Name: investigating von willebrand factor pathophysiology using a flow chamber model of von willebrand factor-platelet string formation
Uploaded: 2017-08-14T14:00:00
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Alison Michels es un recipiente de Frederick Banting y Charles Best Canadá becas postgrado de los institutos canadienses de investigación de salud (CIHR). Laura L. Swystun es el recipiente de una beca CIHR. David Lillicrap es el receptor de una Cátedra de investigación de Canadá en Molecular de la hemostasia. Este estudio fue financiado en parte por un subvención (MOP-97849) de funcionamiento el CIHR.

Estos estudios fueron aprobados por la Universidad de Canadá de la investigación ética Junta de Reina.
1. endotelial celular estimulación
<ol><li>
Capa de colágeno una placa de cultivo de tejidos bien 6.
	<ol>
<li>24 horas por adelantado, una placa de cultivo de tejidos bien 6 a 37 ° C con 1 mL de colágeno de capa del almacenador intermediario (50 μg/mL rata cola colágeno tipo 1 con 0.02 M de ácido acético glacial).</li>
		<li>Lavar los pozos dos veces con 2 mL de...

Mientras que la relevancia fisiológica de VWF-plaqueta cadenas sigue siendo polémico debido a su rápida disolución en presencia de la proteasa hiende VWF ADAMTS13, sirven como un modelo cuantificable en vitro de reclutamiento de plaquetas por VWF a un sitio en que puede formar un trombo en la presencia de localizada aumento de histona niveles5. Por otra parte, en patologías falta ADAMTS13 actividad, tales como púrpura thrombocytopenic trombótica (TTP) - o en microambientes inflamat...

La trombosis es la principal causa de mortalidad en todo el mundo1 y puede convertirse en respuesta todysregulated plaqueta activación trombina generación y en ambas arterias veinsand. Niveles del plasma del VWF están un regulador clave de la coagulación sanguínea, por el que baja los niveles (< 50%) como resultado del desorden de la sangría conocido como von Willebrand (VWD) la enfermedad2 y altos niveles (> 150%) están asociados con un mayor riesgo de venosa3 y trombosis arterial4 .
FvW es una glicoproteína multimérica sintetizada por células endoteliales y megacariocitos y almacenado en α-gránulos de la plaqueta y WPBs, respectivamente. Sobre desafío hemostático, VWF puede liberarse de WPBs endoteliales para atar las plaquetas circulantes a las células endoteliales activadas5 o colágeno expuesto en la pared de vaso6. Anclaje del VWF a las células endoteliales se ha demostrado para ser mediado por P-selectin7 y la integrina αvβ38. El lanzamiento subsecuente de tiendas de α-gránulos de plaquetas puede aumentar concentraciones localizadas de VWF para estabilizar la interacción de plaquetas-plaquetas para la formación de tapón de plaquetas, el andamio necesario para la propagación de fibrina y la cascada de coagulación deposición. La actividad de unión a plaquetas de VWF está regulada por su estructura multimérica, con Multímeros de peso molecular alto que poseen mayor actividad hemostática9,10. En circulación, VWF también actúa como un portador para el factor VIII de coagulación.
Líquido tensión de esquileo es un regulador esencial de la fisiología VWF. En la ausencia de tensión de esquileo, VWF existe en una forma globular, encubrimiento de dominios de unión de la glicoproteína plaquetaria Ib adhesión11. Cuando existe tensión de esquileo, el sitio de la hendidura para una metaloproteinasa, una conclusión y metalloprotease con motivo del thrombospondin (ADAMTS13), se expone. ADAMTS13 hiende desnudas y plaquetas decoradas VWF cadenas de regular tamaño de multimer, reduciendo su actividad hemostática12.
VWF es una proteína de fase aguda, y numerosos estímulos, incluyendo hipoxia13, infección14y citoquinas proinflamatorias, se ha demostrado para mediar la liberación de FvW de las células endoteliales. Similar a otros agentes inflamatorios, las histonas extracelulares también han demostrado para inducir la liberación de FvW sistémica en ratones15,16 y la activación de las plaquetas en vitro17,18, 19. esto fue demostrado para ser dependiente sobre el subtipo de histonas, como diferencias en lisina y contenido de arginina puede influir en la función15. Nuestro estudio pretende establecer una cámara de flujo modelo para investigar la influencia de los ricos en lisina (HK) y captura de ricos en arginina (HR) los subtipos histona y secretagogos en la liberación de FvW endotelial y plaquetaria en tiempo real, posibles acontecimientos tempranos en trombosis inducida por inflamación.
Esta metodología de la cámara de flujo recapitula en vivo las interacciones entre el colágeno subendotelial, células endoteliales, FvW y plaquetas en un sistema en vitro que es cuantificables, reproducibles y visual. Permite la evaluación en tiempo real de todos los aspectos de la vía que regula la interacción VWF-plaqueta, incluyendo secreción de WPB, activación plaquetaria y proteólisis VWF. Estudios de VWF bajo condiciones de estrés de cizallamiento controlados se han utilizado para evaluar mutaciones de VWD que afectar la liberación de FvW y Unión a plaquetas función20, WPB fisiología21y escote VWF por ADAMTS135. Utilizamos esta metodología para cuantificar la formación de cadena de FvW plaquetas como consecuencia de un estímulo inflamatorio: las histonas extracelulares.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Calf-thymus unfractionated histones (UH)</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>HLY</td>
			<td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf-thymus lysine-rich histones (HK)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H5505</td>
			<td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf-thymus arginine-rich histones (HR)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4830</td>
			<td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td>Reconstituted in DMSO (20 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7125-1G</td>
			<td>Reconstituted in water (50 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39; Dihexyloxacarbocyanine Iodide (DiOC6)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D273</td>
			<td>Reconstituted in methanol (20 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-VWF Coating Antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0082</td>
			<td>For VWF ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-VWF Detection Antibody, HRP conjugated</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>P0026</td>
			<td>For VWF ELISA and histone-VWF binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MaxiSorp flat-bottom 96-well microplates</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>44-2404-21</td>
			<td>For histone-VWF binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immulon 4 HBX Flat Bottom Microtiter 96-Well Plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3855</td>
			<td>For VWF ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humate-P</td>
			<td>CSL Behring</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plasma-derived human von Willebrand factor/factor VIII complex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Reference Plasma</td>
			<td>Precision BioLogic</td>
			<td>CCNRP-05</td>
			<td>For VWF ELISA standard curve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD) reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8287</td>
			<td>Equivalent product available through ThermoFisher Scientific (Catalogue Number: 34006)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>For culturing and initial seeding of BOEC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat-tail Collagen Type 1</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td>For endothelial cell stimulations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>METAMORPH Microscopy Automation and Image Analysis Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Blood Collection Tubes, No Additive</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>366703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide III 0.1 (flow chambers)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td></td>
			<td>This product has been discontinued. We suggest using &#181;-Slide VI 0.1 (#80661) or 0.4 (# 80601) and recalculating flow rate and platelet volume needed to maintain a shear stress of 4.45 dyn/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Tubing 1.6 mm ID: 5 m, sterilized</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock Connector Female: natural Polypropylene, sterilized</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elbow Luer Connector Male: white Polypropylene, sterilized</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunted 18G Needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quorum WaveFX- 4X1 spinning disk microscope</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating von willebrand factor pathophysiology using a flow chamber model of von willebrand factor-platelet string formation

Factor de von Willebrand (VWF) es un factor de coagulación de glicoproteína multimérica que media la adherencia plaquetaria y agregación en los sitios de daño endotelial y que lleva factor VIII en la circulación. FvW es sintetizado por las células endoteliales y constitutivamente o se libera en el plasma o se almacena en organelos especializados, llamados cuerpos de Weibel-Palade (WPBs), para el lanzamiento de la demanda en respuesta al reto hemostático. Estímulos procoagulantes y proinflamatorias rápidamente pueden inducir exocitosis WPB y liberación de FvW. La mayoría de los liberados por las células endoteliales de FvW circula en el plasma; sin embargo, una proporción de VWF está anclada a la superficie de la célula endotelial. Bajo condiciones de corte fisiológico, FvW endotelial anclado puede enlazar a las plaquetas, formando una cadena de FvW plaquetario que puede representar el nido de formación de trombos. Un sistema de cámaras de flujo puede utilizarse para observar visualmente la liberación de FvW de las células endoteliales y las plaquetas subsecuente captura de manera reproducible y relevante en la fisiopatología de la formación del trombo mediada por el VWF. Utilizando esta metodología, las células endoteliales son cultivadas en una cámara de flujo y posteriormente estimuladas con secretagogos para inducir la exocitosis WPB. Plaquetas lavadas son perfundidas entonces sobre el endotelio activado. Las plaquetas se activan y posteriormente se unen a secuencias VWF alargadas en la dirección del flujo de fluidos. Utilizando las histonas extracelulares como un estímulo procoagulantes y proinflamatorias, se observó formación de cadena creciente del VWF-plaqueta en las células endoteliales tratadas con histonas en comparación con las células endoteliales no tratadas. Este protocolo describe una evaluación cuantitativa, visual y en tiempo real de la activación de las interacciones de VWF-plaqueta en modelos de trombosis y hemostasia.

Evaluar directamente el efecto de las histonas en la liberación de FvW de las células endoteliales, que expuestos BOECs confluentes y medio libre de suero que contienen PMA (control positivo), UH, HR, HK por 2 h. Hemos mostrado que HK indujo un aumento de 2 dobleces en proteína VWF (VWF:Ag) en el medio de las células endoteliales tratadas (figura 1). Curiosamente, cuando BOECs fueron estimuladas con UH y HR, hay menos VWF:Ag se detectó en el medio que en...

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Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation

En este artículo se describe un método para evaluar endotelial von Willebrand factor liberación y la plaqueta posterior capturan bajo tensión de esquileo líquido en respuesta a estímulos inflamatorios mediante un sistema de cámara en vitro flujo.

Investigación de von Willebrand Factor Fisiopatología utilizando un modelo de cámara de flujo de von Willebrand de la plaqueta Factor cadena de formación

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage ...

Research

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