Name: investigating von willebrand factor pathophysiology using a flow chamber model of von willebrand factor-platelet string formation
Uploaded: 2017-08-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation at JoVE.com

Alison Michels er en mottaker av Frederick Banting og Charles Best Canada Graduate stipend fra Canadian institutter for helse forskning (CIHR). Laura L. Swystun er mottakeren en CIHR fellesskap. David Lillicrap er mottakeren av en Canada forskning stol i molekylær hemostasen. Denne studien ble finansiert delvis av en CIHR opererer grant (MOPP-97849).

Disse studiene ble godkjent av forskning etikk styret av Queen's University, Canada.
1. endothelial celle stimulering
<ol><li>
Kollagen-coat en 6-og vev kultur plate.
	<ol>
<li>24 timer i forveien, lag en 6-og vev kultur plate på 37 ° C med 1 mL av kollagen buffer (50 µg/mL rotte hale kollagen type 1 med 0.02 M iseddik).</li>
		<li>Vask brønnene to ganger med 2 mL av Hanks balansert Salt løsning (HBSS). Merk: Plater kan være pakket i tinn folie og lagret i en luftte...

Mens fysiologiske relevansen av VWF-Platederivert strenger fortsatt kontroversiell på grunn av deres raske oppløsningen i nærvær av den VWF-spalte protease ADAMTS13, tjener de som kvantifiserbare i vitro modell av blodplater rekruttering av VWF til et område på som en blodpropp kan danne i nærvær av lokalisert øker i histone nivå5. Videre i patologi mangler ADAMTS13 aktivitet, slik som trombotiske thrombocytopenic purpura (TTP) - eller inflammatorisk microenvironments - hvor ADA...

Blodpropp er en ledende årsak til dødelighet verdensomspennende1 og kan utvikle i svaret todysregulated Platederivert aktivisering og trombin generasjon i begge veinsand arterier. Plasmanivåer av VWF er en viktig regulator av blodpropp, der lave nivåer (< 50%) føre til blødning uorden kalles von Willebrand sykdom (VWD)2 og høye nivåer (> 150%) er assosiert med økt risiko for venøs3 og arterial4 trombose.
VWF er en multimeric glykoprotein syntetisert av megakaryocytes og endotelceller og lagret i blodplater α-korn og WPBs, henholdsvis. På hemostatic utfordring, kan VWF frigis fra endotelial WPBs å tjore sirkulerende blodplater aktivert endotelceller5 eller utsatt kollagen på fartøyet veggen6. Forankring av VWF til endotelceller har vist seg å være formidlet av P-selectin7 og integrin αvβ38. Etterfølgende utgivelsen av blodplater α-granulen butikker kan øke lokaliserte VWF konsentrasjoner å stabilisere blodplater-Platederivert samhandlinger for Platederivert plug formasjon, stillaset nødvendig for spredning av koagulasjonssystemet cascade og fibrin deponering. Blodplater-bindende aktiviteten til VWF er regulert av multimeric strukturen, med høy-molekylær vekt multimers besitter større hemostatic aktivitet9,10. I omløp fungerer VWF også som en bærer for koagulering faktor VIII.
Flytende skjær stress er en viktig regulator av VWF fysiologi. I fravær av skjæring stress finnes VWF i en globular form, skjuler bindende domener for Platederivert glykoprotein Ib vedheft11. Når skjæring stress, er cleavage området for en metalloprotease, en disintegrin og metalloprotease med thrombospondin motiv (ADAMTS13), utsatt. ADAMTS13 innstiftet naken og blodplater innredede VWF strenger å regulere multimer størrelse, og dermed redusere sin hemostatic aktivitet12.
VWF er en akutt fase protein, og mange stimuli, inkludert hypoksi13, infeksjon14og proinflammatory cytokiner, har vist seg å megle VWF utgivelse fra endotelceller. Ligner andre inflammatoriske agenter, ekstracellulære histones har også blitt vist å indusere systemisk VWF utgivelse i mus15,16 og aktivering av blodplater i vitro17,18, 19. dette viste seg å være avhengig av histone undertypen, som forskjeller i lysin og arginin innhold kan påvirke funksjonen15. Vår studie tar sikte på å etablere en flyt kammer modell for å undersøke påvirkning av lysin-rik (HK) og arginin-rik (HR) histone subtyper og secretagogues på endothelial VWF utgivelse og sanntid Platederivert fange, potensielle tidlig hendelser i betennelse-indusert trombose.
Denne flyten kammer metodikken viser i vivo interaksjoner mellom subendothelial kollagen, endotelceller, VWF og blodplater i en i vitro system som er visuelt, reproduserbare og målbare. Det gir mulighet for sanntids vurdering av alle aspekter av veien som regulerer VWF-Platederivert interaksjoner, inkludert WPB sekresjon, blodplater aktivisering og VWF proteolyse. Studier av VWF under kontrollerte skjæring stress forhold har blitt brukt til å evaluere VWD mutasjoner som svekke VWF utgivelse og blodplater-bindende funksjon20, WPB fysiologi21og VWF spalting av ADAMTS135. Vi bruker denne metodikken for å kvantifisere VWF-Platederivert streng dannelsen av en inflammatorisk stimulans: ekstracellulære histones.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Calf-thymus unfractionated histones (UH)</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>HLY</td>
			<td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf-thymus lysine-rich histones (HK)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H5505</td>
			<td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf-thymus arginine-rich histones (HR)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4830</td>
			<td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td>Reconstituted in DMSO (20 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7125-1G</td>
			<td>Reconstituted in water (50 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39; Dihexyloxacarbocyanine Iodide (DiOC6)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D273</td>
			<td>Reconstituted in methanol (20 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-VWF Coating Antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0082</td>
			<td>For VWF ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-VWF Detection Antibody, HRP conjugated</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>P0026</td>
			<td>For VWF ELISA and histone-VWF binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MaxiSorp flat-bottom 96-well microplates</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>44-2404-21</td>
			<td>For histone-VWF binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immulon 4 HBX Flat Bottom Microtiter 96-Well Plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3855</td>
			<td>For VWF ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humate-P</td>
			<td>CSL Behring</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plasma-derived human von Willebrand factor/factor VIII complex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Reference Plasma</td>
			<td>Precision BioLogic</td>
			<td>CCNRP-05</td>
			<td>For VWF ELISA standard curve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD) reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8287</td>
			<td>Equivalent product available through ThermoFisher Scientific (Catalogue Number: 34006)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>For culturing and initial seeding of BOEC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat-tail Collagen Type 1</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td>For endothelial cell stimulations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>METAMORPH Microscopy Automation and Image Analysis Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Blood Collection Tubes, No Additive</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>366703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide III 0.1 (flow chambers)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td></td>
			<td>This product has been discontinued. We suggest using &#181;-Slide VI 0.1 (#80661) or 0.4 (# 80601) and recalculating flow rate and platelet volume needed to maintain a shear stress of 4.45 dyn/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Tubing 1.6 mm ID: 5 m, sterilized</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock Connector Female: natural Polypropylene, sterilized</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elbow Luer Connector Male: white Polypropylene, sterilized</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunted 18G Needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quorum WaveFX- 4X1 spinning disk microscope</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating von willebrand factor pathophysiology using a flow chamber model of von willebrand factor-platelet string formation

Von Willebrand faktor (VWF) er en multimeric glykoprotein koagulering faktor som formidler Platederivert vedheft og samling på nettsteder av endothelial skade og som bærer faktor VIII i sirkulasjon. VWF er synthesized av endotelceller og slippes enten constitutively i plasma eller lagres i spesialiserte organelles, kalt Weibel-Palade organer (WPBs), for behovsbetinget utgivelsen svar hemostatic utfordring. Procoagulant og proinflammatory stimuli føre snarlig WPB exocytosis og VWF utgivelse. Fleste VWF utgitt av endotelceller sirkulerer i plasma; Imidlertid er en del av VWF forankret på endothelial celle overflaten. Tilfeller av fysiologiske skjær kan endothelial-forankret VWF binde til blodplater, danner en VWF-Platederivert streng som kan representere nidus av dannelse. Et kammer med system kan brukes til visuelt observere utgivelsen av VWF fra endotelceller og den påfølgende Platederivert fange på en måte som er reproduserbar og relevant i Patofysiologien ved VWF-mediert dannelse. Med denne metoden, endotelceller er kultivert i en flyt kammer og senere stimulert med secretagogues å indusere WPB exocytosis. Vasket blodplater er deretter perfused over aktivert endotelet. Blodplater er aktivert og deretter binde til langstrakte VWF strenger i retning av væskestrøm. Bruke ekstracellulære histones som en procoagulant og proinflammatory stimulans, observerte vi økt VWF-Platederivert streng formasjon på histone-behandlet endotelceller sammenlignet med ubehandlet endotelceller. Denne protokollen beskriver en kvantitativ, visuelle og sanntid vurdering av aktivering av VWF-Platederivert interaksjoner i modeller av tromboser og hemostasen.

Å direkte vurdere effekten av histones på VWF utgivelse fra endotelceller, utsatt vi confluent BOECs serum-fri medium som inneholder PMA (positiv kontroll), UH, HR og HK for 2T. Vi viste at HK indusert en 2-fold økning i VWF protein (VWF:Ag) i medium av behandlet endotelceller (figur 1). Interessant, da BOECs ble stimulert UH og HR, var det mindre VWF:Ag oppdaget i medium enn ubehandlet tilstanden. Vi hypotese at fordi histones kan bindes direkte til VWF<s...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation at JoVE.com

Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation

I dette papir, beskriver vi en metode for å vurdere endothelial von Willebrand faktor utgivelsen og den påfølgende Platederivert fange under væske skjæring stress svar på inflammatorisk stimuli bruker en i vitro flow chamber-system.

Undersøker von Willebrand faktor Patofysiologien ved hjelp av en Flow Chamber modell av von Willebrand faktor-Platederivert streng formasjon

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation

Funksjonell Vurdering av intestinal motilitet og tarmveggen Betennelse i Gnagere: Analyser i en standardisert modell for Intestinal Manipulation

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common reason for a variety of human diseases. Animal research models are critical in investigating the ...

Orthotopic Small Bowel Transplantation in Rats

Orthotopic tynntarm Transplantasjon i rotter

Small  bowel transplantation has become an accepted clinical option for patients with  short gut syndrome and failure of parenteral nutrition ...

The Rabbit Blood-shunt Model for the Study of Acute and Late Sequelae of Subarachnoid Hemorrhage: Technical Aspects

The Rabbit Blood-shunt modell for studier av akutt og senskader av subaraknoidalblødning: Tekniske aspekter

Early brain injury and delayed cerebral vasospasm both contribute to unfavorable outcomes after subarachnoid hemorrhage (SAH). Reproducible and ...

Mouse Model of Alloimmune-induced Vascular Rejection and Transplant Arteriosclerosis

Musemodell for alloimmun-indusert Vaskulær Avvisning og Transplant Arteriosclerosis

Vascular rejection that leads to transplant arteriosclerosis (TA) is the leading representation of chronic heart transplant failure. In TA, the immune ...

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Strategisk endotelcelle Tube Dannelse analyse: Sammenligning ekstracellulær matriks og Growth Factor Redusert ekstracellulær matriks

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

Micro-dissection of Enamel Organ from Mandibular Incisor of Rats Exposed to Environmental Toxicants

Mikro-Disseksjon av emalje orgel fra Mandibular helikopteret rotter utsatt for miljømessig giftstoffer

Enamel defects resulting from environmental conditions and ways of life are public health concerns because of their high prevalence. These defects result ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Isometrisk Contractility måling av musen hvem arterien bruker Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Vagus Nerve Stimulation As an Adjunctive Neurostimulation Tool in Treatment-resistant Depression

Nervus vagus stimulering som en Tilleggsbehandling Neurostimulation verktøy i behandling mot depresjon

Vagus nerve stimulation (VNS) is an approved neurostimulation therapy. The purpose of the method is to treat patients with therapy-resistant depression ...

An In Vitro Hemodynamic Loop Model to Investigate the Hemocytocompatibility and Host Cell Activation of Vascular Medical Devices

En In Vitro Hemodynamic Loop Modell for å undersøke hemocytokompatibilitet og vertscelleaktivering av vaskulære medisinske enheter

In this study, the hemocompatibility of tubes with an inner diameter of 5 mm made of polyvinyl chloride (PVC) and coated with different bioactive ...

Surfactant Depletion Combined with Injurious Ventilation Results in a Reproducible Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS)

Surfactant Depletion Combined with Injurious Ventilation Results in a Reproducible Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome ARDS

Overflateaktiv uttømming kombinert med skadelig ventilasjon resulterer i en reproduserbar modell av akutt respiratorisk nødsyndrom (ARDS)

Various animal models exist to study the complex pathomechanisms of the acute respiratory distress syndrome (ARDS). These models include pulmo-arterial ...