Name: investigating von willebrand factor pathophysiology using a flow chamber model of von willebrand factor-platelet string formation
Uploaded: 2017-08-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation at JoVE.com

Alison Michels é um destinatário de um Frederick Banting e Charles Best Canadá graduação bolsa de institutos canadenses da pesquisa saúde (CIHR). Laura L. Swystun é o destinatário de uma comunhão CIHR. David Lillicrap é o destinatário de uma cadeira de pesquisa do Canadá na hemostase Molecular. Este estudo foi financiado em parte por um CIHR grant (MOP-97849) de funcionamento.

Estes estudos foram aprovados pelo University, Canadá da investigação ética Board da rainha.
1. endothelial da pilha estimulação
<ol><li>
Uma placa de cultura de tecidos de 6-poços de colágeno-casaco.
	<ol>
<li>24 h de antecedência, casaco, uma placa de cultura de tecidos de 6-poços em 37 ° C, com 1 mL de colágeno de buffer (50 µ g/mL rato cauda colágeno tipo 1 com 0,02 M de ácido acético glacial).</li>
		<li>Lave os poços duas vezes com 2 mL de Hank está e...

Enquanto a relevância fisiológica do VWF-plaquetas cordas permanece controverso devido a sua rápida dissolução na presença da VWF-cleaving protease ADAMTS13, eles servem como um modelo quantificável em vitro de recrutamento de plaquetas pelo VWF para um site em que um trombo pode formar na presença de localizadas aumentos nos níveis de histona5. Além disso, em patologias falta ADAMTS13 atividade-tais como púrpura trombocitopênica trombótica (PTT) - ou no microambiente inflama...

Trombose é a principal causa de mortalidade no mundo1 e pode se desenvolver em resposta todysregulated plaquetária ativação e trombina geração em ambas as artérias veinsand. Os níveis plasmáticos de VWF são um regulador chave de coagulação do sangue, segundo o qual a níveis baixos (< 50%) resultar no distúrbio hemorrágico, conhecido como von Willebrand (VWD) de doença2 e níveis elevados (> 150%) estão associados com um risco aumentado de venosa3 e trombose arterial4 .
VWF é uma glicoproteína multiméricas sintetizada pelos megacariócitos e células endoteliais e armazenado em plaquetas α-grânulos e WPBs, respectivamente. Desafio hemostático, VWF pode ser liberado da endoteliais WPBs para amarrar as plaquetas circulantes de células endoteliais ativadas5 ou colágeno exposto no vaso parede6. Ancoragem de VWF para células endoteliais foi mostrado para ser mediado pelo P-selectina7 e integrinas αvβ38. A subsequente liberação de plaquetas α-grânulo lojas pode aumentar ainda mais as concentrações de VWF localizadas para estabilizar as interações de plaquetas-plaquetas para a formação de plaquetas plug, o andaime necessário para a propagação da cascata de coagulação e fibrina deposição. A atividade de plaquetas-ligação do VWF é regulada pela sua estrutura multiméricas, com oriundas de alto peso molecular, possuindo maior atividade hemostática9,10. Em circulação, VWF também atua como um portador para o factor VIII de coagulação.
Tensão de cisalhamento de fluido é um regulador essencial da fisiologia do VWF. Na ausência de tensão de cisalhamento, VWF existe sob uma forma globular, ocultando os domínios de ligação para a glicoproteína plaquetária Ib adesão11. Quando a tensão de cisalhamento está presente, o local de clivagem para uma metalloprotease, uma Desintegrina e metalloprotease com motivo thrombospondin (ADAMTS13), é exposto. ADAMTS13 cliva nuas e plaquetas-decorado VWF sequências de caracteres para regular o tamanho do multimer, reduzindo sua atividade hemostática12.
VWF é uma proteína de fase aguda, e inúmeros estímulos, incluindo hipoxia13, infecção14e cytokines proinflammatory, foram mostrados para mediar a liberação VWF de células endoteliais. Semelhante a outros agentes inflamatórios, histonas extracelulares também foram mostrados para induzir liberação sistêmica de VWF ratos15,16 e a ativação de plaquetas em vitro17,18, 19. isto foi mostrado para ser dependente de subtipo de histona, como diferenças de lisina e conteúdo de arginina pode influenciar a função15. Nossa estudo visa estabelecer uma câmara de fluxo modelo para investigar a influência do rico em lisina (HK) e ricos em arginina subtipos de histona (HR) e secretagogues na liberação VWF endotelial e plaquetária em tempo real de captura, potenciais eventos precoce em trombose induzida por inflamação.
Esta metodologia de câmara de fluxo recapitula em vivo de interações entre as plaquetas, células endoteliais, VWF e colágeno subendotelial em um sistema em vitro que é visual, reprodutível e quantificáveis. Permite a avaliação em tempo real de todos os aspectos do percurso que regula as interações VWF-plaquetas, incluindo secreção WPB, Ativação plaquetária e proteólise VWF. Estudos de VWF sob condições controladas de tensão de cisalhamento têm sido utilizados para avaliar as mutações do VWD que prejudicam a liberação do VWF e plaqueta-ligação função20, WPB fisiologia21e clivagem VWF por ADAMTS135. Nós usamos esta metodologia para quantificar a formação de cadeia de caracteres VWF-plaquetas como consequência de um estímulo inflamatório: histonas extracelulares.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Calf-thymus unfractionated histones (UH)</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>HLY</td>
			<td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf-thymus lysine-rich histones (HK)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H5505</td>
			<td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf-thymus arginine-rich histones (HR)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4830</td>
			<td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td>Reconstituted in DMSO (20 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7125-1G</td>
			<td>Reconstituted in water (50 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39; Dihexyloxacarbocyanine Iodide (DiOC6)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D273</td>
			<td>Reconstituted in methanol (20 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-VWF Coating Antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0082</td>
			<td>For VWF ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-VWF Detection Antibody, HRP conjugated</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>P0026</td>
			<td>For VWF ELISA and histone-VWF binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MaxiSorp flat-bottom 96-well microplates</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>44-2404-21</td>
			<td>For histone-VWF binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immulon 4 HBX Flat Bottom Microtiter 96-Well Plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3855</td>
			<td>For VWF ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humate-P</td>
			<td>CSL Behring</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plasma-derived human von Willebrand factor/factor VIII complex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Reference Plasma</td>
			<td>Precision BioLogic</td>
			<td>CCNRP-05</td>
			<td>For VWF ELISA standard curve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD) reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8287</td>
			<td>Equivalent product available through ThermoFisher Scientific (Catalogue Number: 34006)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>For culturing and initial seeding of BOEC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat-tail Collagen Type 1</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td>For endothelial cell stimulations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>METAMORPH Microscopy Automation and Image Analysis Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Blood Collection Tubes, No Additive</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>366703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide III 0.1 (flow chambers)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td></td>
			<td>This product has been discontinued. We suggest using &#181;-Slide VI 0.1 (#80661) or 0.4 (# 80601) and recalculating flow rate and platelet volume needed to maintain a shear stress of 4.45 dyn/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Tubing 1.6 mm ID: 5 m, sterilized</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock Connector Female: natural Polypropylene, sterilized</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elbow Luer Connector Male: white Polypropylene, sterilized</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunted 18G Needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quorum WaveFX- 4X1 spinning disk microscope</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating von willebrand factor pathophysiology using a flow chamber model of von willebrand factor-platelet string formation

Fator de von Willebrand (VWF) é um fator de coagulação multiméricas glicoproteína que medeia adesão plaquetária e agregação em locais de dano endotelial e que transporta o fator VIII na circulação. VWF é sintetizada pelas células endoteliais e também é lançado constitutivamente para o plasma ou é armazenada em organelas especializadas, chamadas corpos de Weibel-Palade (WPBs), para a liberação sob demanda em resposta ao desafio hemostática. Procoagulante e proinflammatory estímulos podem induzir rapidamente exocitose WPB e lançamento do VWF. A maioria de VWF liberado pelas células endoteliais circula no plasma; no entanto, uma proporção de VWF é ancorada à superfície da célula endotelial. Sob condições de cisalhamento fisiológica, VWF ancorada endotelial pode vincular a plaquetas, formando uma cadeia de caracteres de VWF-plaquetas que pode representar o nicho da formação de trombos. Um sistema de câmara de fluxo pode ser usado para observar visualmente a liberação de VWF de células endoteliais e a subsequente plaqueta de capturar em uma maneira que seja reprodutível e relevantes para a fisiopatologia da formação de trombos VWF-mediada. Usando esta metodologia, as células endoteliais são cultivadas em uma câmara de fluxo e são posteriormente estimuladas com secretagogues de induzir exocitose WPB. As plaquetas lavadas então são pintadas sobre o endotélio ativado. As plaquetas são ativadas e posteriormente ligam a sequências VWF alongadas na direção do fluxo do fluido. Usando os histones extracelulares como um estímulo procoagulante e proinflammatory, observamos maior formação de sequência de caracteres VWF-plaquetas células endoteliais histona-tratadas em comparação com as células endoteliais não tratadas. Este protocolo descreve uma avaliação quantitativa, visual e em tempo real da ativação de interações VWF-plaquetas em modelos de trombose e hemostasia.

Para avaliar diretamente o efeito das histonas na liberação VWF de células endoteliais, estamos expostos a confluentes BOECs de PMA contendo soro livre médio (controle positivo), UH, HR e HK por 2 h. Nós mostramos que a HK induziu um aumento de 2 vezes em proteínas VWF (VWFAg) no meio de células endoteliais expostas (Figura 1). Curiosamente, quando BOECs foram estimulados com UH e RH, lá era menos VWFAg detectado no meio do que na condição de não t...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation at JoVE.com

Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation

Neste trabalho, descrevemos um método para avaliar endotelial von Willebrand fator liberação e as plaquetas subsequentes capturam sob tensão de cisalhamento de fluido em resposta a estímulos inflamatórios, usando um sistema de câmara de fluxo em vitro .

Investigando a von Willebrand Factor fisiopatologia usando um modelo de câmara de fluxo de von Willebrand Factor-plaquetas String formação

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation

Avaliação Funcional da motilidade intestinal e inflamação da parede do intestino em Roedores: Análises em um modelo padronizado de Manipulação Intestinal

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common reason for a variety of human diseases. Animal research models are critical in investigating the ...

Medicina

Orthotopic Small Bowel Transplantation in Rats

Transplante de intestino delgado de ratos ortotópico

Small  bowel transplantation has become an accepted clinical option for patients with  short gut syndrome and failure of parenteral nutrition ...

The Rabbit Blood-shunt Model for the Study of Acute and Late Sequelae of Subarachnoid Hemorrhage: Technical Aspects

O coelho Modelo Blood-shunt para o Estudo da aguda e tardia Sequelas de hemorragia subaracnóidea: Aspectos Técnicos

Early brain injury and delayed cerebral vasospasm both contribute to unfavorable outcomes after subarachnoid hemorrhage (SAH). Reproducible and ...

Mouse Model of Alloimmune-induced Vascular Rejection and Transplant Arteriosclerosis

Modelo rato de rejeição vascular induzida por Aloimune e Transplante Arteriosclerose

Vascular rejection that leads to transplant arteriosclerosis (TA) is the leading representation of chronic heart transplant failure. In TA, the immune ...

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Endotelial estratégica Assay formação de células do tubo: Comparando Matriz Extracelular e Fator de Crescimento Reduzido Matriz Extracelular

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

Micro-dissection of Enamel Organ from Mandibular Incisor of Rats Exposed to Environmental Toxicants

Microdissecação do órgão do esmalte do incisivo de ratos expostos a tóxicos ambientais

Enamel defects resulting from environmental conditions and ways of life are public health concerns because of their high prevalence. These defects result ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Medição de contratilidade isométrica da artéria mesentérica Mouse usando fio miografia

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Vagus Nerve Stimulation As an Adjunctive Neurostimulation Tool in Treatment-resistant Depression

Estimulação do nervo vago como uma ferramenta de neuroestimulação adjuvante na depressão tratamento-resistente

Vagus nerve stimulation (VNS) is an approved neurostimulation therapy. The purpose of the method is to treat patients with therapy-resistant depression ...

An In Vitro Hemodynamic Loop Model to Investigate the Hemocytocompatibility and Host Cell Activation of Vascular Medical Devices

Um modelo de loop hemodinâmico in vitro para investigar a hemocitocompatibilidade e ativação celular hospedeira de dispositivos médicos vasculares

In this study, the hemocompatibility of tubes with an inner diameter of 5 mm made of polyvinyl chloride (PVC) and coated with different bioactive ...

Surfactant Depletion Combined with Injurious Ventilation Results in a Reproducible Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS)

Surfactant Depletion Combined with Injurious Ventilation Results in a Reproducible Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome ARDS

Esgotamento do surfactante combinado com ventilação prejudicial resulta em um modelo reprodutível da Síndrome do Sofrimento Respiratório Agudo (ARDS)

Various animal models exist to study the complex pathomechanisms of the acute respiratory distress syndrome (ARDS). These models include pulmo-arterial ...