、細胞のヒストンも示されている全身 VWF リリース マウス15,16と血小板体外17,18,の活性化を誘導する19. このリジンの違いとして、ヒストンのサブタイプに依存することが示され、アルギニン含有量関数15に影響を与える可能性があります。流れ区域を確立する研究目標は、リジンが豊富な (HK) の影響を調査するモデルし、アルギニンが豊富な (HR) ヒストン サブタイプと内皮の VWF リリースとリアルタイムの血小板の分泌促進薬、潜在的な初期イベントでキャプチャ炎症による血栓症です。
この流れの商工会議所の方法論は、ビジュアルと、再現と定量化にある生体外でシステムで subendothelial コラーゲン、血管内皮細胞、VWF と血小板の生体内での相互作用を繰り返します。WPB 分泌、血小板の活性化と VWF 分解を含む VWF 血小板の相互作用を調節する経路のすべての側面のリアルタイム評価が可能です。VWF のせん断応力を制御条件の下での研究は、ADAMTS135VWF リリースと血小板結合関数20、WPB 生理21VWF 胸の谷間を損なう VWD の突然変異を評価に使用されています。この方法論を使用して、炎症性刺激の結果として VWF 血小板文字列形成の定量化: 細胞のヒストン。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Calf-thymus unfractionated histones (UH)</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>HLY</td>
			<td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf-thymus lysine-rich histones (HK)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H5505</td>
			<td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf-thymus arginine-rich histones (HR)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4830</td>
			<td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td>Reconstituted in DMSO (20 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7125-1G</td>
			<td>Reconstituted in water (50 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39; Dihexyloxacarbocyanine Iodide (DiOC6)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D273</td>
			<td>Reconstituted in methanol (20 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-VWF Coating Antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0082</td>
			<td>For VWF ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-VWF Detection Antibody, HRP conjugated</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>P0026</td>
			<td>For VWF ELISA and histone-VWF binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MaxiSorp flat-bottom 96-well microplates</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>44-2404-21</td>
			<td>For histone-VWF binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immulon 4 HBX Flat Bottom Microtiter 96-Well Plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3855</td>
			<td>For VWF ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humate-P</td>
			<td>CSL Behring</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plasma-derived human von Willebrand factor/factor VIII complex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Reference Plasma</td>
			<td>Precision BioLogic</td>
			<td>CCNRP-05</td>
			<td>For VWF ELISA standard curve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD) reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8287</td>
			<td>Equivalent product available through ThermoFisher Scientific (Catalogue Number: 34006)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>For culturing and initial seeding of BOEC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat-tail Collagen Type 1</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td>For endothelial cell stimulations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>METAMORPH Microscopy Automation and Image Analysis Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Blood Collection Tubes, No Additive</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>366703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide III 0.1 (flow chambers)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td></td>
			<td>This product has been discontinued. We suggest using &#181;-Slide VI 0.1 (#80661) or 0.4 (# 80601) and recalculating flow rate and platelet volume needed to maintain a shear stress of 4.45 dyn/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Tubing 1.6 mm ID: 5 m, sterilized</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock Connector Female: natural Polypropylene, sterilized</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elbow Luer Connector Male: white Polypropylene, sterilized</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunted 18G Needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quorum WaveFX- 4X1 spinning disk microscope</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating von willebrand factor pathophysiology using a flow chamber model of von willebrand factor-platelet string formation

フォン ・ ヴィレブランド因子 (VWF) はポリコームタンパク糖タンパク質の凝固因子血小板粘着および血管内皮細胞障害のサイトで集計を仲介し、循環の第 VIII 因子を運ぶ。VWF は、血管内皮細胞で合成しプラズマに恒常解放ですかまたは止血チャレンジへの応答でのオンデマンド リリース Weibel Palade 体 (WPBs) と呼ばれる特殊な細胞小器官で格納されます。凝血促進および炎症性刺激は、WPB エキソサイトーシスと VWF リリースを急速に引き起こすことができます。VWF は、血管内皮細胞によるリリースの大半が循環するプラズマ;ただし、VWF の割合は、血管内皮細胞表面に固定されています。生理学的なせん断の条件の下で内皮アンカー VWF は、血栓形成の nidus を表す VWF 血小板文字列を形成血小板にバインドできます。流れ溜まりは、内皮細胞から VWF のリリースと再現し VWF を介する血栓形成の病態に関連する方法でキャプチャ後の血小板を視覚的に観察する使用できます。この方法を使用すると、内皮細胞培養流れ区域で、WPB の開口放出を誘発する分泌促進物質でその後刺激です。洗浄血小板は、活性化された血管内皮細胞に灌流します。血小板が活性化し、その後の流体の流れ方向に細長い VWF 文字列にバインドします。凝血促進、炎症性刺激として細胞のヒストンを使用して、ヒストン治療血管内皮細胞, 血管内皮細胞と比較して増加した VWF 血小板文字列形成を観察した.このプロトコルでは、止血と血栓形成モデルの VWF 血小板相互作用の活性化の定量的・視覚・ リアルタイム評価について説明します。

VWF リリース血管内皮細胞からのヒストンの影響を直接評価、2 h の無血清培地含む PMA (肯定的な制御)、UH、HR、および香港に合流 BOECs を公開しました。我々 は、HK 誘発処理血管内皮細胞 (図 1) の中の VWF 蛋白質 (VWF:Ag) の 2 倍増加したことを示した。興味深いことに、BOECs に UH と HR 刺激されたときが VWF:Ag 以下が検出されました未処理状態により...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation at JoVE.com

Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation

本稿で述べる内皮フォンヴィレブランドを評価するメソッド発売因子とその後の血小板を体外フロー チャンバー システムを使用して炎症性の刺激への応答における流体のせん断応力の下でキャプチャします。

調査フォン Willebrand 因子病態・ フォン ・ フロー チャンバー モデルを用いた Willebrand 因子-血小板文字列生成

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation

げっ歯類における腸運動と腸壁の炎症の機能評価：腸管操作の標準化されたモデルで分析

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common reason for a variety of human diseases. Animal research models are critical in investigating the ...

Orthotopic Small Bowel Transplantation in Rats

ラット同所性小腸移植

Small  bowel transplantation has become an accepted clinical option for patients with  short gut syndrome and failure of parenteral nutrition ...

The Rabbit Blood-shunt Model for the Study of Acute and Late Sequelae of Subarachnoid Hemorrhage: Technical Aspects

くも膜下出血の急性および後期後遺症の研究のためのウサギの血液シャントモデル：技術的側面

Early brain injury and delayed cerebral vasospasm both contribute to unfavorable outcomes after subarachnoid hemorrhage (SAH). Reproducible and ...

Mouse Model of Alloimmune-induced Vascular Rejection and Transplant Arteriosclerosis

同種免疫により誘導される血管拒絶反応および移植動脈硬化症のマウスモデル

Vascular rejection that leads to transplant arteriosclerosis (TA) is the leading representation of chronic heart transplant failure. In TA, the immune ...

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

戦略的な内皮細胞管形成アッセイ：細胞外マトリックスおよび成長因子の比較は、細胞外マトリックスを削減しました

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

Micro-dissection of Enamel Organ from Mandibular Incisor of Rats Exposed to Environmental Toxicants

環境有害物質に暴露したラットの下顎からエナメル器官の微細解剖

Enamel defects resulting from environmental conditions and ways of life are public health concerns because of their high prevalence. These defects result ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

ワイヤー図法を使用してマウスの腸間膜動脈の等尺性収縮力測定

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Vagus Nerve Stimulation As an Adjunctive Neurostimulation Tool in Treatment-resistant Depression

治療抵抗性うつ病の補助神経ツールとして迷走神経刺激

Vagus nerve stimulation (VNS) is an approved neurostimulation therapy. The purpose of the method is to treat patients with therapy-resistant depression ...

An In Vitro Hemodynamic Loop Model to Investigate the Hemocytocompatibility and Host Cell Activation of Vascular Medical Devices

血管医療機器の血球適合性と宿主細胞活性化を調べるインビトロ血球ループモデル

In this study, the hemocompatibility of tubes with an inner diameter of 5 mm made of polyvinyl chloride (PVC) and coated with different bioactive ...

Surfactant Depletion Combined with Injurious Ventilation Results in a Reproducible Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS)

Surfactant Depletion Combined with Injurious Ventilation Results in a Reproducible Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome ARDS

傷害性換気と組み合わせた界面活性剤の枯渇は急性呼吸窮迫症候群(ARDS)の再現可能なモデルをもたらす

Various animal models exist to study the complex pathomechanisms of the acute respiratory distress syndrome (ARDS). These models include pulmo-arterial ...

調査フォン Willebrand 因子病態・ フォン ・ フロー チャンバー モデルを用いた Willebrand 因子-血小板文字列生成

調査フォン Willebrand 因子病態・フォン・フローチャンバーモデルを用いた Willebrand 因子-血小板文字列生成