Name: investigating von willebrand factor pathophysiology using a flow chamber model of von willebrand factor-platelet string formation
Uploaded: 2017-08-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation at JoVE.com

Элисон Михельс является получателем Фредерик Banting и Чарльз Лучшие Канада выпускников стипендии от канадской институтов здравоохранения исследований (КНИИЗ). Лаура л Swystun является получателем стипендий КНИИЗ. Дэвид Lillicrap является получателем Канада исследований кафедры в молекулярной гемостаз. Это исследование финансировалось частично КНИИЗ действующих грантов (СС-97849).

Эти исследования были утверждены исследовательской этики Совет королевы университет, Канада.
1. эндотелиальных клеток стимуляция
<ol><li>
Коллаген слой пластины 6-ну тканевые культуры.
	<ol>
<li>24 часа заранее, Пальто плиты 6-ну тканевые культуры при 37 ° C с 1 мл раствора ...

В то время как физиологические актуальность VWF-тромбоцитов строк остается спорным из-за их быстрое растворение в присутствии VWF-раскалывание протеазы ADAMTS13, они служат модель количественно в vitro тромбоцитов вербовки VWF на сайт на которые могли тромба в присутствии из локализованных...

Тромбоз является ведущей причиной смертности во всем мире1 и может развиваться в ответ todysregulated тромбоцитов активации и тромбина поколения в обоих расширение артерий. Плазменные уровни VWF являются ключевым регулятором свертывающей системы крови, при котором низкий уровень (< 50%) привести в нарушение свертываемости крови, известный как Виллебранда болезни (VWD)2 и высокие уровни (> 150%), связанные с повышенным риском венозного3 и тромбоз артерий4 .
VWF это гликопротеин multimeric синтезированы megakaryocytes и эндотелиальных клеток и хранится в α-гранулы тромбоцитов и WPBs, соответственно. После гемостаза вызов VWF могут быть освобождены от эндотелия WPBs привязать циркулирующих тромбоцитов активированные эндотелиальные клетки5 или подвергаются коллагена на судно стены6. Анкеровка VWF эндотелиальных клеток было показано, быть опосредовано P селектина7 и Интегрин альфаvβ38. Последующий релиз магазинов α-гранулы тромбоцитов может еще больше повысить локализованных VWF концентрации для стабилизации тромбоцитов тромбоцитов взаимодействий для формирования вилка тромбоцитов, леска, необходимые для распространения каскад свертывания крови и фибрин осаждения. Тромбоциты привязки активность VWF регулируется по своей структуре multimeric, высокомолекулярный вес мультимеры, обладающие большей кровоостанавливающее действие9,10. В обращении VWF также выступает в качестве носителя для коагуляционного фактора VIII.
Жидкости касательное напряжение является важным регулятором VWF физиологии. В отсутствие напряжения сдвига VWF существует в шарообразную форму, сокрытие связывания доменов для тромбоцитов гликопротеина Ib адгезии11. Когда присутствует напряжение сдвига, расщепление сайт для metalloprotease, Дизинтегрин и metalloprotease с мотивом тромбоспондин (ADAMTS13), подвергается. ADAMTS13 расщепляет голый и тромбоцитов оформленный VWF строк регулировать размер multimer, тем самым уменьшая его кровоостанавливающее действие12.
VWF — белок острой фазы, и было показано, что многочисленные стимулы, включая гипоксии13, инфекции14и провоспалительных цитокинов, посреднические VWF освобождения из эндотелиальных клеток. Похож на другие воспалительные агенты, внеклеточная гистонами также было показано, побудить системных VWF выпуска в мышей15,16 и активации тромбоцитов в vitro17,18, 19. это было показано зависел гистона подтип, как различия в лизине и содержание аргинина может повлиять на функции15. Наши исследования стремится создать камеру потока модели в том, чтобы исследовать влияние лизин-богатые люди (HK) и аргинин богатые подтипы гистонов (HR) и secretagogues на эндотелиальных VWF выпуска и тромбоцитов в реальном времени захвата, потенциал раннего события воспаление индуцированной тромбоза.
Эта методология камеры потока резюмирует в естественных условиях взаимодействия между субэндотелиальном коллагена, эндотелиальные клетки, VWF и тромбоцитов в системе в пробирке , визуальные, воспроизводимые и поддающихся количественной оценке. Это позволяет в реальном времени оценки всех аспектов путь, который регулирует VWF-тромбоцитов взаимодействия, включая WPB секреции, активации тромбоцитов и VWF протеолиза. ADAMTS135использовали для оценки VWD мутации, которые ослабляют VWF выпуска и тромбоцитов привязки функции20, WPB физиологии21и VWF расщепления исследования VWF при сдвиге в контролируемых условиях. Мы используем эту методологию количественной оценки формирования строки VWF-тромбоцитов вследствие воспалительных стимул: внеклеточная гистонами.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Calf-thymus unfractionated histones (UH)</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>HLY</td>
			<td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf-thymus lysine-rich histones (HK)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H5505</td>
			<td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf-thymus arginine-rich histones (HR)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4830</td>
			<td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td>Reconstituted in DMSO (20 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7125-1G</td>
			<td>Reconstituted in water (50 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39; Dihexyloxacarbocyanine Iodide (DiOC6)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D273</td>
			<td>Reconstituted in methanol (20 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-VWF Coating Antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0082</td>
			<td>For VWF ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-VWF Detection Antibody, HRP conjugated</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>P0026</td>
			<td>For VWF ELISA and histone-VWF binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MaxiSorp flat-bottom 96-well microplates</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>44-2404-21</td>
			<td>For histone-VWF binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immulon 4 HBX Flat Bottom Microtiter 96-Well Plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3855</td>
			<td>For VWF ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humate-P</td>
			<td>CSL Behring</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plasma-derived human von Willebrand factor/factor VIII complex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Reference Plasma</td>
			<td>Precision BioLogic</td>
			<td>CCNRP-05</td>
			<td>For VWF ELISA standard curve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD) reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8287</td>
			<td>Equivalent product available through ThermoFisher Scientific (Catalogue Number: 34006)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>For culturing and initial seeding of BOEC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat-tail Collagen Type 1</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td>For endothelial cell stimulations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>METAMORPH Microscopy Automation and Image Analysis Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Blood Collection Tubes, No Additive</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>366703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide III 0.1 (flow chambers)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td></td>
			<td>This product has been discontinued. We suggest using &#181;-Slide VI 0.1 (#80661) or 0.4 (# 80601) and recalculating flow rate and platelet volume needed to maintain a shear stress of 4.45 dyn/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Tubing 1.6 mm ID: 5 m, sterilized</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock Connector Female: natural Polypropylene, sterilized</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elbow Luer Connector Male: white Polypropylene, sterilized</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunted 18G Needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quorum WaveFX- 4X1 spinning disk microscope</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating von willebrand factor pathophysiology using a flow chamber model of von willebrand factor-platelet string formation

Фактор Виллебранда (VWF) является фактор свертывания гликопротеин multimeric которая опосредует тромбоцитов адгезии и агрегации в местах повреждения эндотелия и что несет фактора VIII в циркуляции. VWF синтезируется эндотелиальных клеток и конститутивно высвобождается в плазме или хранится в специализированные органеллы, называется Weibel-Паладе органов (WPBs), для выпуска по требованию в ответ на вызов гемостаза. Быстро procoagulant и провоспалительных раздражителей может вызвать WPB экзоцитоз и VWF выпуска. Большинство VWF выпущенное эндотелиальных клеток циркулирует в плазме; Однако доля VWF привязанный к поверхности эндотелиальных клеток. В условиях физиологического сдвига эндотелиальные якорь VWF можно связать тромбоцитов, образуя VWF-тромбоцитов строку, которая может представлять очагов тромбообразованию. Камерная система потока может использоваться визуально наблюдать за освобождение VWF из эндотелиальных клеток и последующие тромбоцитов захватить образом, воспроизводимые и отношение к патофизиологии VWF-опосредованной тромбообразованию. Используя эту методологию, эндотелиальные клетки культивировали в камере потока и впоследствии стимулируются с secretagogues побудить WPB экзоцитоз. Промывают тромбоцитов затем увлажненную над активированные эндотелия. Тромбоциты активируются и впоследствии связать удлиненные VWF строки в направлении потока жидкости. С помощью внеклеточного гистонами как procoagulant и провоспалительных стимул, мы наблюдали повышенное образование строку VWF-тромбоцитов на лечение гистона эндотелиальных клеток, по сравнению с необработанными эндотелиальных клеток. Этот протокол описывает количественные, визуальные и реального времени оценки активации VWF-тромбоцитов взаимодействий в моделях тромбоза и гемостаз.

Чтобы непосредственно оценить влияние гистонами VWF освобождения из эндотелиальных клеток, мы подвергаемся вырожденная BOECs сыворотки бесплатно средних содержащие PMA (положительный контроль), UH, HR и HK за 2 ч. Мы показали, что HK индуцированной 2 раза увеличение VWF белка (VWF:Ag)...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation at JoVE.com

Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation

В настоящем документе мы описываем метода для оценки эндотелиальной Виллебранда коэффициент выпуска и последующие тромбоцитов захвата под жидкости касательное напряжение в ответ на воспалительные раздражителей, с помощью системы камеры потока в пробирке .

Расследование фон Виллебранда фактор патофизиологии с помощью потока камеры модели фон Виллебранда фактор тромбоцитов строки формирования

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation

Функциональная оценка моторики кишечника и воспаление стенки кишечника у грызунов: Анализы в стандартной модели Кишечные Манипуляции

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common reason for a variety of human diseases. Animal research models are critical in investigating the ...

Orthotopic Small Bowel Transplantation in Rats

Ортотопическая малого трансплантации кишечника у крыс

Small  bowel transplantation has become an accepted clinical option for patients with  short gut syndrome and failure of parenteral nutrition ...

The Rabbit Blood-shunt Model for the Study of Acute and Late Sequelae of Subarachnoid Hemorrhage: Technical Aspects

Кролик Кровь-шунт Модель по изучению острой и отдаленных последствий субарахноидального кровоизлияния: Технические аспекты

Early brain injury and delayed cerebral vasospasm both contribute to unfavorable outcomes after subarachnoid hemorrhage (SAH). Reproducible and ...

Mouse Model of Alloimmune-induced Vascular Rejection and Transplant Arteriosclerosis

Мышь Модель аллоиммунная-индуцированной сосудистой неприятие и трансплантации атеросклероз

Vascular rejection that leads to transplant arteriosclerosis (TA) is the leading representation of chronic heart transplant failure. In TA, the immune ...

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Стратегическая эндотелиальных клеток Tube Формирование анализа: Сравнение внеклеточного матрикса и фактор роста Снижение внеклеточного матрикса

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

Micro-dissection of Enamel Organ from Mandibular Incisor of Rats Exposed to Environmental Toxicants

Микро рассечение эмаль органа от нижней челюсти резцы крыс воздействию экологических токсикантов

Enamel defects resulting from environmental conditions and ways of life are public health concerns because of their high prevalence. These defects result ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Изометрические сократимости измерение верхней брыжеечной артерии мыши, с помощью проволоки миография

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Vagus Nerve Stimulation As an Adjunctive Neurostimulation Tool in Treatment-resistant Depression

Стимуляция блуждающего нерва как инструмент добавочной нейростимуляция в устойчивостью лечение депрессии

Vagus nerve stimulation (VNS) is an approved neurostimulation therapy. The purpose of the method is to treat patients with therapy-resistant depression ...

An In Vitro Hemodynamic Loop Model to Investigate the Hemocytocompatibility and Host Cell Activation of Vascular Medical Devices

Модель гемодинамической петли In Vitro для исследования гемоцитосовместимости и активации клеток-хостов сосудистых медицинских устройств

In this study, the hemocompatibility of tubes with an inner diameter of 5 mm made of polyvinyl chloride (PVC) and coated with different bioactive ...

Surfactant Depletion Combined with Injurious Ventilation Results in a Reproducible Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS)

Surfactant Depletion Combined with Injurious Ventilation Results in a Reproducible Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome ARDS

Истощение поверхностно-активных веществ в сочетании с вредной вентиляцией приводит к воспроизводимой модели острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС)

Various animal models exist to study the complex pathomechanisms of the acute respiratory distress syndrome (ARDS). These models include pulmo-arterial ...